Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil R&#233;gional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Universit&#233; de Bourgogne (BQR program).

Este protocolo sigue las directrices de cuidado de los animales de la Université de Bourgogne y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Bourgogne. 1. Los animales <ol><li> Utilice ratones O-IRES-tauGFP ingeniería genética disponibles en el Laboratorio Jackson. Estos ratones fueron desarrollados en el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts &#39;con el fin de analizar la orientación axón y el desarrollo del sistema olfativo 19. Por ejemplo, la línea MOR23-IRES-tauGFP, código RS 006643, lleva el nombre de la cepa B6 oficial; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; del mismo modo, la línea SR1-IRES-tauGFP, código RS 6717 lleva el nombre B6 oficial; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> En cuanto a la edad de los animales: para un mejor resultado del protocolo, utilizar animales entre 2 y 4 semanas de edad. En este grupo de edad, la disección es más fácil (huesos más blandos, más firme epitelio olfativo) y las perillas dendríticas son bigger comparar a los animales más viejos. </li></ol> 2. Preparación de electrodos y Soluciones <ol><li> Para las pipetas estimulantes: compra prepulled estimular pipetas. De lo contrario, preparar manualmente. <ol><li> El uso de una llama, doble seis 1 mm pipetas de vidrio en alrededor de 1 cm de la punta. Inserte estos seis pipetas más unas rectas 7 º en 1,5 cm tubo de aislamiento fortalecer por un ojal. </li><li> Termocontraíbles el tubo para mantener los barriles unidos juntos. Adjuntar un tubo de aislamiento adicional a la otra extremidad de los barriles. Tire de esta pipeta estimulante con un extractor de múltiples barril. </li><li> Añadir un poco de pegamento líquido blanco alrededor del ojal para fortalecer las puntas dobladas. Deje secar O / N. </li></ol></li><li> Preparar 1 o 2 litros de solución extracelular normal del timbre (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glucosa 15; pH 7.6 y 305 mOsm). Mantenga a 4 ° Chasta su uso. </li><li> Preparar solución madre intracelular (en mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanosulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, sacarosa 70; pH 7,2 (KOH) y 310 mOsm. Mantenga a 4 ° C hasta su uso. Bueno para varias semanas. </li><li> Prepare la solución intracelular de grabación con nistatina extemporáneamente (a última hora) antes de experimento. <ol><li> Pesar 3 mg de nistatina, añadir 50 l de DMSO; vórtice 20 seg después sonicar 2-3 min hasta diluido por completo. </li><li> Añadir 20 l de solución de DMSO-nistatina en 5 ml de solución madre intracelular. Vortex 20 seg, después sonicar 3 min. Mantener esta solución a 4 ° C y proteger de la luz directa, nistatina es sensible a la luz. Esta solución se puede usar durante unas pocas horas. Vuelva a colocar todos los días. </li><li> Una vez que la preparación epitelio olfativo está bajo el microscopio, tomar parte de esta solución en una jeringa de 1 ml con una punta amarilla llama alargada para rellenar los electrodos; protegerlo de la luz directa. Una vez a temperatura ambiente, la solución de nistatinano es estable; sustituir la solución en la jeringa de 1 ml cada hora o mantenerlo en hielo. </li></ol></li><li> Tire de electrodos de grabación con un extractor para obtener cuello largo y pequeña propina (~ 2 m) con una resistencia de 15 a 20 mO con la solución de nistatina interna. </li><li> Prepare la solución odorante en 0,5 M en DMSO bajo campana de humos; alícuota y mantenerse a -20 ° C hasta su uso. Diluir odorante en solución de Ringer hasta la concentración deseada. Llenar la pipeta estimulante. </li></ol> 3. Preparación de epitelio olfativo Nota: los ratones O-IRES-tauGFP expresan la tauGFP bajo el control de la O promotor. En estos ratones, todas las neuronas que expresan el OR de interés están etiquetados con las buenas prácticas agrarias. Este protocolo está adaptado para RUP expresadas en todas las zonas. Sin embargo, disecciones y grabaciones son más fáciles para las RUP expresadas en la zona dorsal. <ol><li> Anestesiar al animal mediante la inyección de una mezcla de ketamina y xilazina (150 mg / kg y 10 mg / kg de DBOpeso y, respectivamente). Decapitación puede realizarse con unas tijeras afiladas para ratones jóvenes o con una guillotina roedor adecuadamente mantenido para los ratones de más edad. <ol><li> Usando anillo tijeras de disección hacen una incisión medial longitudinal a través de la piel dorsal. Quitar la piel tirando de él aparte. Usando las tijeras, corte la mandíbula inferior en la articulación de la mandíbula. Retire los dientes frontales superiores por un corte coronal paralela a los dientes. </li><li> Haga un corte coronal de la cabeza detrás de los ojos y mantener sólo la parte anterior de la cabeza. Sumergir en solución de Ringer helada para la disección en el ámbito. </li></ol></li><li> Diseccionar bajo el ámbito de aplicación: en la parte ventral, hacer un corte longitudinal a lo largo de la mandíbula superior / los dientes. Cortar los huesos dorsales longitudinalmente, siguiendo el lado dorso-lateral de la cavidad nasal. Retire la mayoría de los huesos y el paladar; transferir el tabique y el epitelio que se le atribuye en Ringer oxigenada a TA. </li><li> Para la disección definitiva: Justo antes de comenzar la grabaciónsesión, pelar lejos el epitelio del tabique subyacente con fórceps. Separe el epitelio con pinzas y con dos 4-5 mm cortes de tijera (uso microvannas tijeras) en la parte anterior del tabique, donde la adherencia es más fuerte. <ol><li> Retirar con cuidado el órgano vomeronasal por el corte a lo largo de su conexión dorsal al epitelio septal. Transferir el epitelio a una cámara de grabación con la capa de moco hacia arriba; mantenga plana en la cámara con un arpa. </li></ol></li><li> Instalar cámara bajo un microscopio vertical equipado con óptica de fluorescencia y una cámara sensible. Visualice la preparación en la pantalla del ordenador a gran aumento a través de un 40X objetivo de inmersión en agua (apertura numérica 0,8) y una ampliación 2X o 4X adicional alcanzado por una lente de aumento. Perfundir continuamente con Ringer oxigenada a TA (1-2 ml / min). </li></ol> 4. Grabación Sesión <ol><li> Búsqueda de células fluorescentes: excitar a la preparación a 480nm para EGFP, que emite luz en el rango de 530 a 550 nm; orientar una perilla dendríticas que es visible de forma fiable en la fluorescencia y bajo campo brillante. </li><li> Llenar electrodo con solución intracelular con nistatina; eliminar las burbujas golpeando suavemente sobre el electrodo. </li><li> Inserte electrodo sobre soporte del electrodo, aplique presión positiva en la pipeta; La resistencia debe ser 15-20 mO. </li><li> Traiga electrodo cerca de la célula; una vez que la resistencia alcanza ~ 40 mO, liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa para llegar a un gigaseal. </li><li> Una vez que se alcanza el sello, configure el potencial de membrana en alrededor de -75 mV; </li><li> Una vez que se abre la celda, proceder con protocolos de estimulación, tratamientos farmacológicos. Para medir la respuesta a una sola estimulación odorante, ficha 200-500 mseg de la actividad espontánea, para estimular 500 mseg y medir la respuesta de la célula para un máximo de 10 seg 13. Para los tratamientos farmacológicos, perfundir los agentes farmacológicos enla concentración deseada 20. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Analizar las corrientes provocados por la estimulación odorante como sigue: la amplitud máxima, el tiempo de subida (tiempo necesario para alcanzar el 90% de la amplitud máxima, en mseg), la corriente total (área bajo la curva en PAS), el tiempo en el 50% (tiempo entre el inicio y el desplazamiento de la respuesta al 50% de la amplitud máxima, en mseg). <ol><li> El uso de las corrientes de pico de transducción (amplitud máxima alcanzada) a diferentes concentraciones, dibujar y ajustar una curva dosis-respuesta utilizando la ecuación de Hill: I = Imax / (1 ​​+ (K medio / C) n), donde I representa la corriente máxima IMAX la respuesta máxima a concentraciones de saturación, K1 / 2 la concentración a la que se llegó a la mitad de la respuesta máxima, C la concentración de odorante y n el coeficiente de Hill. </li></ol></li><li> Analizar las grabaciones de potencial de membrana en pinza de corriente para la despolarización máxima, la total potencial suscitó (área bajo la curva en mVsec); registro de actividad clavar espontánea durante 30 seg a 1 min grabaciones; registro de la excitabilidad través picos provocados por la inyección de corrientes (10.5 Pa). </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23:+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice.">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li><li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23.">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li><li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system.">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li><li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor.">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li><li>Lee, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes:+implications+in+olfactory+perireceptor+events.">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li><li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perireceptor+events+in+olfaction).">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li><li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons.">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+'IP(3)-odors.">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li><li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides,+insulin+and+leptin.">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li><li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons.">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

La capacidad de este protocolo para controlar correctamente las propiedades de OSN saludables depende en gran medida de la calidad de la preparación. Por lo tanto, los pasos de disección son críticos. En primer lugar, es crítico que prestar atención a la calidad (pH, osmolaridad), la oxigenación y la temperatura del medio de disección (pero no congelado enfriado con hielo). En segundo lugar, la manipulación del epitelio con herramientas de disección debe ser tan limitado como sea posible para evitar daños. Por...

Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) representan el primer paso de la percepción olfativa. Situado en el epitelio olfativo que recubre la cavidad nasal en roedores, transforman la información química de los odorantes en los potenciales de acción se ha enviado a través de su axón al cerebro. Para entender mejor los mecanismos de codificación olfativas, es necesario para caracterizar las propiedades de transducción y de membrana de OSN. Hasta hace poco, la mayoría de las técnicas utilizadas para caracterizar las propiedades de OSN mamíferos se llevaron a cabo en disociado OSN 1-4. El proceso de disociación utiliza varios (es decir, enzimas) procesos mecánicos y químicos para liberar a los OSNs de su entorno. Estos procesos provocan un bajo número de células disponibles para las grabaciones. Este número bajo puede ser aún más crítico en el caso de células GFP marcado. La disociación también elimina los locales interacciones célula a célula entre OSN y otras células del epitelio olfativo que pueden mejorar survivcol y la modulación de las propiedades OSN. Con el fin de eludir el procedimiento de disociación, una preparación intacta fue desarrollado 5. Cada OSN expresa un receptor olfativo (OR) seleccionado de una gran familia multigénica 6. Hay ~ 1000 RUP expresadas en el epitelio olfativo principal en el ratón. Debido a la gran cantidad de O en los animales de tipo salvaje, las posibilidades para grabar OSN que expresan el mismo o son muy bajas. Para superar estas limitaciones, los ratones de genes dirigidos están disponibles en el que todos OSN expresan un identificadas o están etiquetados con una proteína fluorescente 7-9. Estos OSN marcadas se usan para hacer el análisis funcional en preparaciones disociadas 7,10,11 con los inconvenientes mencionados anteriormente. Una preparación epitelio intacto 5 de ratones genéticamente etiquetados por lo tanto, evita estos problemas. Permite el seguimiento de la actividad de OSN expresando RUP definidas con precisión en un entorno tan cerca en vivo posible. Además, patch-clamp grabaciones de OSN también permiten un análisis preciso de las propiedades de membrana, vía de transducción de la farmacología, ligando / O interacciones. Todos estos temas casi no se pueden analizar usando grabaciones extracelulares. Se utilizó esta técnica para controlar las respuestas de OSN que expresan los receptores de olor SR1 y MOR23 12,13. La viabilidad de la técnica fue confirmado por otros grupos en MOR23 expresan OSN 14, así como en otras regiones ultraperiféricas que expresan neuronas 15,16. El seguimiento de una población definida de OSN puede conducir al análisis de sus propiedades en muchos contextos diferentes, tales como el desarrollo 14, el envejecimiento 17, plasticidad inducida odorante 18, y el papel de las variaciones en la secuencia del receptor de odorizantes de olor en la codificación de 15. Así, este protocolo proporciona una poderosa herramienta para controlar las propiedades funcionales de OSN definidos a nivel de la membrana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">heavy equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration table with Faraday cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500 SERIES</td>
			<td>required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFL40XW</td>
			<td>at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnifier</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-TVCAC</td>
			<td>ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filters</td>
			<td>Olympus/Chroma</td>
			<td></td>
			<td>depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">recording electrodes /system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC10 USB</td>
			<td>monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>controls the amplifier during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP225</td>
			<td>precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrode puller</td>
			<td>sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>with a FT345-B wide trough filament;&#160; to prepare recording pipets of about 2&#181;m diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td>in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recording chamber</td>
			<td>warner instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td>a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multibarrel puller</td>
			<td>MDI</td>
			<td>PMP-107-Z</td>
			<td>by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precision pressure injector&#160;</td>
			<td>Toohey Company</td>
			<td>P/N T25-1-900 Single Channel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>this precision pressure injector&#160; controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V&#160; TTLs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td>a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubings</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">solutions/perfusion/chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>gardner denver</td>
			<td>300 series</td>
			<td>a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nystatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td>mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td>intracellular/extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride di hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethylSulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47,135-6</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes-Na</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor

Analizando las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) cuando son estimuladas con ligandos específicos es fundamental para entender la base de comportamientos-olfativas impulsada y su modulación. Estas propiedades de codificación dependen en gran medida de la interacción inicial entre las moléculas de olor y el receptor olfatorio (OR) expresados ​​en las OSN. El espectro de la identidad, la especificidad y el ligando de la O expresado son críticos. La probabilidad de encontrar el ligando de la O expresado en una OSN elegido al azar dentro del epitelio es muy baja. Para hacer frente a este reto, este protocolo utiliza genéticamente ratones etiquetados que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de RUP definidos. OSNs se encuentran en un epitelio apretado y organizada que recubre la cavidad nasal, con las células vecinas influir en su maduración y función. Aquí se describe un método para aislar un epitelio olfatorio intacto y grabar a través de patch-clamp grabaciones las propiedades de OSN correoXpressing receptores de olor definidas. El protocolo permite que uno para caracterizar propiedades de la membrana OSN mientras se mantiene la influencia del tejido vecino. Análisis de los resultados de patch-clamp produce una cuantificación precisa de ligando / O interacciones, las vías de transducción y la farmacología, las propiedades de codificación OSN y de su modulación a nivel de la membrana.

El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser cortos (menos de 10 a 15 min) y preciso (es decir, para evitar daños del epitelio). La Figura 1 ilustra cómo una preparación ideal se parece a diferentes niveles de aumento. Con una ampliación baja en campo claro los diferentes tipos de células (tales como perillas de OSN, el apoyo a las células) son distinguibles (Figura 1). En el nivel de ampliación más alta, nor...

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Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K vistas.  Université de Bourgogne. Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

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