The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

全ての動物手順は、カナダ、トロントは、動物ケアのカナダの評議会によって調製実験動物の管理と使用にガイドで設定したポリシーに基づいて、大学健康ネットワークの動物実験委員会によって承認されています。人間の脊髄組織の収穫のために、承認が大学健康ネットワーク研究倫理委員会からとオンタリオ州、カナダの臓器提供を監督ライフ財団のリアム·ギフトから入手しました。 解剖緩衝液および培養培地の調製<ol><li>ラットの脊髄の単離のために、100ミリリットル解剖バッファー（1×PBS + 0.6％グルコース+ 2％ペニシリン - ストレプトマイシン）と冷蔵を準備します。人間の脊髄100mlの解剖緩衝液（1×HBSS + 0.6％グルコース+ 2％ペニシリン - ストレプトマイシン）と冷蔵を準備します。 </li><li> 37℃で100ミリリットルの無血清培地（SFM）と暖かいを準備します。 SFMを調製するために、2mMのL-グルタミンを追加し、100μgの/ mLのペニシリン - ストレプトマイシン、2％のB27とするNeurobasal培地に10％のホルモンミックス。ホルモンミックスを調製するために、1にする：0.6％グルコースを含有する1 DMEM / F12培地を、3 mMの炭酸水素ナトリウム、5mMのHEPES、25 / mlのインスリン、100μg/ mlのアポトランスフェリン、10μMのプトレシン、30 nMのセレン、および20 nMのプロゲステロン。 </li><li> EFH増殖因子に富むメッキメディアを準備し、37℃で、温かい（SFMに20 ngの/ mlのEGF、20 ngの/ mlのbFGF、および2 / mlのヘパリンを追加します）。人間EFHは、ヒト組換え成長因子を（材料の表を参照）が含まれていることを確認します。 </li></ol> 2.収穫と成体ラット脳室周囲脊髄組織の解剖<ol><li>エタノールで解剖器具を滅菌し、予め滅菌生理食塩水、またはオートクレーブ楽器ですすいでください。ラットを与える- 1の機関によると（6〜8週齢）をペントバルビタールナトリウム（65 mg / mlの時1 CC）または麻酔薬（ すなわち 、4％イソフルラン）の過剰摂取の薬物注射は、動物プロトコルを承認しました。 D70％エタノールでラットの背中をウーズと大解剖ハサミで背側表面に皮膚を削除します。 </li><li>背面に垂直なハサミを持って、横方向に後肢上記の脊柱を切りました。縦方向に棘突起を露出させるために吻側方向に脊柱を覆う背側の筋肉をカットするより小さなハサミを使用してください。 </li><li>露出された尾方端から開始して、脊髄と脊柱の間の空間に脊柱管の外側面に硬膜外鉗子や小鈍骨切断器具を挿入します。ラミナに小さな切り傷を作る（骨アーチは左椎骨の各側の棘突起の右）と慎重に脊髄（ 図1A-D）を露出する薄片を剥がします。根底にある脊髄が損傷しないように、ブレードの角度が浅いと、コードに平行であることを確認してください。 </li><li>博覧会への吻側方向に椎弓切除を続けます胸部と頸髄を電子。 </li><li>静か鈍組織鉗子で脊柱から脊髄を切除し、慎重にコードをリリースする根を切断するmicroscissorsを使用しています。 （1.1で前述）、4℃の無菌ラットの解剖緩衝液を含むペトリ皿に切除し、脊髄を置きます。バッファを解剖し、ハサミを用いて新たに調製し、4℃で組織をすすぐ横1cmのセグメント（ 図1E）に脊髄を切りました。 </li><li>組織の各セグメントについて、微細な鉗子で組織を保持するために1つの手を使用しています。もう一方の手で、慎重に解剖スコープの助けにより覆う髄膜、白質、および灰白質の大部分を除去するためにmicroscissorsを使用しています。あるいは、（デュモン＃4）上衣と周囲灰白質（ 図1F-H）の少量を含む脊髄の脳室周囲の領域のみを残し、グレーと白質の大部分をはがすために微細な鉗子を使用しています。</li><li>冷たいラット解剖緩衝液を含む10センチメートル滅菌ペトリ皿に解剖脳室周囲の組織をプール。 </li></ol> 3.成人の脳室周囲脊髄組織の収穫と解剖注：他の臓器は、臓器移植のために削除された後のヒト脊髄組織は、（ドナーが2から60歳までの年齢の範囲であった）成人臓器移植ドナーから採取されます。ライフ·プログラムのリアム·ギフトは、患者の家族から研究目的のための組織を除去するための同意を得て、我々は、大動脈のクロスクランプの2時間以内にコードを収穫することができたようにタイムリーに私たちの収穫チームに通知します。負の血清学的検査なし感染症の男性と女性の成人ドナーは受け入れられています。 <ol><li>同じ前方の露出を使用して前方アプローチを介して、手術室内の無菌様式で収穫組織はすでに臓器TRANSPによる臓器摘出のための解剖しますLANT収穫チーム。 </li><li>大きなリブスプレッダーと大血管を含む残りの組織や臓器の大きなパドルリトラクターに後退を通して前方脊柱を公開します。 </li><li>切除する脊柱の所望の長さの頭側と尾側端部の椎間板を切断するのに長い翼を搭載した胸骨鋸を使用してください。角度鋸は、約45°内側に脊柱管のすぐ停止する椎体の側面部分から三角形のトラフをカットします。 </li><li>一括硬膜を切開ないように注意しながら、湾曲オステオトームとマレットの助けを借りて、所望のセグメントの椎体の内側の面を削除します。そして、そっと歯付き鉗子で硬膜覆われた脊髄を持ち上げ、急激コードの吻側および尾側の端部を切開。左右個別の根を横断する長いはさみとピンセットを使用してください。 </li><li> 4°で脊髄の切除されたセグメントを配置します; C滅菌緩衝液（1×HBSS + 0.6％グルコース+ 2％ペニシリン - ストレプトマイシン）組織培養室への輸送のための大きな試験管内。 </li> <li> 注意：一般的に、3 -上部胸部から脊髄の6cmのセグメントおよび/ ​​または半ばから低胸部レベルが循環の停止後できるだけ早く無菌条件下で手術室で除去し、冷滅菌バッファに配置されています。循環の停止および脊髄の除去の間の経過時間は、寄付のために標的器官を採取するのに必要な時間に応じて変化し、45分〜2時間の範囲でした。心臓や肺にも削除されている場合は、解剖は、同様に下頸髄の一部を採取するためにはるかに吻側撮影することができます。 </li><li> 3時間以内、一般的に、収穫後できるだけ早く人間の脊髄組織を解剖。鉗子で硬膜およびその他の髄膜を削除します。作りたての4℃の解剖緩衝液中の脊髄組織をすすぎ、1cmのセグメントに横方向に切断しました。 </li><li>解剖スコープの助けを借りて、各組織のセグメントのために組織鉗子、細かい鉗子とmicroscissorsを使用して上に髄膜、白質および灰白質の大部分を切除。プール冷たい人間の解剖緩衝液を含む10センチメートル滅菌シャーレに、上衣と周囲灰白質の少量を含む解剖脳室周囲の組織、。 </li></ol>成体ラットおよびヒト脊髄NSPCsの4単離および培養<ol><li>層流フード内で無菌的に次の手順を実行します。 <ol><li> microscissorsで1mm 3の小片に解剖ラットまたはヒト脳室周囲の組織をミンチ。 </li><li>酵素的に物質/試薬の表に示すようにパパイン解離キットを使用して、タンパク質分解酵素を用いて細分化した組織を解離させます。注：試薬の成分は、4つのバイアルを含みます。バイアル1：アールの平衡塩溶液（EBSS）、バイアル2：パパインcontaininG Lシステイン及びEDTA、バイアル3：デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼ）、バイアル4：ウシ血清アルブミン（BSA）とオボムコイドプロテアーゼ阻害剤。 注：注 ：パパインは、タンパク質基質のための広い特異性を有するスルフヒドリルプロテアーゼです。パパインは、本明細書カリカパパイヤ植物からのラテックスから誘導され、より広範膵臓のプロテアーゼよりも、ほとんどのタンパク質基質を分解する。分離プロセスの間DNAは粘度を増加させ、困難なピペット作る解離培地中に放出させるいくつかの細胞損傷があります。したがって、DNアーゼは、インタクトな細胞を損傷することなくDNAを消化するために、細胞単離手順に含まれています。 Ovomucoids解離工程後パパイン活性を阻害するために使用されるプロテアーゼ阻害剤糖タンパク質ています。 </li></ol></li><li>最初の使用時に、EBSSの32ミリリットル（1バイアル）でアルブミンオボムコイド阻害剤混合物（バイアル4）を再構成し、次いで4℃で保存し、その後の単離のために使用します。注：これは、オボムコイド阻害剤、10mgのと1mlあたりアルブミン10mgのの有効濃度の溶液が得られます。 </li><li> 0.5 mMのEDTAを1 mMのL-システインmlのパパイン/ 20単位での溶液を得、パパインバイアル（バイアル2）にEBSSの5ミリリットル（バイアル1）を追加します。パパインを完全に酵素の完全な活性を確実にするために溶解されるまで、それ以外の場合は10分間37℃の水浴中にバイアルを配置し、完全に溶解したときにパパイン溶液が透明に表示されていることを確認してください。 </li><li> DNアーゼバイアル（バイアル3）にEBSS（バイアル1）の500μlを添加して、DNアーゼを変性せん断に敏感であるように穏やかに混合します。約20単位/ mlの最終濃度パパインおよび0.005％DNアーゼで、その結果、パパインを含むバイアルにDNase溶液250μlのを追加します。後で使用するためのDNaseバイアルのバランスを保存します。 </li><li>上記のステップ4.4で調製されたパパイン溶液中のみじん切りラットまたはヒト組織を配置します。ヒト組織分離のために、2つの間で均等に細分化した組織を分割パパインバイアル（約0.2グラム/バイアル）。 </li><li>活性化したパパイン溶液に組織を解離するためにロッカープラットフォーム上で一定に撹拌しながら37℃でインキュベートします。それぞれ0.4gの - 45 1時間に分し、細分化した組織の量に応じて1〜2時間、約0.2のためのヒトの組織のためのラット組織をインキュベートします。 </li><li>濁った細胞懸濁液を得るために残りの組織片を解離するために10mLのピ​​ペットを用いて混合物を粉砕します。室温で5分間、300×gで滅菌15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に（解離していない組織の任意の部分を含まない）の細胞懸濁液を転送します。 </li><li>オボムコイド、パパイン阻害剤を含む培地中でペレット化した細胞を再懸濁します。 <ol><li> 15ミリリットルコニカルチューブに再構成されたアルブミン - オボムコイド阻害剤溶液（バイアル4）300μlの2.7ミリリットルEBSS（バイアル1）を混合することにより、オボムコイド溶液を調製します。上記のステップ4.4で保存した（3バイアル）DNase溶液150μlのを追加します。 </li><li>からの上清を捨て、ペレット化した細胞と、すぐには希釈されたDNアーゼアルブミン阻害剤混合物中の細胞ペレットを再懸濁します。 </li></ol></li><li>シングルステップ不連続密度勾配を介して遠心分離により細胞膜から分離し、無傷の細胞。 <ol><li>の上に（ステップ4.8に記載のように調製）15mlチューブにアルブミン阻害剤溶液5ml（バイアル4）を添加し、細胞懸濁液を層優しく、ゆっくりと、5mLのピペットを使用して、不連続密度勾配を準備アルブミン阻害剤溶液。 </li><li>室温で6分間、70×gで遠心分離します。 </li><li>注：この境界での最小限の混合は、結果には影響しませんが、勾配の2つの層の間のインタフェースは、明確に表示される必要があります。膜フラグメントは、界面に留まり、解離した細胞は、チューブの底にペレット。 </li></ol></li><li>ラット細胞については、上清を廃棄し、ラットEFH培地1mlで細胞ペレットを再懸濁し（37℃で予熱しました）。血球計数器で生細胞密度をカウントし、EFHで/μlの10細胞の密度でT25培養フラスコに細胞をプレー。ラット組織からの細胞の典型的な収率は/μlの10未満の細胞密度で、所望される約80％viability.Ifクローン培養、種細胞と約2×10 6個の細胞です。 5％CO 2中37℃でフラスコをインキュベートし、文化は球の凝集を回避するために、1週間静かに成長することができます。 </li><li>ヒト細胞については、上清を廃棄し、ヒトEFH培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁し（37℃で予熱しました）。 40μmのナイロン細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過し、ミエリンの細胞膜断片を除去するためにEFH 30mlで行いました。 5分間、300×gで遠心しEFH培地1ml中の細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>血球計数器を用いて生細胞密度を計数し、総容量/ウェルで10 5細胞の密度で6ウェル培養プレートへのヒト細胞をプレート5ミリリットルのEFH /ウェル。ヒト組織からの細胞の典型的な収率は約70％の生存率で約1×10 6個の細胞です。例えば、マトリゲルなどの付着基質とのプレコートウェル（下記注参照）。 1ミリリットルSFM：40μlのマトリゲルの割合で希釈します。 </li><li> 注：あるいは、ポリ-D-リジン/ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンのような他の付着基材を使用することができます。 </li><li> 5％CO 2中37℃で培養すると、培養物は1週間静かに成長することができます。 </li></ol>成体ラットおよびヒトの脊髄NSPCsの5継代<ol><li>ラットNSPCsは、最初の播種の1週間以内に約70ミクロンの直径の小さい神経球を形成することになります。細胞懸濁液を採取5分間300×gで遠心分離し、そして機械的にニューロスフェアを解離するために、細胞ペレットを粉砕することによって毎週継代ラットNSPCs。 </li><li>新鮮なラットEFH培地を含むT25フラスコに解離細胞をシード。あるいは、継代のために、50％馴化ラット媒体を使用しています。継代でラットNSPCsの典型的な収量は、通路の数に対して指数関数的に増加し、約5×10 6個の細胞です。 </li><li>人間の文化のために、一週間最初のプレーティングした後、細胞を基板に接着することを可能にするために毎週二回、新鮮なEFHで培地の半分を交換してください。一般的に、1 - 2週間後、細胞を基板に付着した後、新鮮なEFHで週に2回培地のボリューム全体を交換してください。 </li><li> 8週間 - 4との間にコンフルエンスに達する前に継代培養細胞。 <ol><li>ウェルを37℃で約10分間インキュベート当たり酵素基質から細胞を剥離することにより継代培養細胞は、酵素の2mlの（材料の表を参照のこと）。細胞懸濁液を、5分間、300×gで遠心分離し、静かにたてEFH培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁を収集します。 </li><li>プレコ（血球計を用いて生細胞をカウントし、6ウェル培養プレートに細胞をプレー上記のようにステップ4.12）に10 5細胞/ウェルの密度で/ウェル5ミリリットルEFHの総体積でated。継代での人間NSPCsの典型的な収率は約2×10 6個の細胞であり、一般的にこれは、通路に倍になります。継代の間に週3回 - 一般的に、50％馴化EFH培地で2培養を維持します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).</li><li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain:+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells.">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+CNS+stem+cells+are+present+in+the+adult+mammalian+spinal+cord+and+ventricular+neuroaxis.">Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis.</a> J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).</li><li>Martens, D. J., Seaberg, R. 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The authors have nothing to disclose.

ラットの脊髄組織のケアの解剖時の椎弓切除を行いながら、脊髄を損傷しないように注意してください。これは、脊髄セグメントが完全であるときに脳室周囲の組織を分離する方が簡単です。組織セグメントは、完全に解剖バッファーに浸漬する必要があり、上に髄膜および白質はmicroscissorsと縦ストリップとして離れて切断することができます。また、微細な組織鉗子離れ白質を剥離するた...

NSPCsは自己更新し、容易にin vitroで拡大することができる神経系統にコミット多能性細胞です。彼らは自己複製多能性幹細胞、より制限された前駆細胞のプロパティを表示するので、我々は、神経幹/前駆細胞の混合集団として、これらの細胞を指します。 NSPCsは胎児および成人の脳と脊髄の1,2の両方で発見されています。成人では、NSPCsは通常、静止状態であり、側脳室2-4を裏打ちする脳室下帯、及び脊髄5,6の中心管の周囲の脳室周囲領域を含む特定のニッチ内に存在します。 一般的に、NSPCsは、EGFおよびbFGFを添加した無血清培地中で自由に浮遊ニューロスフェアとして、または接着性単層、幹細胞/前駆細胞集団を選択マイトジェンとして培養されます。もともとレイノルズとワイス2によって開発されたニューロスフェアアッセイは、最も一般的に培養するために使用され、神経幹細胞を展開します。それらは血清を含む成長因子を含まない培地にプレーティングされている場合NSPCsは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化、多分化を示します。培養組織は、中心管6,7の領域を含む場合には、多能、自己複製NSPCsは、成体齧歯類脊髄から単離し、培養することができます。他の地域からの細胞を生成するのではなく、成人の脊髄から生成NSPCsを使用する際の潜在的な利点は、これらの組織特異的細胞が最も密接に損傷または疾患、次の紛失または損傷した脊髄の細胞に似ているということです。 以前の研究は、成人の脊髄から派生した神経球は、長期的に伝播またはセル8,9の十分な数を生成するために、継代することができなかったことを示しました。しかし、培養条件の変更を加えて、我々は、その自己再生を実証、成人の脊髄由来NSPCsの拡大と移植を報告しましたそして多能NSPCsは臓器移植ドナー10の成人の脊髄から単離することができます。主に、解剖時の白質の大部分を除去し、成人脊髄NSPCsの増殖のために選択され、増殖因子に富む培地中で接着性基板上にこれらの細胞を培養します。このプロトコルでは、成体ラットからと人間の臓器移植ドナーからの脊髄の収穫、脳室周囲組織の切開、および分離、文化、NSPCsの拡張について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

成体ラットおよび増殖因子に富む培地中で培養したヒト脊髄神経幹/前駆細胞（NSPCs）は、自己再生、及び拡張可能な神経幹細胞の多能性の増殖を可能にします。血清条件では、これらの多能NSPCsは、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトを生成し、差別化されます。採取した組織は、酵素パパイン-EDTA溶液中で解離した後、機械的に上皮成長因子（EGF）を補充した神経基礎培地中に播種された単一細胞懸濁液を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGFを得るために、不連続密度勾配を介して分離し、分離されています）、およびヘパリン。成体ラットの脊髄NSPCsは、接着培養として成長させた自由浮動ニューロスフェアと成人の脊髄NSPCsとして培養されます。これらの条件下では、成人脊髄NSPCsは、前駆細胞のマーカーを発現し、増殖し、連続的に通過時に拡張することができます。これらの細胞は、bはできeは、様々な刺激に応答してインビトロで研究され、外因性因子は、神経幹細胞の分化を調べるために系統限定を促進するために使用することができます。多能NSPCsまたはそれらの子孫はまた、再生修復を評価するために種々の動物モデルに移植することができます。

EFH培地で懸濁培養で増殖した成体ラットの脊髄の細胞は最初のプレーティングの1週間以内の小さな神経球（未分化細胞のコロニー）を形成します。初代培養では、播種した細胞のほとんどが死んでしまうと成長因子応答性幹細胞は増殖し、EFH培地中でのために選択されます。通路3により、直径100ミクロン（ 図2A）について、多数の自由に浮遊神経球が存在することになります?...

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Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K ビュー.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

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Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

発生生物学

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

単離と大人の犬の海馬神経前駆体の拡大

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.