パスツール研究所、INSERM、アジャンス国立デRECHERCHE ANR（グラント「リンパ球」）、REVIVE今後の投資計画と「contreルがんラ·リーグ」でサポートされています。

倫理文：すべての実験は、パスツール研究所の倫理憲章に従って行わフランス農業省によって承認され、EUのガイドラインに。農業のフランスの省によって認定小齧歯類手術の訓練を受けたマニピュレータは、すべての外科的処置を行います。 注：5段階の計画手順を示す附属書表1に参照してください。 胚の1選択<ol><li> 36 C57BL / 6 CD45.2の女性、12人の女性のCD45.1、12 C57BL / 6 CD45.1の男性と12 C57BL / 6 CD45.2の男性を使用してください。いずれかの男性の遺伝子型と雌を交配すると、胚CD45.1 / 2およびCD45.1を生成する受信者の胸腺葉のソースとして使用TSPまたはCD45.2のソースとして使用。ハウス個別にすべての男性。 </li><li> E18 TSP分離のための胚を得るために、21日グラフト実験の前に、午後6時に1人の男性CD45.1とケージに2人の女性を配置します。正午前に、次の日の膣栓の存在を確認してください。 SEPA差し込ま女性を評価します。 </li><li> TSPによって植民地化されるE14胚を得るために、17日グラフト実験の前に、男性のCD45.2を使用して、（1.2）には、上記の手順を繰り返します。 </li><li> E13 TSPを単離するための胚を得るために、16日間のグラフト化実験の前に、雄C57BL / 6 CD45.1を使用して、（1.2）上記の手順を繰り返します。 </li></ol>水平層流フードの下で胚の2解剖注：グラフト実験前二日。 <ol><li>飽和密室で、少なくとも5分の間に頸部脱臼によりまたはCO 2ガスの漸進的な投与によって妊娠した雌を生け贄に捧げます。心肺運動の決定的な逮捕によって死を確認してください。 70％エタノールで腹部を濡らします。 </li><li>正中腹部の皮膚に縦切開を行い、離れて、皮膚を​​引っ張ってそれを開きます。消化管に触れることなく鉗子とハサミで腹膜を開きます。ビフィズスのuterを引き出し私たちとハサミで膣から分離。 </li><li> 40〜50ミリリットルのDPBSを含む90×15ミリメートルペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜の間に横方向に切断しました。 </li><li>先端の細いハサミや微細な鉗子で、子宮の筋肉膜を除去胎盤および卵黄嚢との間で切断して胚を取り出して、胚を保持さamniosを、削除してください。 </li><li>ペトリ皿に胚を置きHBSS + 1％ウシ胎児血清を含む90×15ミリ（FCS）。 E15よりも古い胚のために、任意のさらなる解剖前にハサミで頭部を削除します。 </li></ol>胸腺の3分離<ol><li>双眼拡大レンズの下では、湿ったガーゼ寝具に、仰臥位（腹ビュー）に横たわって、胚を配置します。 </li><li>胸部グリッドをつまんで開​​き、胸骨の軟骨に沿って長手方向に1鉗子を挿入します。湾曲鉗子で、Tを可視化するために確保胸壁を引きます気管の両側にハイミックローブ。 </li><li>慎重に微細な鉗子でつまんで下の各葉を保持し、1ミリリットルのHBSS + 1％FCSを含有するペトリ皿に置きます。ローブを分離し、カプセルに損傷を与えることなく、2 1ミリリットルのシリンジ+ 26 G⅜「針で周囲の結合組織を除去。 </li><li>血液細胞を除去するためにHBSS + 1％FCS 3mlにローブを洗います。 注：E15の前に、胸腺ローブが二肺葉臓器を構成する途中で気管以降ヒューズの両側に配置されています。 </li></ol> 4.細胞懸濁液<ol><li> HBSS + 1％FCSで1ミリリットルの注射器に取り付けられた2つの26 G針で、双眼拡大レンズの下でローブを離れていじめます。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li></ol> 5.蛍光抗体で染色し、細胞選別注：すべての抗体は、以前に集団の最適な定義を得るために滴定する（titratイオン）は、抗体のバッチで変化させることができます。 <ol><li>系統陽性細胞を染色するために、ビオチン化抗体のカクテル100μlを4℃で15〜30分間、胸腺細胞（E13またはE18）をインキュベートする（抗CD19、抗群Gr1、抗TER119、抗NK1.1 、抗CD11cの、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25）。 </li><li>離れて抗体を過剰に洗浄するために7分間280×gで4ミリリットルHBSS + 1％FCSでチューブをスピンダウンし、上清を、新鮮なHBSS + 1％FCS中に再懸濁したペレットを除去します。遠心分離を繰り返します。 </li><li> 4℃で15分間、ストレプトアビジンビーズとE18のビオチン標識された細胞をインキュベートし、HBSS、1％FCSで細胞を2回洗浄します。 2ミリリットルのHBSS + 1％FCSで細胞を再懸濁します。ほとんどのE13胸腺細胞は、系統陰性であり、従って、細胞選別の前にMACS濃縮を必要としません。 </li><li>製造業者の説明書に従って、LSカラム上で細胞を渡します。すべての細胞懸濁液が入ったとき、カラムを2mlのHBSS + 1％FCSを追加します。回復しますカラム4mlを280×gで7分間、細胞を通って流れ、遠心。 </li><li>枯渇E18またはTSP抗体ミックス（抗CD117 APC50μlの総E13の胸腺細胞、抗CD135 PE、抗CD127 PECy7、抗CD24 FITC、抗CD44 APCCy7とストレプトアビジンパシフィックブルーのいずれかのペレットを再懸濁）、暗所で4℃で20分間インキュベートします。 </li><li> 4ミリリットルHBSS + 1％FCSとで細胞を洗浄する1ミリリットルHBSS中にヨウ化プロピジウムでの+ 1％FCSに細胞を再懸濁。 </li><li>ソートのTSP林- 200μlの完全培地+ 20％FCSを含む1.5 mlチューブの上に（4レーザーで）FACSにおけるCD44 + CD117 + CD24 低 CD127 + CD135 +細胞。 FSCおよびSSCチャンネルでそれらのサイズおよび粒度に応じて第1のセルのゲート。 （ヨウ化プロピジウムで染色）死細胞、ゲートアウトダブレットを排除し、指数関数的なスケールで蛍光をスコア。 100または600の周りのTSPは、1 E13やE18 1胸腺、respectivから得ることができますエリー。 </li></ol>前駆細胞とE14胸腺ローブの6植民地：ハンギングドロップ法<ol><li> （30グレイ= 30 Gyの）CD45.2胚からE14胸腺葉、文化の前に3時間を照射します。 注：E14またはE15胸腺ローブは正常T細胞前駆細胞のレシピエントとして使用されています。以前の妊娠日目の胸腺ローブがおそらく上皮細胞の不完全な発展に、不十分ながら開発による臓器の大きいサイズに早期の壊死の後の妊娠日の結果の受信者胸腺葉を使用しました。 </li><li>遠心のTSPと再サスペンド細胞培養培地中で（10％FCSを含むOPTI-MEM完全培地、ペニシリン（50単位/ ml）、ストレプトマイシン（50μg/ ml）および2βメルカプトエタノール（50μM））をソートし、その結果35 μlの500 TSPが含まれています。 </li><li> 60ウェルテラサキプレートの他のすべてのウェルの細胞懸濁液の35μlのドロップを置きます。 注：これらは連続したウェルに入れている場合は35μlの滴が融合することができます。 </li><li>各液滴の表面に1照射ローブを配置します。テラサキプレートを閉じて、細胞が重力によって落下の頂端極に到達できるように逆さまにプレートを回します。 </li><li>ドロップの頂端縁にスライドするようにローブを強制的に穏やかに反転板の上側を押してください。 37℃+ 5％CO 2で48時間、加湿インキュベーターで反転テラサキプレートをインキュベートします。植民地化した後、培養E14 FTOC 7で胸腺、または受信者の成体マウス8の腎臓被膜下に移植片のいずれか。 </li></ol> 7.胎児胸腺器官培養<ol><li> 35ミリメートルペトリ皿の上に完全培地の3ミリリットルを置きます。媒体上に浮上isopore膜フィルターを置きます。鉗子（1膜上を超えない8ローブ）を有する膜の端に再構成されたローブを配置します。 </li><li>ウォートの2ミリリットルを含む、カバーなし、35mm皿と一緒に、90ミリメートルのペトリ皿の内側に胸腺葉を含むペトリ皿を置きます最適な湿度を確保するために、R。 37℃+ 5％CO 2で12日間インキュベートします。 </li></ol>無菌条件下での腎臓被膜下移植片8 注：腎実質はカプセルを形成する結合組織に囲まれています。サブ莢領域は、血液、それによって移植片の開発に適した環境（ 例えば胸腺葉、膵島または新生児の心）を提供するリンパ管において特に豊富です。それは右腎よりもアクセス可能であるため、移植片は、通常、左の腎臓で行われています。 CD3 - / -雄マウスはE15の前にセックス決意を容易に行われないため、受信者は、このように起因するY染色体にリンクされているマイナー組織適合性抗原に対する宿主反応、移植片対を回避として使用しました。 <ol><li>楽器を殺菌し、手術に沿って滅菌手袋を着用してください。ケタミン10 mg / mlのキシラジン+ 1ミリグラム/溶液の腹腔内注射によりマウスを麻酔mlをPBS中に希釈した（体重10gあたり50〜100μl）を、1mlシリンジを使用して。すだれ状反射の欠如をチェックすることによって麻酔を確認してください。麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目にハイドロOptimuneゲルのドロップを置きます。 注：ソリューションは、即座に調製し、注射前に室温で温めする必要があります。麻酔は、少なくとも20分間持続します。麻酔の程度は、すべての手術に沿って制御されるべきです。麻酔は、20分毎に半分の用量の腹腔内注射することにより延長することができます。 </li><li>水平ラミナフローフード下で、その右側にマウスを置きます。 70％エタノールおよび10％ヨウ化真皮溶液で手術領域を滅菌します。鉗子部とだけ後肢の関節上記2cmの長さに沿ってマウスの毛。手術領域を剃ります。 </li><li>メスで、最初の切開1.5センチメートル長を行い、皮膚組織は、その後はさみで筋肉組織を切断します。切開の両側にわずかな圧力を適用します、腹腔から腎臓を強制れます。 </li><li>湿った腎臓を維持するために綿芽で生理食塩水を適用します。あなたは臓器を露出させることは困難である場合は、腎臓が接続されている周囲の脂肪細胞組織を引き出すために平らなピンセットを使用しています。臓器の下に配置された綿棒により後腹膜腔から腎臓を維持します。 </li><li> 2細かい鉗子で、カプセル2-3ミリの穴を作る（出血を防ぐために実質を触れないように注意してください）​​。全体の外科的処置の間に連続的に湿らせた露出された腎臓カプセルを保持します。 </li><li>開かれたカプセルの壁を維持することによって、腎臓被膜下に慎重ローブを挿入し、エッジの極に向かって被膜下移植片をスライドさせます。腎臓あたり6ローブまで置きます。 </li><li>レトロ腹腔内に腎臓を交換してください。筋腱膜、個々の外科医の結び目と、その後皮膚を縫合。 10％ヨウ化ポビドン溶液で傷を濡らします。加熱されたPAの上にマウスを置きます37℃でD。 </li><li>心臓、呼吸器およびウィスカの動きの制御により、麻酔から完全に回復するまで、移植マウスを調査、自己から見た完全に回復するまでの粘膜の色が動きを含んでいました。 注：私達はちょうど手術後の痛みを防止するために、手術後の手術と2日後に鎮痛剤溶液（Buprenorphin、0.1ミリグラム/ kg）を筋肉内注射することをお勧めします。 </li><li>完全に回復するまで、単独で動作する動物を保管してください。確認し、感染を防止するために、一日おきに、創傷のステッチを点検します。この手順に従って、創傷感染を観察することはありません。 注：CD3から末梢血細胞の週刊分析- / -グラフトされたマウスは、私たちが由来集団はCD45アロタイプマーカーおよびT細胞系列特異的抗体（ 図3）を使用して、E13やE18前駆細胞のいずれか由来の胸腺を検出することを可能にします。 </li></ol>フローサイトメトリーによるTSPの子孫の9分析<ol><lI&gt;（プロトコルセクション4を参照）単一細胞懸濁液を得るために、個別にFTOCsをいじめます。 </li><li> CD45.1 PECy7、CD45.2 AmCyan、CD4 APCCy7、CD8 APC、CD3パシフィックブルー、Vγ5FITC、Vδ1PEとセクション5で説明したようにインキュベートを認識する抗体を含む抗体混合物と個々のローブからステイン細胞懸濁液。 </li><li>再懸 ​​濁（ 図2の結果を参照してください）HBSS + 1％FCS +ヨウ化プロピジウムで細胞を、フローサイトメーターで分析します。 </li></ol>

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C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus:+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation.">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li><li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic,+context-dependent,+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments.">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li><li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Flt3++lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment.">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. 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P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T/NK+progenitor+in+murine+fetal+liver.">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li><li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene.">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

二つの主なアッセイは、ex vivoでのT細胞分化を分析するために使用することができます。最も最近報告Noth1、1または4〜12のようなデルタのリガンドを発現し、OP9 BMストローマ細胞と造血前駆細胞の共培養である。この2-Dアッセイは、実施が容易で、非常に効率的で敏感であり、可能分析で単一細胞レベル。しかし、いずれも、胸腺上皮との直接的な相互作用を必要とし、どちら...

Tリンパ球は、αβまたはγδT細胞受容体（TCR）を有する、特殊な器官における胸腺を区別する。十分に発達した胸腺は、2つの異なる領域で構成されています。生産性のTCRβおよびα鎖遺伝子を再配置胸腺細胞がプログラム死（正の選択として知られるプロセス）から救出された胸腺前駆細胞の開発皮質、および;自己リガンドに強すぎる反応性を有する胸腺細胞を選択した髄質は、（負の選択）1,2削除されます。胸腺は、後に間葉細胞3に囲まれている第三の咽頭嚢の内胚葉層に由来します。これは、胎生E12から始まる造血前駆細胞が定着され、その後、連続的な動員は、通常のT細胞の発生4に必要とされます。胸腺の移民が開始され、厳密に調節されたプログラムによって編成、連続した発達段階を経て進化し、舞そのリガンドとの相互作用時に胸腺細胞のNotchシグナル伝達経路の活性化によってntained、4のようなデルタ、胸腺上皮細胞（のTEC）上に発現5。 胸腺細胞の開発は、いわゆるCD4で始まる- CD8 -ダ ​​ブルネガティブ（DN）の段階。 、DN2（CD25 + CD44 +）、DN3（CD25 + CD44 - ）とDN4（CD25 - CD44 - ） - DN胸腺細胞は、さらにDN1（CD44 + CD25）へのCD25およびCD44の発現に応じて分割することができます。 CD24（HSA）およびCD117（c-キット）をさらにDN1aとbが早期胸腺前駆細胞（ETP）に対応する5サブセットにDN1区画を細分化。胸腺細胞は、DN段階でのTcRδ、βおよびα鎖の配置を変更し、前のTCR選択（DN3-DN4ステージを）受けます。のTCRα鎖は、正と負のSELEの前に並べ替えて、CD4 + CD8 +ダブルポジティブ（DP）区画への彼らは、さらにトランジットction。この段階では、ほとんどの胸腺細胞は排除され、わずかな割合（3〜5％）は、CD4 +またはCD8 + T細胞コンパートメント成熟到達します。 リンパ分化経路は、多能前駆細胞（MPP）と赤血球と巨核球6の可能性を失ったリンパプライミング多能性前駆細胞（LMPP）を生成するHSCの段階を経て進行します。 （C-キット（CD117）の発現、SCA-1とのFlt3 / Flk2は（CD135）およびインターロイキンの検出可能なレベルの不在- LMPPは、表現型（林は、系統が負）分化した血液細胞マーカーの不在によって定義されていますIL）-7受容体α鎖（IL-7RαまたはCD127）。 LMPPsはさらにその段階によって、骨髄細胞を生成する能力を失っていることを共通のリンパ系前駆細胞（CLP）7へと分化します。 CLPは、リンパ球（B細胞およびT細胞）、NK細胞、DCおよび先天性リンパ系細胞（ILC）の可能性を保持し、CD1の発現によりLMPP異なります27とSCA-1の高レベルの不在。 前駆細胞を沈降胸腺（TSP）の性質は広範囲に8を議論されてきたが、それは開発9を通じて、TSP変更表現型、分化能および機能ことが最近明らかになりました。我々は、E13（第一波）またはE18（第2波）のいずれかからFACS選別細胞による孤立し、TSPを特徴づけるために、in vitroおよびin vivoアッセイを行いました。異なるアロタイプマーカーを有するE13とE18前駆細胞の同数の植民地照射胸腺葉を持つ胎児胸腺器官培養（FTOC）は、同様の発達の環境でそれらの子孫以下の許可および前駆細胞の両方のタイプの間で異なる細胞固有の特性を明らかにしました。 E13やE18 TSPのいずれかによって植民地化胸腺ローブが原因で両方の前駆体との間の競合に選択せずに開発を可能にした。コロニー形成胸腺葉のインビボ移植、さらにまた、Tことが示されました彼は、 インビボで異なる生物学的特性を有するE13とE18 TSPの子孫を成熟します。最初の波からのTSPは、急速にT細胞を生成するが、αβおよびγδT細胞の数が少ないを生じさせます。後者の中、私たちは不変TCRは、それらは創傷治癒における機能を発揮し、唯一の胚発生の10の間に生成され、表皮に移行していVγ5Vδ1樹状上皮T細胞（DETC）を検出しました。対照的に、第二波のTSPは、TCR + T細胞の高い数を生成するために時間がかかり、DETCを生成することができません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.</td>
			<td>TPP</td>
			<td>T93100/T9340</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td>Cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.36</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodide Povidone 10% (Betadine)&#160;</td>
			<td>MEDA Pharma</td>
			<td>314997.8</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 100mg/ml (stock solution)</td>
			<td>MERIAL</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td>Anesthesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution</td>
			<td>AXIENCE</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Morphinic analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>14040-174</td>
			<td>to isolate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS Hanks&#39; Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>24020-091</td>
			<td>to wash out the blood and dissect the embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>51985-026</td>
			<td>Medium for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Calf serum</td>
			<td>EUROBIO</td>
			<td>CVFSVF00-0U</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>Antibiotics for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 b mercapto ethanol</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>31350010</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6 10445111</td>
			<td>Occular W-Pl10x/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold lamp source</td>
			<td>SCHOTT VWR</td>
			<td>KL1500 compact</td>
			<td>Two goose neck fibers adapted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Dissecting Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoon, round and perforated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pairs of fine straight watchmakers&#8217; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-20</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamid thread with needle 6-0&#160;&#160; C-3 3/8c</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>F2403</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-holder</td>
			<td>MORIA/F.S.T.</td>
			<td>12060-02</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100229-100</td>
			<td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Isopore RTTPO2500</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>44210</td>
			<td>For FTOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki 60 wells plates</td>
			<td>FISHER</td>
			<td>1x270 10318801</td>
			<td>For hanging drop technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm</td>
			<td>Hydrex</td>
			<td>11522</td>
			<td>To apply disinfecting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td>
			<td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&#160;</td>
			<td>Clone Number see table below</td>
			<td>Staining cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401/130-048-101</td>
			<td>Cell depletion&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&#160; (CD45.2)</td>
			<td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td>
			<td>Source of cells and thymic lobes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>CDTA Orl&#233;ans, France</td>
			<td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td>
			<td>&#160;Grafting experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

胸腺沈降前駆細胞を特徴づけることはリンパ球減少患者におけるT細胞の交換のための戦略を考案することが不可欠、T細胞の発達の前胸腺の段階を理解することが重要です。我々は、in vitroおよびin vivo技術 、「ハンギングドロップ」法に基づいて、両方の中の相補的な2によってマウス胚13日目と18胸腺から前駆細胞を沈降胸腺を検討しました。この方法は、その子孫以下こうしてCD45アロタイプマーカーとで区別E13および/またはE18胸腺前駆細胞を照射した胎児胸腺葉に定着させました。混合集団との植民地は、人口のいずれかでのコロニー形成が可能で競争力のある選択圧を除去しながら、前駆細胞の生物学的性質の細胞自律的な差異を分析することができます。植民地化胸腺葉はまた、Tの人口動態などのin vivoでの成熟T細胞子孫の分析可能にする免疫不全の雄レシピエントマウスに移植することができます彼異なる組織や器官の末梢免疫系と植民地化。胎児胸腺器官培養物を、E13前駆細胞はすべてに急速に発展し、CD3 +細胞に成熟することを明らかにした樹状上皮T細胞として知られている標準的なγδのT細胞サブセット、を生じました。対照的に、E18の前駆細胞は分化遅延を有し、樹状上皮T細胞を生成することができませんでした。 / - -胸腺移植されたCD3の末梢血のモニタリングマウスはさらにE18の胸腺沈降前駆細胞は、時間の経過とともに、短期的胎児胸腺に理解することができなかった機能をそのE13の対応よりも成熟T細胞のより大きな数を生成することを示しました器官培養。

コロニー形成前駆細胞の最良の開発を可能にする内因性胸腺細胞の胸腺葉を枯渇させる方法を選択するために、我々は、照射後にコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルまたは5日間のデオキシグアノシン（D-Guaの）治療を比較しました。結果は、照射後のT細胞の発生を得るために、D-Guaの治療よりも適切であり、培養の9日目に差がないが、照射されたローブがこのように12日目に、...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K ビュー.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

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Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

発生生物学

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.