The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

すべてのマウス操作や処理手順は、地元の動物管理委員会が議会および/または動物のケアプログラムで記載され、承認ルールに従う必要があります。このプロトコルに記載されている全ての方法は、ローカルの動物管理委員会の承認を得て、動物ケアに関するカナダ評議会のガイドラインに従って実施しました。 注意：放射能を持つすべての作業は（を含む、放射性動物組織、寝具廃棄物の取り扱い、トリチウムの取り扱い、外部γ線照射に限定されない）立法府および/または放射線防護当局が定める規則に準拠する必要がありますし、許可することにより行うことが認定実験室および/または施設内の職員。 1.動物作業<ol><li>動物のグループ化<ol><li>マウスは、外部組織から到着している場合は、動物施設で少なくとも10日間のために動物を慣らします。研究では、複数の治療群が含まれている場合は、動物の供給者がアルを送信できることを確認してください単一のバッチとしてL動物。 </li><li>無作為に群当たり10匹のマウスの処置群にマウスを割り当てます。 C57BL / 6系統の雄マウスを使用している場合は、攻撃性の問題を軽減するために、それらの施設に非常に若いC57BL / 6雄のランダム化を事前に手配した動物のサプライヤーを持っています。 </li></ol></li><li>内部β-放射線にマウスの慢性暴露<ol><li> HTOとOBT（トリチウム化プロリン、アラニンおよびグリシンのアミノ酸の混合物）ソリューションの元の株式を希釈することにより、マウスの飲料水にトリチウム（10 kBq / Lと1 MBqで/ L）の作業濃度を準備します。 </li><li>液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定することによって、飲料水中のトリチウムの最終濃度を検証します。必要に応じて、濃度を調整します。 </li><li>トリチウム水へのアクセスを自由に提供することで、一ヶ月のために動物を扱います。処理水は、2週間の期間中に少なくなった場合は、より多くの水を追加します。それ以外の場合は、2週間後にボトルを変更します。 </li><li>偽照射コントロールを扱いますマウス全く同じ。独立した「クリーン」ルームまたは空気からトリチウムクロスコンタミネーションを避けるために正の空気圧の下に別個の「クリーン」なラックに保管してください。 </li></ol></li><li>外部γ線にマウスの慢性暴露 注：γ線照射施設/設備の場所によって異なります。 </li><li>線量測定の利用可能な方法を使用して、所望の線量率を生成する放射フィールドを持つγ線源からの距離を決定します。動物ケージをカバーする領域内の放射線場の均一性を確認してください。 注：1.7μGy/ hが1 MBqで/体におけるLトリチウムによって生成される線量率に相当します。 </li><li> 1ヶ月のステップ1.3.1で決定した距離で、マウスのケージを配置することによって、マウスを公開します。 30分にγ線照射の毎日の中断を最小限に抑えます。総吸収線量を測定するための熱ルミネッセンス線量計を使用してください。 </li></ol> 2.犠牲とサンプリング<oL&gt; <li>挿入された70ミクロンの細胞ストレーナー、15ミリリットル、1.5 mlチューブに無菌手術器具、60ミリメートルペトリ皿を準備し、すべての生物学的安全キャビネット内で、5％ウシ胎児血清（FBS）と場所を添加したRPMI培地。仕事の無菌性を確保することが重要です。 </li><li>各60ミリメートルペトリ皿にRPMI培地の5ミリリットルを分注します。 </li><li>地元の動物管理委員会により承認された方法を用いてマウスを生け贄に捧げます。頸椎脱臼は、このプロトコルで説明脾作業のために良い選択です。 （mFISH、サイトカラシンブロック小核または他の一般的なgenetoxicityアッセイのために、例えば、）他のアッセイのための血液サンプルが必要な場合は、イソフルランで麻酔した後、心臓内穿刺を使用しています。 </li><li>頭があなたから離れて指しで、背側横臥位で動物を置きます。 70％エタノールでマウスを下にスプレーしてください。鉗子を使用して、尿道口に前方の皮膚をつかむと、会陰部でハサミで小さな切開を行います。 <oL&gt; <li>この切開部から、唯一の下の筋肉壁を皮膚をカットしないように注意しながら、胸腔への腹側正中線に沿って切断。離れて正中線から皮膚を解剖。 </li><li>ピンセットで腹壁をつかみ、腹腔を開く筋肉壁の中央軸に沿って切断。 </li></ol></li><li>軽く滅菌ピンセットでそれを掴み、ゆっくりと同時ハサミで結合組織を切除しながら、それを引っ張ることによって、脾臓を切除。 </li><li> 1.5mlチューブ中の脾臓（脾臓の約1/10）と場所の小片をカット。スナップは、補助アッセイのために-80℃でその後の保存のために液体窒素中で凍結します。 </li><li>前分配RPMI培地5mlで60ミリメートルシャーレ内の細胞ストレーナーに脾臓の残りの部分を配置します。 </li><li>次のマウスに進みます。 注：マウスの​​残りの部分はsacrificいる間抽出脾臓（最大2時間）、メディア、60 mmディッシュに保つことができますエド。 5〜15匹のマウスの間で、参加する人の数に応じて、一日で処理することができます。 </li></ol>脾細胞培養物の調製<ol><li>湾曲した端部に滅菌ピンセットを用いて細胞ストレーナーの内部に細かく刻むことによって脾臓を均質化。 </li><li>セルストレーナーを取り外し、15ミリリットルチューブに60ミリメートル皿から濾過した細胞懸濁液を収集します。 </li><li>残りの細胞を収集するために、メディアの5mlでセルストレーナーを洗浄します。 </li><li> RTで5分間、300×gで遠心分離管。 </li><li>上清をデカントし、RPMI 10ml中のペレットを再懸濁します。 </li><li> RTで5分間、300×gで遠心分離管。 </li><li>上清をデカントし、RPMI 5ml中のペレットを再懸濁します。 </li><li>転送4 25ミリリットルの組織培養フラスコに細胞懸濁液1ml及びCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2、湿度80％）に移します</li></ol> 4.挑戦照射と定着<ol><li>転送4℃で5分間、300×gで氷と遠心分離機に1.5mlチューブにステップ3.8から1mlの細胞懸濁液を、残りの。このサンプルで測定DNA損傷は、DNA修復曲線の構築のために両方の治療誘発性損傷及びt = 0のデータポイントを表します。 </li><li>慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。ゆっくりTBS緩衝液（20mMトリスpH7.4中、150mMのNaCl、2.7ミリモルのKCl）1ml中にペレットを再懸濁します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。 TBS300μlの中に静かに再懸濁ペレット。 </li><li>低速でボルテックスで混合しながら、-20℃の100％エタノール700μlを添加します。ふたを閉めて混合するために数回転倒。 </li><li> -20℃でサンプルを保管してください。エタノールで固定した脾細胞は、γH2AXシグナルにおける顕著損失なしに少なくとも12ヶ月間、-20℃で保存することができます。 </li><li>挑戦的なγ-RADでステップ3.8からの脾臓細胞培養を照射<html>利用可能な照射装置を用いて線量率≥200 MGY /分で2 Gyでのiation用量。 注：この照射の目的は、修復機構に挑戦するDNA DSBを誘導することです。 X線は、この目的に使用することもできます。 </li><li>すぐにCO 2インキュベーターに文化を返します。 </li><li>挑戦2 Gyの照射後1時間、生物学的安全キャビネットにインキュベーターから培養液を除去します。代表的なサンプルのアリコートを収集するには、静かに氷上で1.5mlチューブに分注し、細胞懸濁液の転送1ミリリットルを用いて細胞を再懸濁します。 CO 2インキュベーターに細胞培養物を返します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。ゆっくりTBS 1mlのペレットを再懸濁します。 </li><li> 4.5 - 繰り返して、4.3を繰り返します。 </li><li> 24時間挑戦2 Gyでのγ線照射、収穫後、ステップ4.8で説明したように24時間サンプル=に固定 - 4.10。 </li></ol>TLE &quot;&gt; 5。抗γH2AX抗体による免疫蛍光ラベリング注意：一般的に、15 - 1日30サンプルは免疫蛍光標識し、単一の実行で、フローサイトメトリーによりアッセイすることができます。治療群間の正確な比較を確保するために、各群からのサンプル（複数可）を含みます。詳細については、16を参照も参照してください。 <ol><li>処理されるサンプルの数のための管の標識されたセットを用意し、氷上に置きます。 12×75ミリメートルキャップされていないガラス管を使用してください。無菌性は、この作業は必要ありません。 （「第2抗体のみ」）のみの二次抗体で標識するために一つの追加の歴史的対照サンプルを含めます。研究内で実行すべてのフローサイトメトリーでは、この歴史的なコントロールサンプルを使用してください。 </li><li>各チューブに氷冷TBSの0.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 5秒間-20℃、渦から固定脾細胞を除去し、TBSで準備されたチューブに0.5ミリリットルのアリコートを転送します。 -20℃の保存に戻すサンプルの残りを置き、バックアップサンプルとして保持します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離脾細胞。上清を除去し、穏やかに、1％FBSを含む氷冷TBS 1ml中にペレットを再懸濁</li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。上清を除去し、穏やかTST緩衝液1ml中に再懸濁ペレット（0.05％トリトンX-100、TBS中2％FBS）。氷上で20分間インキュベートします。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。上清を除去し、穏やかに1希釈した一次抗γH2AX抗体200μlにペレットを再懸濁：TST緩衝液中で150。 「第2のAbのみ」対照試料のためのTSTの200μLを使用してください。 </li><li> 45°の角度で回転シェーカー上の位置チューブ - 60°、室温で300×gで1.5時間振盪します。 </li><li> TSTバッファー中で200倍希釈チューブをインキュベートしている間、1にアレクサ488結合ヤギ抗マウス二次抗体の十分な容量（200μL/サンプル）を準備します。 注：アレクサ488を含むすべての仕事コンジュゲート抗体は、（以下5.16に5.10ステップ）薄暗い光の条件下で行われるべきであるとラベルされたサンプルは、アルミホイルで管を包むことにより、光から保護されるべきです。 </li><li> 1.5時間のインキュベーションが完了した後、4℃で5分間、300×gで遠心分離し、各チューブに2％FBSを含有する氷冷TBSを1ml加えます。 2％のFBSを含むTBS 1ml中にペレットを再懸濁優しく上清を除去し。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、穏やかにステップ5.8からの二次抗体溶液の200μl中に再サスペンドペレット。 </li><li>ステップ5.7のように1時間振とうプラットフォーム上でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 1％FBSを含む氷冷TBSの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、静かに氷冷TBS 1ml中にペレットを再懸濁します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、穏やかに、50μg/ mlのを含むTBS 0.5 ml中にペレットを再懸濁ヨウ化プロピジウム。 </li><li>光から保護し、室温で5分間インキュベートします。 </li><li>楽器固有のプロトコル16を使用して、フローサイトメーターでサンプルを分析します。サンプルあたり少なくとも10,000個の細胞を読みます。 </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

本稿で提示プロトコルは、電離放射線を含む様々な化学的および物理的因子、低レベルの遺伝毒性を調べるin vivo試験で大規模なマウスを実施するのに有用です。私たちのGammaBeam 150照射を装備ユニークな特定病原体を含まない動物施設と30メートル長い照射ホールマウスの数百または数千もの低いまたは非常に低い線量率照射を伴う生涯研究を行うことができます。慢性的な低線量照射...

広島·長崎原爆のと（マスメディアによって悪化）まれな原子力発電所事故の画像によって駆動、低または放射線と放射線の国民の恐怖をイオン化、非常に低用量のいずれかの潜在的な有害な影響を超える有意な論争は、非常につながっています厳格な放射線防護規制および潜在的に科学的に正当化されない規格。過去30年では、多くの報告は、有害性の欠如と低線量放射線1-4により誘発される潜在的に有益な生物学的効果の存在の両方を文書化しています。主要な放射線健康リスク因子は、放射線の高または中用量を受けた原爆被爆者の疫学的研究に基づいて推定、癌の確率です。 （そのように線形無閾値またはLNTモデルと呼ばない）、これらのデータの線形外挿は、低用量で癌のリスクを推定するために使用されます。しかし、このアプローチは、世界中の科学的受け入れを受信して​​いません重く5を議論されています。 これは、より多くの研究がこの問題を明確にし、おそらく放射線防護基準を改善するために必要とされることは明らかです。このような研究は、DNA損傷率、DNA修復と突然変異誘発など、そのようなエンドポイント（ヒトへの影響を推定するための最良の） インビボ動物モデルにおける慢性治療（環境および職業暴露の最良の近似）を関与させるべきです。これは、DNAが変異誘発および癌開発6につながる可能性が放射線の影響と不完全または誤修復を損傷するための主要な標的であることが知られています。 DNA二重鎖切断（DSB）は、DNA損傷の最も有害なタイプの一つであり、細胞死および腫瘍形成7につながる可能性があります。これは、確実かつ正確に、低線量放射線及び/又は化学的汚染物質のような他のストレスへの曝露後のDSBのレベルを測定できるようにすることが重要です。最も高感度で特異的なマーカーの一つDNA DSBのγH2AX8と呼ばれる、リン酸化ヒストンH2AXで、まだ他のマーカーおよび方法は、9,10を提案されています。これは、誘導されたDSBの近傍におけるH2AX分子の数千が、抗γH2AX抗体および蛍光顕微鏡11で免疫標識することによって、個々のDSBの検出を可能にするγH2AXの形成に関与していると推定されます。反応は30分〜60をその最大値に達し、非常に迅速です。証拠は、γH2AXは切断の部位への他の修復因子を誘引することによって、壊れたDNA末端を固定し、（12に概説）他の修復タンパク質のためのアクセスを提供するために、クロマチン構造を修飾することによってDNA DSBの修復を促進することが存在します。 DNA DSBの修復が完了すると、γH2AXは、リン酸化脱および/ ​​または分解を受け、新たに合成されたH2AX分子はクロマチン10の影響を受けた地域でγH2AXを交換します。 γH2AXの形成と損失をすることができます監視、したがって、DNA DSB修復速度の正確な推定値を提供します。このアプローチは、放射線感受性13-15と相関することが示されている放射線と速度と残留DSBレベルの高用量を照射し、様々なヒト腫瘍細胞株におけるDSBの修復を研究するために使用されてきました。 我々は、この実験的なアプローチを変更し、DNA DSBレベルの慢性γ-及びβ線照射の低用量の効果を調べると（図1）を修復するために、in vivoでのマウスの研究に適用しました。まず、我々は、飲料水に溶解トリチウム水（HTO）、または有機的に結合したトリチウム（OBT）の形でトリチウム（水素-3）で放出されたいずれかの放射線をβにマウスの長期慢性暴露を実行するための方法を実証します。二つの形式は、蓄積および/または体内の異なる配布、したがって、異なる生物学的効果をもたらすことが期待されます。両方の形態は、原子力産業における潜在的な危険です。この処理それらの相対的な生物学的な有効性の評価のために重要である2つの放射タイプの正しい比較を可能にするための等価線量率でγ線への慢性暴露によって並列されています。ベータ放射線は、γ線照射、高エネルギー光子から、それは非常に異なる作り、電子から構成されています。これにより差に、Β-放射線は、主に内部の健康被害を表し、γ線と比較して異なる生物学的効果を生じることがあります。この合併症は、HTOによって放出されるβ-放射線への暴露の規制に重要な論争をもたらしました。このように、公共のために飲料水中のHTOの規制レベルはヨーロッパで100ベクレル/ Lからオーストラリアの75,000ベクレル/ Lに変化します。これは、γ線の等価線量にHTOの生物学的効果を比較することが重要です。第二に、DNA DSBの速度が検出免疫蛍光標識したγH2AXを用いた慢性露出の完了時に分離された脾臓細胞で測定されますフローサイトメトリーによってエド。これは、in vivoでの暴露によって与えDNA損傷の程度を評価することができます。しかし、このような低レベルの曝露がDNA DSBの任意の検出率を生成しない可能性があることを期待するのは賢明です。代わりに、いくつかの隠れた変更/応答は、DNA損傷を修復する細胞の能力に影響を与えることが期待されてもよいです。これらの変化は、見つかった場合、（有害な効果を生じる）刺激（有益な効果を生成する）または阻害のいずれであってもよいです。提案されたプロトコルは、被害のかなりの量を生成する放射線の高用量で抽出した脾細胞をチャレンジすることにより、このような変化を明らかにすることができます（ 例えば 、2 Gyで約50細胞あたりのDNA DSBまたは3生産- 。総γH2AXレベルの5倍の増加を） 。その後、γH2AXの形成および消失は、DSB修復の開始及び終了を反映し、フローサイトメトリーによりモニターされます。このように、基礎およびDNA DSBの治療によって誘導されるレベルではないだけを測定することができるが、また、はるかに高いストレッサーレベルによって誘発されるDNA損傷に応答して修復する細胞の能力に対する潜在的影響。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

低線量放射線被曝は、高い放射線量によって生じる効果の量と質が異なる種々の生物学的効果を生成することができます。適切かつ科学的に正当な方法で、環境職業と公衆衛生の安全性に関連した質問に対処することは頻繁に正確に、放射線や化学物質をイオン化するような低線量の汚染物質の生物学的効果を測定する能力に依存しています。 DNA損傷と修復は、癌などのそれらの潜在的な長期的結果に起因する健康リスクの最も重要な初期の指標です。ここでは、マウス脾臓細胞におけるDNA損傷と修復のγ-及びβ-低線量の放射線に、インビボの曝露の慢性の効果を研究するためのプロトコルについて説明します。 DNA二本鎖切断、γH2AX呼ばれるリン酸化ヒストンH2AXの一般に受け入れられて、マーカーを使用して、我々は、DNA損傷のレベルだけでなく、評価することができる方法を示すだけでなく、変化しますDNA修復能に潜在的に生体内のエクスポージャーにおける低用量によって生成さ。フローサイトメトリーは、多数のサンプル中の免疫蛍光標識されたγH2AXの、高速で正確かつ信頼性の高い測定を可能にします。 DNA二本鎖切断修復DNAの十分な数の修復を誘発するために破壊生成するために2 Gyでの挑戦的な線量に抽出した脾細胞を曝露することによっておよび誘導を測定することによって評価することができる（1時間の照射後）および残留DNA損傷（24時間照射後）。残存DNA損傷は不完全修復と長期ゲノム不安定性と癌のリスクの指標となるであろう。容易にインビボ研究（ 例えば 、染色体異常、骨髄網状赤血球における小核頻度、遺伝子発現など） に 、このような測定することができる他のアッセイとエンドポイントと組み合わせることで、このアプローチは、生物学的効果の正確なコンテキストを評価することができの低レベルのストレス要因。

図2は、脾臓細胞に期待されるフローサイトメトリーのグラフの例がここに記載された方法を用いて調製を示しています。細胞を、最初に&lt;電子ボリューム·側方散乱&gt;散布図に基づいてゲートされる（ 図2Aおよび2D、電子ボリュームは、前方散乱に相当します）。 FL3 /プロピジウムヨウ素ヒストグラム（ 図2Bおよび2E）は、通?...

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Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K ビュー.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

ビデオ: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

生物学

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</em&gt;、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

実行するには非常に再現性と簡単な方法<em&gt;インビボ</emアイ開口後のマウスにおける&gt;眼摘出

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.