The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Not: Bu protokol için damlacıkları mevcut ticari damlacık makinesi 23,29 oluşturulabilir gibi mikroakışkan cihaz imalatı, Bu deney için gerekli değildir. 1. Damlacık oluşturan mikroakışkan Aygıt olun <ol><li> SU-8 Master Fabrikasyon protokolü ile kanallar için ana kalıp hazırlayın önce 31 özetlenen, ama bir damlacık jeneratör maske deseni 32. </li><li> Yumuşak litografi 32,33 tekniklerini kullanarak PDMS cihazları imal. </li></ol> 2. Dökme Damlacık Göstergesi için reaksiyon Mix hazırlayın Not: protokol amplifikasyon reaksiyonlarında pek çok türleri kullanılarak nükleik asitleri ölçmek için kullanılabilir. Bir örnek olarak, çok sayıda Lambda DNA konsantrasyonları MDA için gerekli reaktif verilmiştir. Reaktif ayrıntıları Belirli Reaktifler Tablo listelenmiştir. Damlacıkları içinde şablon dağılımı sufficien bağlıdırNumunenin t karışımı. <ol><li> Elde veya Arındırmak Phi29 DNA polimeraz. <ol><li> Daha önce tedarikçiden 7 veya satın açıklandığı gibi Phi29 arındırın. Gösterilen deneyleri için kullanılan Phi29 saflaştırılmıştır. </li></ol></li><li> 65 mM KOH, 1.65 mM EDTA ve 14 mM DTT içeren denatürasyonu Tamponu 10 ml hazırlayın. </li><li> 65 mM HCI, 0.21 M Tris-Cl pH 7.0 ve 9 mM Tris-CI, pH 8,0 içeren Nötralizasyon Tamponu 10 ml hazırlayın. </li><li> Böyle nükleaz içermeyen su gibi iki standartları, kimse şablon kontrolü (NTC) ve bir yüksek şablon konsantrasyonu (4 pg / etrafında ul Lambda DNA) hazırlayın. Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul her standardın 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tamponu 3,3 uL her söndürün. </li><li> Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul ilgi şablonun 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3,3 ul söndürünNötralizasyon Buffer. </li><li> Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x çift-şeritli DNA oluşur (dsDNA) bağlanma, boya, 2x qPCR referans boya, 50 uM randomize oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA polimerazı. Iyi 7.5.Mix daha pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük karşılaşmak değil polimeraz sağlamak için son Phi29 DNA polimeraz ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: Daha az yanlış pozitif için önce damlacıklar 34 oluşturan UV ışığı ile ana karışımı maruz. <ol><li> Buz üzerinde 0,5 ml veya 1.5 ml saydam bir tüp içinde örnek başına ön karışımın 10 ul hazırlayın. Ön-karışım 55 uM randomize oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 5.3 mM dNTP ve nükleaz içermeyen su oluşur. </li><li> 34 tarif edildiği gibi buz su tüp yerleştirilir ve bir akü, UV ışığı (254 nm) maruz5.7 J formüle edilmiş dozu / cm 2. </li><li> Ön karışım içinde bulunan 40 ug / ml dsDNA bağlayıcı 1x boya, 1x referans boya ve Phi29 ekleyin. İyice karıştır. </li></ol></li><li> Denatüre şablon veya standart 10 ul ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır. </li></ol> 3. Damlacık Oluşumu Not: damlacıklar statik elektrik ve kayma gerilmesi çok hassas olabilir. Statik elektrik neden olabilecek giysiler çıkarın ve damlacıklar oluşturan önce kendinizi topraklayın. Mümkün olduğu kadar emülsiyondan, tüpün üstünden emülsiyon tüpleri tutun. Pipet emülsiyonlar çok yavaş, tercihen geniş delik pipet ucuyla. Bir pipet gelen dağıtım yaparken, pipet hızını belirlemek için uç tarafında emülsiyonu izleyebilirsiniz. <ol><li> Form damlacıkları. Deneyler göstermiştir için, mikroakışkan cihaz, bir yağ girişi ve damlacıklar üretmek için bir akış odaklama kavşağın iki sulu girişleri vardır. İki syri kullanınNGE 20.000 1 nl damlacıklar oluşturmak için mikroakışkan çip sayesinde yüzey aktif madde ile bir yağ 55 ul ve reaksiyon karışımı bir 20 ul akış hızlarını kontrol etmek pompalar. </li><li> Bu yüzey aktif madde ile birlikte bir yağ, çok çeşitli olan damlacıkları üretmek mümkündür, ama bileşim, büyük ölçüde, yüksek sıcaklıklarda ve zaman içinde damlacık stabilitesini etkiler: edin. Olası bir kombinasyonu anyonik bir yüzey aktif 19,35 florlu yağ HFE 7500. </li><li> Herhangi bir yöntem 13,36 ile herhangi bir boyutta damlacıklar üretmek ama damlacık popülasyonda boyut farklılaşabilirliği dökme floresan ve bu nedenle tahlilin hassasiyetini etkileyecektir. Gösterilen deneylerde, damlalar 1 nl bir hacimde tek dağılımlı idi. </li><li> PCR tüpleri içine ve sıvı yağ toplayın. Her bir örnek için, kısım 30, optik kapaklar taze PCR tüpleri içine petrol ul ve yağ üstünde damlacıklar 20 ul transfer. Tutarlı hacimleri tahlil ac olarak sağlamakmümkün papaz. </li><li> Yakın tüp gevşek kapakları petrol buharlaşmasına izin verecek şekilde, sıkıca kapakları. </li></ol> 4. İzotermal Büyütme <ol><li> PCR thermocycler, qPCR PCR, ya da sıcak plaka kullanılarak, 7 saat süre ile 30 ° C&#39;de inkübe örnekleri ve 75 ° C&#39;de 1 dakika süre ile etkisiz hale getirirler. Damlacıkların borular bu noktada bir kaç saat için folyo ile kaplı bir buzdolabı bırakılabilir. </li></ol> 5. Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Hemen qPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyelerini ölçmek reaksiyon inaktivasyonunu takip. Optimal filtre ayarlarını boya uyarma ve emisyon spektrumları bağlıdır. Bu örnek için, dsDNA bağlayıcı boya için ayarlanmış 492 nm-516 nm filtre ve referans boya için ayarlanmış 585 nm-610 nm filtre kullanın. Diğer floresan ölçüm teknikleri floresan ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Her numune için, tarafından dsDNA bağlayıcı boya floresan yoğunluğu bölmekReferans boyanın flüoresan yoğunluğu. Tüm örneklerden arka plan floresan veya hiçbir şablon kontrolü normalize floresan, çıkarma. </li><li> Standartlardan düzeltilmiş floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. NTC standart% 0 floresan damlacıklarıyla bir örnek için floresan (&quot;Tüm negatif&quot;) temsil eder ve yüksek şablon konsantrasyonu floresan ölçümü% 100 floresan damlacıklarıyla bir örnek için beklenen floresan (&quot;tüm pozitif&quot;) &#39;dir. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin. </li></ol> 6. Üretim Damlacıklar Proof-of-İlke Ölçümleri için <ol><li> Floresan (pozitif) damlalar sağlayın: 0,1 ng Lambda DNA, 1 x dsDNA bağlayıcı boya, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 m aşağıdakilerden oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlamakM MgCI2, 0.2 mM dNTP ve 0.5 uM primer. Karışım yukanda açıklandığı gibi 30 kat (20 saniye, 20 saniye, 1 dakika için 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) Thermocycle, daha sonra damlacıklar oluşturur. </li><li> Floresan olmayan (negatif) damlalar sağlayın: 1x dsDNA bağlayıcı boyasından oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlandı, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 0.2 mM dNTP, ve 0.5 uM primer. Karışım 30 kez (20 saniye için 95 ° C, 20 saniye, 1 dakika süre ile 72 ° C&#39;de 55 ° C), daha sonra damlacıklar oluşturmak Thermocycle. </li><li> Ön karışımlı damlacık oranları Şekillendirme <ol><li> QPCR tüpler içine florlu yağı 20 ul dağıtın, buharlaşmayı önlemek için bir optik kapakla örtün. </li><li> Petrol üstündeki olumsuz oranları: yavaşça istenen olumlu iyi karıştırılmış damlacıkların 10 ul pipetle. Gösterilen sonuçlar, pozitif: negatif oranlarının 1 damla (tüm pozitif), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 ve 0 (bütün neg edildiative). </li></ol></li><li> QPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyeleri ölçülür. Bu protokol için, dsDNA bağlayıcı boya için belirlenen 492 nm-516 nm filtresi ve referans boya için belirlenen 585 nm-610 nm filtresi kullanın. <ol><li> DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Dahası &quot;tüm pozitif&quot; örnek floresan normalleştirmek. </li></ol></li><li> &quot;Tüm pozitif&quot; ve &quot;negatif&quot; örneklerinden normalize floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin. </li><li> Her oran (n = 3) bağımsız bir damlacık oluşumu ve her bir deney için karıştırılarak deneyi tekrarlayın. </li></ol> 7. Proof-of-Prensibi MDA Deneyi <ol><li> Bir spec ile Lambda DNA stok çözeltisi konsantrasyonunu ölçmektrophotometer. <ol><li> Damlacık ortalama 10 şablon molekülleri gerekli şablon konsantrasyonu hesaplayın. Bu protokol için damlacık hacimleri 1 nl ve Lambda DNA 1 ng yaklaşık 1.9 x 10 7 kopyasını içerir varsayıyorum. Bu nedenle, damlacık başına 10 şablonları nl başına 10 kopya ya da ul başına 526 fg Lambda DNA olacaktır. Damlacıklar oluşacak zaman şablonu, bu nedenle, ilk üst şablon konsantrasyonu / ml 3,2 pg olacak ~ 6x seyreltilmiş olacaktır. </li></ol></li><li> Seri olarak denatürasyon tampon ve eşit hacimde Nötralizasyon Tamponu ile 3,2 ug / ul DNA Lambda seyreltin. 0.1 bir seyreltme faktörü için, Denatürasyon Tamponu 45 ul 10 ul örnek birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 İL gidermek için ekleyin. </li><li> Deney için numune kalanını yapmak için adım 7.2 anlatıldığı gibi daha ileri örneği sulandırmak. Gösterilen reaksiyonlarda, ilk şablon konsantrasyonları, 3.2 pg, 320 fg edildi160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg ve mikrolitre başına 1.6 fg. Not: master karışım ilave edildikten sonra son şablon konsantrasyonları 526 fg vardı, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, mikrolitre başına 2.63 fg, 526 ag ve 263 ag. Sırasıyla, damlacık başına 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ve 0.005 beklenen Lambda kopyalar. </li><li> Oluşturmak ve adımları 2,5-5,3 tarif edildiği gibi, her örnekten damlacıklar analiz eder. </li><li> Bir dijital fotoğraf makinesi kullanan gösterilen floresan görüntüleri (Şekil 2,3) oda sıcaklığında bir 10x amacı ile bir epi-floresan mikroskop monte edinin. Her numune için görüş oniki alanları edinin. Bir floresan slayt ile elde edilen bir arka plan görüntüsü ile doğru floresan görüntüler. </li><li> Emülsiyon yağı çabuk buharlaşır gibi görüntüleme 37 için bir yer odasına kullanın. </li><li> Bir ImageJ makro (Ek kod dosyası) kullanarak bireysel damlacık yoğunluklarını analiz edin. <ol><li> En iyi N floresan olmayan damlacıkları ayıran bir eşik floresan yoğunluğu seçinYüksek şablon konsantrasyonu görüntülerde floresan damlacıklar gelen TC görüntüler. Bilinmeyen her numune için, bir sınır değerin üzerinde floresan ile damlacıklar kısmını hesaplar. </li></ol></li></ol> 8. PCR ve MDA toplu reaksiyonları <ol><li> PCR reaksiyonu hazırlayın. <ol><li> Seri 0,1 seyreltme faktörü ile şablon DNA sulandırmak. Her seyreltme için, Denatürasyon Tamponu 45 ul şablonun 10 ul birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 ul seyreltme birleştirin. </li><li> Örnek başına PCR master 20 ul hazırlayın. 1.1x PCR reaksiyon karışımı, ana Taq DNA polimeraz ul 60 birim /, 11 mM Tris-HCI, 55mm KCI, 1.65 mM MgCl2, 0.22 mM dNTP oluşur, 1.1x boya, 1.1x referans boya ve 550 nM dsDNA bağlayıcı Her astar. </li><li> Seyreltilen değişik şablon 2 ul ve 20 ul master birleştirin. Not: Nihai şablon konsantrasyonları tO gösterilen reaksiyonlar PCR 50 pg, 5 pg, 500 fg, mikrolitre başına 50 fg, 5 fg, 500 ag ve 0 g Lambda DNA idi ve üç kopya halinde yapıldı. </li><li> Aşağıdaki programı ile QPCR makinesinde Thermocycle PCR reaksiyonu. 2 dakika boyunca 72 ° C &#39;de 2 dakika önce 30 saniye, 30 saniye için 20 sn için 57 ° C, 72 ° C, 95 ° C 40 döngü çalıştırın ve 4 ° C&#39; de tutarak. </li><li> DsDNA referans boya floresan önce daha fazla analiz kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. </li></ol></li><li> MDA reaksiyonu hazırlayın. <ol><li> Aşama 8.1.1 açıklandığı gibi örnekleri sulandırmak. </li><li> Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x dsDNA bağlayıcı boya, 2x referans boya, 50 uM randomize oligo oluşur 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA Polimeraz. </li><li> 40 ug Phi29 DNA polimeraz ekleyin / polimeraz d sağlamak için son mloes 7.5 den pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük değil karşılaşmak. İyice karıştır. </li><li> Bir qPCR tüp içinde Denatürasyon Tamponu 3,3 ul seyreltilmiş numune, 3.3 uL denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tampon 3.3 ul ekleyin. </li><li> Denatüre şablonun 10 uL ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır. </li><li> Aşağıdaki programı ile QPCR makinesi MDA reaksiyonu çalıştırın. </li><li> Floresans her 7,5 dakika, ölçüm 4 saat 30 ° C&#39;de tutun. </li><li> 1 dakika süre ile 75 ° C &#39;de inaktive. </li><li> DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Bundan başka, her numune için maksimum flüoresan ile normalize. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+strategies+in+the+development+and+analysis+of+molecular+biomarkers+for+personalized+medicine.">Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine.</a> Methods. 59 (1), 101-107 (2013).</li><li>Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RefSeq+microbial+genomes+database:+new+representation+and+annotation+strategy.">RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+genomic+diversity,+one+cell+at+a+time.">Dissecting genomic diversity, one cell at a time.</a> Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).</li><li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Something+from+(almost)+nothing:+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology.">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).</li><li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria.">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li><li>Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+on+a+SlipChip..">Digital PCR on a SlipChip..</a> Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).</li><li>Heyries, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megapixel+digital+PCR.">Megapixel digital PCR.</a> Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).</li><li>Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+single+DNA+molecules+into+fluorescent+magnetic+particles+for+detection+and+enumeration+of+genetic+variations.">Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).</li><li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets.">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics.">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics.">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li><li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems.">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li><li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR.">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays.">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li><li>Lage, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+genetic+alterations+in+small+DNA+samples+using+hyperbranched+strand+displacement+amplification+and+array-CGH.">Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH.</a> Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).</li><li>Dean, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell.">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe-vacuum+microfluidics:+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions.">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells.">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618 (2013).</li><li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).</li><li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G.M.+Softlithographie.">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).</li><li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification.">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).</li><li>Hindson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+hot-start+amplification+via+a+multiple+emulsion.">System for hot-start amplification via a multiple emulsion.</a> US patent. , (2014).</li><li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Dijital deneyler, nadir görülen hücrelerin tespit ve nükleik asit moleküllerinin bireyin sayımı sağlayan güçlü bir yöntem vardır. Bununla birlikte, dijital deneyler de rutin olarak ticari olarak temin edilebilen yöntemler ile ilişkili özel ekipman maliyeti, kısmen, analitik laboratuar uygulanan bağlı değildir. Burada bir standart gerçek zamanlı kantitatif PCR makine kullanarak basitleştirilmiş bir analog okuma ile nükleik asitlerin miktarının belirlenmesi için bir son nokta dijital tahlil açıklar. Bu yöntem set-up hızlı ve okuma damlacık sayım yöntemleri daha kolaydır. Bizim tahlil standart alet kullanarak topluca son nokta ölçüm basitlik bireysel damlacık ölçümlerin tek-molekül (tek damla) hassasiyeti kaybeder. Dijital MDA deneyde, floresan mikroskop gerçek fra tarafından teyidi rağmen, arka plan, 200 negatif damlacıkları başına 1 pozitif damlacık daha az ayırt edemediPozitif damlacıkların ction (Şekil 4) beklendiği gibi oldu. Toplu floresan ölçüm limiti duyarlılık ve arka plan düşük pozitif damlacık kesirler için toplu ölüm testinin hassasiyeti. Daha yüksek hassasiyet gerekli ise, bir dijital okuma önerilir. Yağ seviyeleri veya toplu damlacık hacimleri farklılıklar büyük ölçüde örnek floresan verileri etkileyebilir. Bir referans boya ile bile normalleşme yağ hacimleri floresan okur hale farklılıkları telafi edilemez. Bu tahlil hacmi, alet satın alma parametreleri, Mikro geometri, ya da optik filtreler optimize tahlil performansını artırmak mümkündür. Duyarlılık ve toplu dijital testlerin dinamik aralığı da bölüm boyutunu optimize ederek geliştirilebilir. Büyük damlacıklar enstrümantal arka plan aşabilmesi ve düşük giriş konsantrasyonları duyarlılığını artırabilir her şablon molekülü, floresan ürünlerin büyük bir miktar verim. AçıkDiğer taraftan, daha küçük damlacıklar tahlil hacim başına daha fazla molekül izolasyonuna olanak tanır. Şablon konsantrasyon örnekleri arasında oldukça değişkendir ise, hem küçük hem de büyük bir damlacık reaksiyonları deney dinamik aralığı 39 genişletmek için paralel olarak gerçekleştirilebilir. Tutarlı damlacık hacimleri de doğru ölçüm için gereklidir. Birçok özel mikroakışkan çözeltiler seri 19,40 ve 41,42 paralel hem de hızlı bir şekilde bir numune tek dağılımlı damlalar oluşturmak için mevcuttur. Birkaç paralel birkaç ayrı örneklerden damlacık oluşumunu sağlamak da, mevcut tasarımlardan basit modifikasyonlar örneklerin, herhangi bir sayıda eş zamanlı damlacık oluşturma izin verecektir. Örneğin, Bio-Rad ddPCR sistemi 23 çok sayıda örneğin aynı anda, damlacık oluşumunu sağlayan bağımsız damlacık makinesi, bir dizi girişleri için tek tip bir baskı uygular. Bizim toplu okuma metodolojisi anahtarı kereözel bir okuma enstrümantasyon ve gerek kalmadan bölmeli bir dijital deneylerinde avantajları niceliksel WGA çok uygundur. Burada, biz nedeniyle dizisi özgüllüğü 7 eksikliğine arka plan kirleticilere karşı son derece duyarlı olan nicel WGA, üzerinde duruldu. Orijinal şablonlar sayısı ilgi olduğu Buna ek olarak, gerçek zamanlı kantitatif WGA tahlillerinden elde edilen ürün potansiyel olarak bilinmeyen ve geniş bir molekül ağırlığı dağılımı uygulamalarında yorumlanması zorlaştırır. Dijital tahlil biçimlendirme adresleri hem bu sorunları. Kirletici maddeler, geleneksel bir gerçek zamanlı deneyinde ortaya gibi yüksek molekül ağırlıklı kirletici maddelerin düşük molekül ağırlıklı analitlerin hakimiyeti önlenmesi, ayrı ayrı reaksiyon bölümleri içinde ihtiva edilir. Damlacıklar içinde parlak noktalar olarak görülen Şekil 2B ve 4B, olası kirletici maddeler, olarak, ayrılmış ve yükseltmek veya genel floresan önemli ölçüde katkıda yoktur. Ayrıca,Dijital deneylerde üretilen sinyalin şablonları değil, şablon boyutu ya da amplifikasyon oranı sayısı ile doğru orantılıdır. Bizim yöntem toplu dijital ölçüm kalibre etmek için standartlara dayanır rağmen, gereksinim örneği maç ve standart özelliklerinin önemli ölçüde rahat olabilir. Kantitatif WGA yaygın WGA reaksiyonlar 7,34 kirletici maddeleri ölçmek için kullanılan ve en hassas bilinmeyen bir dizi DNA&#39;nın varlığını ölçmek için bilinen bir yöntem, farmasötik gibi çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bir kalite denetimi, adli ve astrobiyolojiyi. Toplu dijital okuma, hızlandırmak koşutlama ve tahlil okuma basitleştirerek, dijital PCR gibi diğer dijital tahlil protokolleri yararlanabilir.

Nükleik asit ölçümü (dijital PCR) 1-4 ve taban sırası (sıralama) için dijital analizler şiddetle yaşam bilimleri ve tıp etkilemektedir. Dijital deneyleri, yüksek hassasiyet sağlayan deneyler üzerinde yüzeysel karşılaştırmalar sağlayarak ve en önemlisi, karşılaştırılabilir veriler 5 (Tablo 1) içeren büyük veritabanları yapımını sağlayan mutlak ölçek (bir kontrole göre değil) moleküler sayımı ölçümü sağlar. Son 15 yılda, tüm genom amplifikasyonu (WGA) nükleik asit amplifikasyonu için genel bir araç olarak PCR ile birlikte ortaya çıktı. PCR gibi, WGA kolayca tespit veya baz sıralama gibi daha sonraki analizler için kullanılabilecek bir seviyeye kadar dakikalık numune elemanlarını yükselterek analitik ve preparatif uygulamalar için kullanışlıdır. PCR aksine, WGA tercih bilinmiyor sekanslar dahil olmak üzere numunedeki tüm sekanslar, amplifikasyon sağlayan belirli bir DNA lokusu için özel değildir.PCR ve WGA arasındaki bu temel fark birbirine tamamlayıcı yöntemler yapar ve bunların uygulamada farklı zorluklar doğurur. WGA reaksiyonlar 6 yüksek verimi tek moleküllerin 7, tek hücreler 8 ve miktar tayini ya da daha fazla analiz için diğer düşük biyokütle örnekleri 9 genomik DNA rutin amplifikasyonunu sağlamaktadır. WGA kimya ile ilgili önemli zorluklar onun kirlere karşı aşırı hassasiyet ve bireysel şablon molekülleri 6 genelinde dengesiz amplifikasyon vardır. Tek hücreli sıralama Ancak, WGA kazanıyor popülerlik WGA tarafından WGA teknolojisi 10, ve şablon nicelikleme &quot;katil uygulaması&quot; olarak ortaya çıkmıştır uygulamanın 7 birçok alanda önemlidir. Dijital nükleik asit ölçümü için Alet, daha önce Valfli ve supapsız mikroakışkan forma çeşitli tarif edilmiştirdamlacık bazlı deneyler dahil olmak üzere, ts 11-14, 15,16 (Tablo 2). Ancak, dijital analiz için ticari mikroakışkan sistemler reaksiyon kurulumu ve ürün tespiti 17 için özel ekipman gerektirir. Özel valfli Mikroakiskan esnek, ama hassas mikroüretim ve pnömatik kontrol sistemleri 18 gerektirir. Bu emülsiyon tabanlı dijital deneyleri 19,20 için monodispers mikro damlacıklar yapmak nispeten basit olmakla birlikte, dijital okuma büyük ölçekli geniş alan görüntüleme ya gerektiren, (popüler yeni nesil dizileme teknolojileri benzeri) teknik külfetli olduğu 21,22 veya Yüksek hızlı damlacık algılama 23-25 ​​akış tabanlı. İdeal olarak, bir dijital deney karmaşık enstrümantasyon ihtiyacını azaltarak ve hızlı bir şekilde dışarı okunacak örneklerin çok sayıda izin okunmasını set-up basit olurdu. Burada PCR i konvansiyonel gerçek zamanlı kullanan dijital damlacık deneyleri okuma için basitleştirilmiş bir yöntem tarifişle- mini yaparken damlacık tabanlı dijital testlerin toplu floresan ölçmek için. Yeni yaklaşım, dijital PCR uygulanabilir olsa da, (PCR için mükemmel sonuç verir) sorunlu gerçek zamanlı amplifikasyon deneylerini analog olan bir dijital WGA deneyleri için özellikle avantajlıdır. WGA yaygın sekansı, uzunluğu, ve baz içeriği heterojendir şablon molekülleri ile örneklere uygulanır. Bu farklı şablon molekülleri referans (&quot;standart&quot;) eşleşen özelliklere sahip numunenin kullanımını gerektiren, farklı oranlarda 6 güçlendirilir. Genellikle, böyle bir standart mevcuttur ya da gelen örneklerin özellikleri bilinmemektedir. Giriş kütlesi, moleküllerin giriş numarasını, iki ya da ne bir arada - WGA kimyaları giriş malzeme ve uzunluğu bağımlı mülkiyet heterojenliği 26 de sayısal ediliyor ne de belirsizlik yaratarak sonuçların yorumlanmasını zorlaştırmaktadır. FHerhangi bir dizinin kirletici molekülleri müdahale için potansiyele sahip çünkü inally, dizi-dışı özgüllük kantitatif PCR daha kirlenmeye kantitatif çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) daha duyarlı hale getirmektedir. Mikroakışkan dijital tahliller şablon molekülleri ayırma ve daha az kirletici örneklenmiş öyle ki tepkime hacimleri azaltarak kirlenmesini hitap etmektedir. Burada popüler bir izotermal WGA yöntemi, MDA 27 kullanın. Unutmayın ki, PicoPlex ve MALBAC 28 dahil olmak üzere birçok diğer WGA kimyaları ilk izotermal sarmal yer değiştirme merdivenlerinde önemlisi bağlıdır. Izotermal adımlar nicel WGA analog gerçek zamanlı deneyleri uygulanarak meydan alevlenmesine. WGA ne tamamen kurulum sırasında engelledi istenmeyen değişken ön büyütme giden, ne heterojen moleküllerin çoğaltma tamamlanmasına tahrik ve durdurulabilir bir şekilde (&quot;sağlanıncaya&quot;) discretized edilebilir PCR 11 gibi sonraki döngüsü önce </sup&gt; (Şekil 1). WGA için dijital tahlil biçimi nedeniyle tahlil uç noktada sayımı için her molekülün ayrılığı tipik reaksiyon kurulum işlemlerini barındıran özgün okuma doğruluğu amplifikasyon verimliliği varyasyon büyük ölçüde bağımsız olacağını ifade (yani preamplıfikasyon sonuçlarını etkilemez). Tahlil uç noktada damlacık başına sinyal seviyesi damlacık hacmine bağlıdır olarak tahlil, üniforma hacimli yağ üretilen damlacıklar bağlıdır ve biz sonuçların tutarlılığı damlacık boyutları dağılımı boyunca ortalama bağlıdır istemiyorum. Monodispers damlacıkları yapma şimdi (yaklaşık 3.500 monodispers damlacık kağıtları 2013 yılından bu yana yayınlanmış) standart bir prosedür olduğunu, ancak mikroakışkan enstrümantasyon 25 gerektirir. Aslında, fazla altı şirketlerin bu tür damlacıkların üretimine dayanan bağımsız ticari ürünler geliştirdik ve damlacık yapma mikroakışkan cips23,29 ticari olarak temin edilebilir. Bu çalışma için, in-house (Protokol bakınız) üretilen özel mikroakışkan cihazları kullanılır. Şırınga cihazlar yoluyla akışı da ticari olarak temin edilebilir sürücü pompalar, fakat alternatif olarak, maliyetleri azaltmak için 30 vakum bağlı akış için tek tek kullanımlık şırınga ile sübstitüe edilmiş olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Dijital deneyler hücrelerin nadiren ve tek tek nükleik asit moleküllerinin sayımı saptanmasını sağlayan güçlü yöntemlerdir. Ancak, dijital tahliller rutin nedeniyle maliyet ve piyasada mevcut yöntemlerle ilgili özel ekipman, uygulanan değil hala. Burada damlacık tabanlı dijital tahliller kütle floresan ölçmek için geleneksel bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak dijital damlacık deneylerinin okunması için basit bir yöntem sunulmaktadır. Biz sentetik damlacık karışımları ve damlacık dijital çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) testi kullanılarak toplu okuma testinin performansını karakterize. Dijital reaksiyon biçimi Kantitatif MDA özellikle faydaları, ama bizim yeni bir yöntem herhangi bir dijital tahlil için de geçerlidir. Dijital PCR gibi kurulan dijital deney protokolleri için, bu yöntem, hızlandırmak ve deney okuma kolaylaştırmak için hizmet eder. Bizim toplu okuma metodolojisi partitione avantajlarını getiriyorözel okuma enstrümantasyon gerek kalmadan d tahliller. Bu standart için gereksinimler geleneksel gerçek zamanlı deney için daha az talepkar olmasına rağmen toplu okuma metodolojisi temel sınırlamalar, damlacık sayma platformları ve standart bir numune için ihtiyacı ile karşılaştırıldığında dinamik aralık azalır. Kantitatif tüm genom amplifikasyonu (WGA) WGA reaksiyonlarda kirletici maddeler için test etmek için kullanılır ve farmasötik kalite kontrol ve astrobiyolojiden dahil olmak üzere çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bilinmeyen dizilerle DNA parçalarının varlığını tespit etmek için, en hassas bir şekilde işleme tabi tutulur.

Geleneksel bulk / gerçek zamanlı kantitatif PCR okumaları ve kantitatif WGA tahlilleri (Şekil 1) her ikisi için de kullanılabilmesine rağmen, bir dijital sayısal deneyler avantajları (Tablo 1) sağlar. Açıklanan yöntemde, basit bir toplu uç ölçümü (Şekil 2) ile mikro damlacık formatında dijital deneyleri okudu. Bu yöntem genel olarak uygulanabilir iken bu yöntem, geleneksel gerçek zamanlı deneyleri için özel zorluklar sunuyor, çünkü biz niceliksel WGA (MDA) odaklanır. Bizim gerçek zamanlı PCR cihazı yağ içinde dağılmış floresan mikro damlacıklar değişen kesirler tespit olabilir olmadığını kontrol etmek için, biz floresan ve floresan olmayan damlacıkları (Şekil 2) sentetik karışımların toplu floresan ölçümü. Toplu floresan ve pozitif damlacık sayısı (bağımsız floresan mikroskobu ile değerlendirildi) beklendiği gibi (floresan damlacıkların giriş fraksiyonu doğrusal ölçeklendirmeŞekil 3A). Deney her set için bağımsız damlacık oluşumu ve karıştırma ile, üç kere yapıldı. &quot;Bilinmeyen&quot; numuneler için teorik miktar performansını değerlendirmek için, tamamen pozitif ve tamamen negatif kontrol örnekleri kullanılarak doğrusal standart eğrileri kurdu. Bu tür damlacık-çok özgü standart eğrileri ile, her numunenin toplu floresan dayalı sentetik pozitif ve negatif damlacık karışımlarının fraksiyonu hesaplandı. (Şekil 3B R2 = 0,984) sonuçları dinamik aralık iki günlükleri arasında damlacık oranı nicellendirmesinde iyi bir performans gösteriyor. Giriş analit konsantrasyon kolayca pozitif ya da negatif damlacıklar 38 fraksiyondan hesaplanır. Gerçek nicel WGA tahlilinde eden yöntemi test etmek için, bir wi boyunca floresans seviyelerini ve lambda DNA ile dijital bir damlacık MDA tahlilinde pozitif damlacıklar kısmını ölçüldü<html> konsantrasyonlarının de aralığı (Şekil 4). Şekil 4B&#39;de ise, damlacıklar temsili fluoresan görüntüleri gösterilir. Damlacık başına ortalama şablonla beklendiği gibi dijital MDA örneklerinden ikisi toplu floresan ve pozitif damlacık kesir toplu okuma sadakatle dijital deneyi (= 0,927 R 2) sonucunu yakalayabilir belirten ölçek. Biz bağımsız damlacıkları oluşturan ve her tekrar için WGA yürüten, her bir konsantrasyon için deneyi tekrarladı. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/52925/52925table1.jpg" /> Tablo 1. gerçek zamanlı ve dijital deneyleri Özeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52925/52925table1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> able2.jpg &quot;/&gt; Tablo nükleik asitlerin miktarlarının için mevcut yöntemlerden 2. Özeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52925/52925table2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig1.jpg" /> Şekil 1. Gerçek zamanlı kantitatif PCR ve Lambda DNA. MDA MDA PCR gibi sıcaklık döngüsü boyunca discretized ve buz üzerinde özenle hazırlanmış değilse Preamplification eğilimli değildir. Burada, kantitatif PCR ve MDA Lambda DNA konsantrasyonları artan yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52925/52925fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52925/52925fig2.jpg" /> Figurdamlacıkları ve temsili resimlerin analog okuma e 2. şematik. (A) Pozitif ve negatif damlacıkları mikroakışkan cihaz floresan ve floresan olmayan reaktiflerin elde edildi. Negatif oranları: damlacıkları farklı pozitif önceden karıştırılmıştır. Toplu floresan seviyeleri, standart bir gerçek-zamanlı PCR aleti ile ölçüldü, ve pozitif damlacıkların fraksiyon floresan mikroskobu ile belirlenmiştir. (B) Temsilcisi floresan pozitif damlacıkları (ölçek çubuğu = 200 mikron) oranlarını artırarak görüntüleri kaplattı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52925/52925fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52925/52925fig3.jpg" /> Şekil 3. Toplu floresan ve ayrı ayrı hazırlanmış olumlu ve olumsuz drople kombinasyonları floresan kesirts. (A) (pozitif) Floresan ve floresan olmayan (negatif) damlacıkları farklı oranlarda önceden karıştırıldı. Ölçülen bağıl floresan pozitif damlacıklar giriş fraksiyonunun karşılaştırması ve ölçülen pozitif damlacık fraksiyonu (n = 3, bar temsil +/- SD). Noktalı çizgi doğrusal bir ilişki verilen beklenen floresan kısmını temsil eder. Beklenen floresan giriş fraksiyona standartlara dayalı tahmin oranların (B) Karşılaştırma. Çizgi doğrusal bir ilişki verilen beklenen değeri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52925/52925fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52925/52925fig4.jpg" /> Şekil 4. Toplu floresan ve damlacık dijital MDA testinin. Dijital MDA floresan kesir artışlarla gerçekleştirildiasing şablonu Lambda DNA (n = 3, hata çubukları SD ifade etmektedir) konsantrasyonları Şekil 2A&#39;da tarif edildiği gibi ölçülmüştür. Çizgi, bizim deney verileri modellemek için Poisson dağılımını kullanarak beklenen floresan kısmını gösterir. b) Temsilcisi floresan damlacık (NTC, 0.005, 0.05, 0.5, ve 10) başına beklenen Lambda DNA moleküllerini artırmak için reaksiyon inaktivasyonu (ölçek çubuğu = 200 mikron) sonra damlacıkların görüntülerini kaplattı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52925/52925fig4large.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays at JoVE.com

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Görüntüleme.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

Video: Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biyoloji

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Zararlı Uyaranlar Algılama için Nicel Davranışsal Okuma olarak Planarian Scrunching

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...