The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Nota: fabricar el dispositivo de microfluidos no es necesario para este ensayo, en forma de gotas para este protocolo se pueden formar con los responsables de gotitas comerciales existentes 23,29. 1. Hacer que el dispositivo de microfluidos Gotita de formación <ol><li> Preparar molde maestro para los canales con el protocolo Fabrication Maestro SU-8 esbozó previamente 31, pero con un patrón de máscara generador de gotas 32. </li><li> Fabricar dispositivos en PDMS utilizando las técnicas de litografía blanda 32,33. </li></ol> 2. Prepare la mezcla de reacción para granel Gotita Lectura Nota: El protocolo se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos utilizando muchos tipos de reacciones de amplificación. Como ejemplo, se dan los reactivos necesarios para MDA de varias concentraciones de ADN Lambda. Detalles de reactivos se enumeran en la Tabla de reactivos específicos. La distribución de plantilla dentro de las gotitas depende de suficient de mezcla de la muestra. <ol><li> Obtener o ADN polimerasa Phi29 Purify. <ol><li> Purificar Phi29 lo descrito previamente 7, o la compra de un proveedor. El Phi29 utilizado para los experimentos mostrados se purificó. </li></ol></li><li> Preparar 10 ml de desnaturalización tampón consistente en 65 mM de KOH, EDTA 1,65 mM, y DTT 14 mM. </li><li> Preparar 10 ml de tampón de neutralización que consisten en HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, y 9 Tris-Cl mM, pH 8,0. </li><li> Preparar dos estándares, uno no tiene control plantilla (NTC), como el agua libre de nucleasa, y una alta concentración de la plantilla (en torno a 4 pg de ADN Lambda / l). Desnaturalizar 3.3 l de cada estándar con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar cada uno con 3,3 l de tampón de neutralización. </li><li> Desnaturalizar 3.3 l de la plantilla de interés con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar con 3,3 lde tampón de neutralización. </li><li> Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste en ADN de doble cadena 2x (dsDNA) tinte vinculante, tinte referencia 2x qPCR, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN Phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa y 40 mg / ml de ADN polimerasa Phi29. Añadir ADN polimerasa Phi29 última para garantizar la polimerasa no encontrarse con niveles de pH mucho más alto o más bajo que 7.5.Mix bien. </li><li> Opcional: Para un menor número de falsos positivos, exponer mezcla maestra con luz UV antes de formar gotitas 34. <ol><li> Preparar 10 l de pre-mezcla por muestra en un tubo transparente de 0,5 ml o 1,5 ml en hielo. La premezcla se compone de 55 M oligo aleatorizado, 2,2 mg / ml de BSA, ADN polimerasa Phi29 1.1x tampón de reacción, 5,3 mM dNTPs, y el agua libre de nucleasa. </li><li> Se coloca el tubo en el agua en hielo como se describe 34 y exponer a la luz UV (254 nm) a un accuacu- dosis de 5,7 J / cm 2. </li><li> Añadir colorante dsDNA vinculante a 1x, tinte referencia a 1X, y Phi29 a 40 mg / ml en la pre-mezcla. Mezclar bien. </li></ol></li><li> Combine 10 l de plantilla desnaturalizado o estándar y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien. </li></ol> 3. Gotita Formación Nota: Las gotitas pueden ser muy sensibles a la electricidad estática y el esfuerzo cortante. Quitar las ropas que pueden causar electricidad estática, y la tierra antes de la formación de gotas. Manejar tubos de emulsión desde la parte superior del tubo, en la medida de la emulsión como sea posible. Emulsiones pipeta muy lentamente, de preferencia con una gran punta de la pipeta ánima. Cuando la dispensación de una punta de pipeta, ver la emulsión en el lado de la punta para determinar la velocidad de pipeteado. <ol><li> Gotas de formulario. Para los experimentos mostrados, el dispositivo de microfluidos tiene una entrada de aceite y dos entradas acuosas con un cruce de enfoque de flujo para la generación de gotitas. Utilice dos syriESN bombas para controlar las velocidades de flujo de 55 l de aceite con tensioactivo y un 20 l de mezcla de reacción a través del chip de microfluidos para generar 20.000 1 gotitas nl. </li><li> Nota: Es posible producir gotitas con muchos tipos de aceite con tensioactivo, pero la composición afectará en gran medida la estabilidad de gota a altas temperaturas y el tiempo. Una combinación posible es HFE aceite fluorado 7500 con un tensioactivo aniónico 19,35. </li><li> Producir gotitas en cualquier tamaño, con cualquier método de 13,36, pero la variabilidad del tamaño de la población de gotitas afectará la fluorescencia a granel, y por lo tanto la exactitud del ensayo. Para los experimentos mostrados, las gotitas eran monodispersas con un volumen de 1 nl. </li><li> Recoge todas las gotas y el aceite en tubos de PCR. Para cada muestra, alícuota de 30 l de aceite en tubos de PCR frescas con tapones ópticos y transferir 20 l de gotas en la parte superior del aceite. Los volúmenes consistentes garantizan el ensayo es como accomisariar posible. </li><li> Cerrar tubo de tapas con fuerza, como tapas flojas permitirán que el aceite se evapore. </li></ol> 4. La amplificación isotérmica <ol><li> El uso de un termociclador de PCR, qPCR termociclador o placa caliente, incubar las muestras a 30 ° C durante 7 horas, e inactivar durante 1 min a 75 ° C. Los tubos de las gotitas se pueden dejar en una nevera revestido con una lámina por un par de horas en este punto. </li></ol> 5. Adquisición de Datos y Análisis <ol><li> Inmediatamente después de la inactivación de reacción, medir los niveles de fluorescencia de colorante para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Configuración del filtro óptima dependerá de excitación del colorante y espectros de emisión. Para este ejemplo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. Otras técnicas de medición fluorescentes se pueden utilizar para cuantificar la fluorescencia. </li><li> Para cada muestra, dividir la intensidad de fluorescencia del colorante dsDNA vinculante porla intensidad de fluorescencia del colorante de referencia. Restar la fluorescencia de fondo, o la fluorescencia normalizada del control sin plantilla, de todas las muestras. </li><li> Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia corregidos de las normas. La norma NTC representa la fluorescencia para una muestra con 0% gotitas fluorescentes (&quot;todos negativos&quot;), y la medición de fluorescencia alta concentración de plantilla es la fluorescencia esperado para una muestra con 100% gotitas fluorescentes (&quot;todo es positivo&quot;). Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel. </li></ol> 6. producir gotas de Medidas de prueba de Principio <ol><li> Hacer fluorescentes gotitas (positivos): Preparar una mezcla de reacción PCR que consta de 0,1 ng de ADN Lambda, tinte 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, y 0,5 mM cebadores. Termociclo la mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), a continuación, formar gotitas como se describe anteriormente. </li><li> Hacer no fluorescentes gotitas (negativos): Preparar una mezcla de reacción de PCR que consiste en colorante 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, mM dNTP 0,2, y 0,5 mM cebadores. Termociclo las mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 1 min), entonces se forman gotitas. </li><li> La formación de relaciones de gotas premezclados <ol><li> Distribuir 20 l de aceite fluorado en tubos qPCR, cubrir con una tapa óptica para evitar la evaporación. </li><li> Pipetear suavemente 10 l de gotitas bien mezclados en proporciones de positivos deseados: negativos en la parte superior del aceite. En los resultados mostrados, positivos: relaciones de gotitas negativos fueron 1 (todas positivas), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0 (todo el negativa). </li></ol></li><li> Medir los niveles de colorante de fluorescencia para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Para este protocolo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. <ol><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia de la &quot;todos positivos&quot; de la muestra. </li></ol></li><li> Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia normalizados de los &quot;todos positivos&quot; y &quot;negativos&quot; todas las muestras. Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel. </li><li> Repite el experimento para cada relación (n = 3) con la formación de gotas independiente y de mezcla para cada réplica. </li></ol> Experimento 7. La prueba de principio MDA <ol><li> Medir la concentración de solución madre de ADN Lambda con una especificaciónfotómetro. <ol><li> Calcular la concentración de plantilla necesario medias moléculas 10 de la plantilla por las gotitas. Para este protocolo, asumen volúmenes de gota son 1 nl y 1 ng de ADN Lambda contiene aproximadamente 1,9 x 10 7 copias. Por lo tanto, 10 plantillas por gotita será de 10 copias por nl o 526 fg de ADN Lambda por l. La plantilla se diluyó ~ 6x cuando se forman las gotitas, por lo tanto, la concentración inicial más alta plantilla será 3,2 pg / l. </li></ol></li><li> En serie diluir el ADN Lambda de 3.2 pg / l con desnaturalización Buffer e igual volumen de tampón de neutralización. Para un factor de dilución de 0,1, combinar muestra de 10 l con 45 l de tampón de desnaturalización e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 45 lL de tampón de neutralización para saciar. </li><li> Además diluir la muestra como se describe en el paso 7.2 para hacer que el resto de las muestras para el experimento. Las concentraciones iniciales de plantilla en las reacciones que se muestran fueron 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg, y 1,6 fg por microlitro. Nota: Las concentraciones plantilla finales después de la adición de mezcla maestra eran 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag y 263 ag por microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, y 0,005 esperados copias Lambda por gotita, respectivamente. </li><li> Generar y analizar las gotitas de cada muestra como se describe en los pasos 2.5-5.3. </li><li> Adquirir las imágenes de fluorescencia se muestra (Figura 2,3) utilizando una cámara digital montado en un microscopio de epi-fluorescencia con un objetivo 10x a TA. Adquirir doce campos de visión para cada muestra. Imágenes de fluorescencia Corregir una imagen de fondo obtenido con un tobogán fluorescente por. </li><li> Utilice una cámara contenida para imágenes 37 como el aceite de la emulsión se evaporará rápidamente. </li><li> Analizar intensidades de gotas individuales utilizando una macro ImageJ (archivo de código suplementario). <ol><li> Elija una intensidad de fluorescencia umbral que mejor separa gotitas no fluorescentes en el NImágenes de TC de las gotas fluorescentes en las imágenes de alta concentración de la plantilla. Para cada muestra desconocida, calcular la fracción de gotitas con una intensidad de fluorescencia por encima del umbral. </li></ol></li></ol> 8. reacciones de PCR a granel y MDA <ol><li> Preparar reacción de PCR. <ol><li> Diluir en serie de ADN plantilla con un factor de dilución de 0,1. Para cada dilución, se combinan 10 l de plantilla con 45 l de desnaturalización Buffer e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Combine la dilución con 45 l de tampón de neutralización. </li><li> Preparar 20 l de mezcla maestra de PCR por muestra. La mezcla maestra de reacción 1.1x PCR consta de 60 unidades / l de ADN polimerasa Taq, 11 mM Tris-HCl, KCl 55 mm, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, tinte, tinte referencia 1,1x y 1,1x 550 nM dsDNA vinculante cada cebador. </li><li> Combinar 2 l de plantilla diluida y 20 l de mezcla maestra. Nota: Las concentraciones plantilla finales en tél PCR reacciones mostradas fueron 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, y 0 g de ADN Lambda por microlitro, y se realizaron por triplicado. </li><li> Termociclo reacción PCR en la máquina qPCR con el siguiente programa. Ejecutar 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 30 seg antes de 2 min a 72 ° C durante 2 min y mantenimiento a 4 ° C. </li><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando referencia colorante fluorescente antes de su posterior análisis. </li></ol></li><li> Preparar reacción MDA. <ol><li> Diluir las muestras como se describe en el paso 8.1.1. </li><li> Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste tinte 2x dsDNA vinculante, tinte referencia 2x, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa, y 40 mg / ml ADN polimerasa Phi29. </li><li> Añadir la ADN polimerasa Phi29 a 40 g / ml durar para asegurar la polimerasa does no encontrarse con niveles de pH mucho mayor o menor que 7,5. Mezclar bien. </li><li> Desnaturalizar 3,3 l de plantilla se diluye con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 3,3 l de tampón de neutralización. </li><li> Combine 10 l de plantilla desnaturalizado y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien. </li><li> Ejecutar reacción MDA en máquina qPCR con el siguiente programa. </li><li> Mantenga a 30 ° C durante 4 horas, medir la fluorescencia cada 7,5 minutos. </li><li> Inactivar a 75 ° C durante 1 min. </li><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia máxima para cada muestra. </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G.M.+Softlithographie.">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).</li><li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification.">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).</li><li>Hindson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+hot-start+amplification+via+a+multiple+emulsion.">System for hot-start amplification via a multiple emulsion.</a> US patent. , (2014).</li><li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y contando de individual de moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, los ensayos digitales aún no se aplican de forma rutinaria en los laboratorios de análisis, debido en parte al coste de equipo especializado asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí se describe un ensayo digital de punto final para la cuantificación de ácidos nucleicos con una lectura analógica simplificada usando una cuantitativa en tiempo...

Ensayos digitales para la cuantificación de ácidos nucleicos (PCR digital) 1.4 y la base de la orden (secuencia) están impactando fuertemente las ciencias de la vida y la medicina. Digitales proporcionan ensayos de cuantificación de los recuentos moleculares en una escala absoluta (no respecto a un control), proporcionando una alta sensibilidad, lo que permite comparaciones fáciles a través de experimentos, y crucial, lo que permite la construcción de grandes bases de datos que contienen datos comparables 5 (Tabla 1). En los últimos 15 años, la amplificación del genoma (WGA) surgió junto PCR como una herramienta general para la amplificación de ácidos nucleicos. Al igual que la PCR, WGA es útil para aplicaciones analíticas y preparativas por amplificación de elementos de la muestra minuto hasta un nivel que puede ser fácilmente detectado o utilizado para los análisis posteriores, como la secuenciación de base. A diferencia de PCR, WGA no es específico de un locus particular de ADN, en lugar permitiendo la amplificación de todas las secuencias en la muestra, incluyendo secuencias desconocidas.Esta diferencia fundamental entre la PCR y WGA hace que los métodos complementarios entre sí y da lugar a diferentes desafíos en su aplicación. El alto rendimiento de las reacciones de WGA 6 permite la amplificación rutinaria de ADN genómico a partir de moléculas individuales 7, células individuales 8 y otras muestras de baja biomasa 9 para la cuantificación o análisis adicional. Los principales desafíos relacionados con la química WGA son su extrema sensibilidad a los contaminantes y la amplificación desigual entre moléculas plantilla individuales 6. Sin embargo, WGA está ganando popularidad como la secuenciación de una sola célula se ha convertido en la &quot;aplicación asesina&quot; de la tecnología WGA 10, y la plantilla de la cuantificación de Ventajas de Windows Original es importante en muchos campos de aplicación 7. Instrumentación para la cuantificación de ácido nucleico digital ha sido descrita previamente en una variedad de válvula y sin válvula forma de microfluidosts 11-14, incluyendo ensayos basados ​​en gotitas 15,16 (Tabla 2). Sin embargo, los sistemas de microfluidos comerciales para análisis digital requieren equipo especializado para la configuración de la reacción y la detección del producto 17. Microfluidos con válvula de encargo son flexibles, pero requieren de microfabricación de precisión y sistemas de control neumático 18. Si bien es relativamente sencillo de hacer monodispersas micro-gotas para los ensayos digitales basados ​​en emulsión 19,20, lectura digital es técnicamente onerosa, que requiere de formación de imágenes de campo amplio a gran escala (similar a las tecnologías de secuenciación populares de próxima generación) o 21,22 de alta velocidad de flujo basados ​​en la detección de gotas 23-25. Idealmente, un ensayo digitales sería simple a partir de la configuración de lectura de salida, reduciendo la necesidad de instrumentación compleja y permitiendo que un gran número de muestras para ser leído rápidamente. Aquí se describe un método simplificado para la lectura de los ensayos de gotitas digital que utiliza un tiempo real PCR convencional iNSTRUMENTO para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas. Mientras que el nuevo enfoque puede aplicarse a los ensayos de PCR digitales, es particularmente ventajoso para los ensayos de WGA digitales para el cual analógica ensayos de amplificación en tiempo real (que dan excelentes resultados para la PCR) son problemáticos. Ventajas de Windows Original se aplica comúnmente a las muestras con las moléculas de plantilla que son heterogéneos en secuencia, longitud y contenido de la base. Estas diferentes moléculas de molde se amplifican a diferentes velocidades 6, lo que exige el uso de una referencia (&quot;estándar&quot;) muestra con características coincidentes. A menudo, no hay tal estándar está disponible, o las características de las muestras entrantes son desconocidos. La heterogeneidad del material de entrada y la propiedad dependiente de la longitud de químicas de WGA 26 también complicar la interpretación de los resultados mediante la creación de ambigüedad en lo que se está cuantificado - la masa de entrada, el número de moléculas de entrada, una combinación de los dos, o ninguno. Finalmente, la secuencia de no especificidad de amplificación del desplazamiento hace que múltiple cuantitativa (MDA) más sensibles a la contaminación que la PCR cuantitativa ya que las moléculas contaminantes de cualquier secuencia tienen un potencial de interferir. Ensayos digitales microfluidos abordar la contaminación por segregar moléculas plantilla y la reducción de los volúmenes de reacción tales que menos contaminantes se muestrean. Aquí se utiliza un método WGA isotérmica popular, MDA 27. Es de destacar que varias otras químicas WGA incluyendo PicoPlex y MALBAC 28 dependen crucialmente de pasos iniciales de desplazamiento de hebra isotérmica. Pasos isotérmicos exacerban el reto de aplicar ensayos en tiempo real analógicos para WGA cuantitativo. WGA no puede ser ni impidió completamente durante la instalación, lo que lleva a no deseado de pre-amplificación variables, ni discretiza (&quot;ciclado&quot;) de una manera donde la replicación de moléculas heterogéneas puede ser conducido a la terminación y se detuvo antes de la siguiente ciclo de PCR como 11 </sup&gt; (Figura 1). Un formato de ensayo digital para WGA acoge procedimientos de configuración reacción típica debido a la segregación de cada molécula para la enumeración en el punto final de ensayo (de modo pre-amplificación no afecta a los resultados) de lectura original significa exactitud sería en gran medida independiente de la variación en la eficiencia de amplificación. El ensayo depende de las gotitas producidas en aceite con volúmenes uniformes, ya que el nivel de la señal por la gotita en el punto final del ensayo dependerá del volumen de gota, y no queremos que la consistencia de los resultados que dependen de un promedio a través de una distribución de tamaños de gota. Hacer gotitas monodispersas es ahora un procedimiento estándar (alrededor de 3.500 documentos de gotitas monodispersas se han publicado desde 2013), sino que requiere la instrumentación de microfluidos 25. De hecho, más de seis empresas han desarrollado productos comerciales independientes que dependen de la producción de este tipo de gotas, y los chips de microfluidos gotitas de decisiones sondisponible comercialmente 23,29. Para este estudio, se utilizaron dispositivos de microfluidos encargo de fabricación propia (véase el Protocolo). Las bombas de jeringa para conducir el flujo a través de los dispositivos también están disponibles comercialmente, pero, alternativamente, puede estar sustituido con un solo jeringa desechable para el flujo impulsado por vacío para reducir los costos 30.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y recuento de moléculas de ácido nucleico individuales. Sin embargo, los ensayos digitales son todavía no se aplican de forma rutinaria, debido al coste y equipos específicos asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí presentamos un método simplificado para la lectura de las pruebas de gota digitales utilizando un instrumento convencional PCR en tiempo real para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas. Caracterizamos el rendimiento del ensayo de lectura mayor usando mezclas de gotitas sintético y un digital de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) de ensayo de gotas. Cuantitativa MDA en particular se beneficia de un formato digital de la reacción, pero nuestro nuevo método se aplica a cualquier ensayo digital. Para protocolos de ensayo digitales establecidos, tales como PCR digital, este método sirve para acelerar y simplificar la lectura del ensayo. Nuestra metodología de lectura mayor aporta las ventajas de partitioned ensayos sin la necesidad de la instrumentación de lectura especializada. Las principales limitaciones de la metodología de lectura mayor se reducen rango dinámico en comparación con las plataformas de gotita de conteo y la necesidad de una muestra estándar, aunque los requisitos de esta norma son menos exigentes que para un experimento en tiempo real convencional. La amplificación del genoma completo cuantitativa (WGA) se utiliza para probar los contaminantes presentes en las reacciones de Ventajas de Windows Original y es la forma más sensible para detectar la presencia de fragmentos de ADN con secuencias desconocidas, dando el método de gran promesa en diversas áreas de aplicación incluyendo control de calidad farmacéutica y la astrobiología.

Mientras que las lecturas de mayor convencional / en tiempo real se pueden utilizar tanto para PCR cuantitativo y ensayos cuantitativos WGA (Figura 1), ensayos cuantitativos digitales proporcionan ventajas (Tabla 1). En el método descrito, leemos a cabo ensayos digitales en formato micro-gotita con una medición de punto final a granel sencilla (Figura 2). Si bien este método es ampliamente aplicable, nos centramos en WGA cuantitativa (MDA) ya que este método present...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.2K vistas.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Investigación

Biología

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Exploración planarian como una lectura cuantitativa del comportamiento para la detección de estímulos nocivos

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...