The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Nota: Realizzazione del dispositivo microfluidico non è necessario per questo test, come goccioline di questo protocollo possono essere formati con i responsabili gocciolina commerciali esistenti 23,29. 1. Effettuare il Droplet formano dispositivo a microfluidi <ol><li> Preparare stampo master per i canali con il protocollo SU-8 master Fabrication delineato in precedenza 31, ma con un modello di maschera generatore gocciolina 32. </li><li> Realizzare dispositivi in PDMS utilizzando le tecniche della litografia soffice 32,33. </li></ol> 2. Preparare miscela di reazione per Bulk Droplet lettura Nota: Il protocollo può essere utilizzato per quantificare gli acidi nucleici utilizzando molti tipi di reazioni di amplificazione. Come esempio, i reagenti necessari per MDA di diverse concentrazioni di DNA Lambda sono dati. Dettagli dei reagenti sono elencati nella tabella dei reagenti specifici. La distribuzione del modello nelle goccioline dipende sufficient miscelazione del campione. <ol><li> Ottenere o polimerasi Purificare Phi29 DNA. <ol><li> Purificare Phi29 come descritto in precedenza 7, o acquistare da fornitori. Il Phi29 utilizzato per esperimenti mostrati stato purificato. </li></ol></li><li> Preparare 10 ml di denaturazione tampone, comprensivi di 65 KOH mM, 1.65 mM EDTA, e DTT 14 mm. </li><li> Preparare 10 ml di tampone di neutralizzazione, comprensivi di HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, e 9 Tris-Cl mM pH 8.0. </li><li> Preparare due standard, uno nessun controllo template (NTC), come l&#39;acqua priva di nucleasi, e una alta concentrazione di modello (circa 4 pg / ml DNA Lambda). Denaturare 3.3 ml di ogni campione con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Placare ciascuno con 3,3 ml di neutralizzazione Buffer. </li><li> Denaturare 3.3 ml di modello di interessi con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Placare con 3.3 mldi neutralizzazione Buffer. </li><li> Preparare 11 ml di miscela maestro per campione sul ghiaccio. La miscela di maestro di reazione 2x MDA è composto da 2x DNA a doppia elica (dsDNA) tintura legame, tintura di riferimento 2x qPCR, 50 micron oligo randomizzato, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 4.8 dNTP mM, acqua priva di nucleasi , e 40 mg polimerasi / ml Phi29 DNA. Aggiungere DNA polimerasi Phi29 ultimo a garantire la polimerasi non incontrare livelli di pH molto superiore o inferiore 7.5.Mix bene. </li><li> Opzionale: Per un minor numero di falsi positivi, esporre master mix con la luce UV prima di formare goccioline 34. <ol><li> Preparare 10 ml di pre-miscela per campione in 0,5 ml o 1,5 ml tubo trasparente su ghiaccio. La pre-mix è composto da 55 micron oligo randomizzato, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 5,3 mM dNTP, e l&#39;acqua priva di nucleasi. </li><li> Porre il tubo in acqua su ghiaccio, come descritto 34 ed esporre alla luce UV (254 nm) a un accuDose cumulati di 5,7 J / cm 2. </li><li> Aggiungere colorante dsDNA vincolante a 1x, riferimento tintura a 1x, e Phi29 a 40 mg / ml nel pre-miscela. Mescolare bene. </li></ol></li><li> Combina 10 ml di template denaturato o standard e di 10 ml di miscela master. Mescolare bene. </li></ol> 3. Droplet Formazione Nota: Goccioline possono essere molto sensibili all&#39;elettricità statica e sforzo di taglio. Rimuovere i vestiti che possono causare elettricità statica, e statica del corpo prima di formare goccioline. Maniglia tubi di emulsione dalla sommità del tubo, per quanto dall&#39;emulsione possibile. Emulsioni pipette molto lentamente, preferibilmente con una punta larga foro pipetta. Per la dispensazione da un puntale, vedere l&#39;emulsione sul lato della punta per determinare la velocità di pipettaggio. <ol><li> Goccioline modulo. Per gli esperimenti mostrati, il dispositivo microfluidico presenta un ingresso e due insenature olio acquose con una giunzione a flusso focalizzazione per generare goccioline. Utilizzare due SyriPompe ESN per controllare le portate di 55 ml di olio con un tensioattivo e 20 pl di miscela di reazione attraverso il chip microfluidico per generare 20.000 1 goccioline nl. </li><li> Nota: E &#39;possibile produrre goccioline con molti tipi di olio con tensioattivo, ma la composizione influisce notevolmente stabilità gocciolina a temperature elevate e nel tempo. Una combinazione possibile è olio fluorurato HFE 7500 con un tensioattivo anionico 19,35. </li><li> Produrre goccioline in qualsiasi formato con qualsiasi metodo 13,36, ma la variabilità dimensioni della popolazione gocciolina influenzerà la fluorescenza massa, e quindi la precisione del dosaggio. Per esperimenti mostrati, goccioline erano monodisperse con un volume di 1 nl. </li><li> Raccogli tutte le goccioline e olio in provette PCR. Per ciascun campione, un&#39;aliquota di 30 ml di olio in provette per PCR freschi con tappi ottici e trasferire 20 ml di goccioline sopra dell&#39;olio. I volumi consistenti assicurano il saggio è come accurare il più possibile. </li><li> Chiudi tubo tappi ermeticamente, come tappi sciolti permetterà l&#39;olio di evaporare. </li></ol> 4. isotermica Amplificazione <ol><li> Utilizzando un termociclatore PCR, qPCR termociclatore, o piastra, incubare i campioni a 30 ° C per 7 ore, e inattivare per 1 min a 75 ° C. I tubi di goccioline possono essere lasciati in frigorifero coperto con un foglio per alcune ore a questo punto. </li></ol> 5. Acquisizione dati e analisi <ol><li> Subito dopo l&#39;inattivazione reazione, misurare i livelli di fluorescenza di coloranti per tutti i campioni che utilizzano il termociclatore qPCR. Impostazioni del filtro ottimale dipenderà tintura di eccitazione e spettri di emissione. Per questo esempio, utilizzare il 492 nm-516 nm filtro impostato per la tintura dsDNA vincolante, e il filtro nm 585 nm-610 impostato per la tintura di riferimento. Altre tecniche di misura fluorescenti possono essere utilizzati per quantificare la fluorescenza. </li><li> Per ciascun campione, dividere l&#39;intensità di fluorescenza del colorante dsDNA vincolante byl&#39;intensità di fluorescenza del colorante di riferimento. Sottrarre la fluorescenza di fondo, o la fluorescenza normalizzata del controllo NTC, da tutti i campioni. </li><li> Creare una curva standard lineare utilizzando le misure di fluorescenza corrette dalle norme. Lo standard NTC rappresenta la fluorescenza per un campione con goccioline fluorescenti 0% (&quot;tutto negativo&quot;), e la misurazione di fluorescenza di alta concentrazione modello è la fluorescenza atteso per un campione con goccioline fluorescenti 100% (&quot;tutti positivi&quot;). Utilizzando la curva standard corrispondente, prevedere i rapporti intermedi di goccioline positivi e negativi in ​​base alla loro fluorescenza bulk. </li></ol> 6. Produrre Droplets per Principio Proof-of-Misure <ol><li> Fai fluorescenti (positive) le goccioline: Preparare una miscela di reazione PCR costituita da 0,1 ng DNA Lambda, colorante 1x dsDNA vincolante, colorante riferimento 1x, 1,5 unità Taq DNA polimerasi, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, e 0,5 mM primers. Thermocycle La miscela 30 volte (95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 1 minuto), quindi formare goccioline come descritto sopra. </li><li> Rendere non fluorescenti gocce (negativo): Preparare una miscela di reazione di PCR che consiste di colorante 1x dsDNA vincolante, tintura di riferimento 1x, 1,5 unità Taq DNA polimerasi, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTP, e 0,5 micron primer. Thermocycle La miscela 30 volte (95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 1 minuto), quindi formano goccioline. </li><li> Formare rapporti goccioline premiscelati <ol><li> Distribuire 20 ml di olio fluorurato in tubi qPCR, coprire con un cappuccio ottica per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Pipettare delicatamente 10 ml di goccioline ben mescolato in positivi desiderati: rapporti negativi sopra dell&#39;olio. Nei risultati mostrati, positivi: rapporti gocciolina negativi erano 1 (tutti positivi), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, e 0 (tutto negative). </li></ol></li><li> Misurare i livelli di colorante di fluorescenza per tutti i campioni utilizzando il termociclatore qPCR. Per questo protocollo, utilizzare il 492 nm-516 nm filtro impostato per la tintura dsDNA vincolante, e il filtro nm 585 nm-610 impostato per la tintura di riferimento. <ol><li> Normalizzare dsDNA vincolante fluorescenza colorante con riferimento colorante fluorescente. Ulteriori normalizzare la fluorescenza del &quot;tutto positivo&quot; campione. </li></ol></li><li> Creare una curva standard lineare utilizzando le misure di fluorescenza normalizzati dai &quot;tutti positivi&quot; e &quot;negativi&quot; tutti i campioni. Utilizzando la curva standard corrispondente, prevedere i rapporti intermedi di goccioline positivi e negativi in ​​base alla loro fluorescenza bulk. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento per ciascun rapporto (n = 3) con la formazione di goccioline indipendente e miscelazione per ogni replica. </li></ol> 7. La prova di principio MDA Experiment <ol><li> Misurare la concentrazione di soluzione di DNA Lambda con una specificatrophotometer. <ol><li> Calcolare la concentrazione modello necessario per medie molecole 10 template per goccia. Per questo protocollo, assumono volumi di goccioline sono 1 nl e 1 ng di DNA Lambda contiene circa 1,9 x 10 7 copie. Pertanto, 10 modelli per ogni gocciolina saranno 10 copie per nl, o 526 fg DNA Lambda per microlitri. Il modello sarà diluito ~ 6x quando si formano goccioline, quindi la concentrazione iniziale più alto modello sarà 3,2 pg / ml. </li></ol></li><li> In serie diluire il DNA Lambda di 3,2 pg / ml con tampone di denaturazione e volume uguale neutralizzazione Buffer. Per un fattore di diluizione di 0,1, unire campione di 10 microlitri con 45 ml di tampone di denaturazione e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 45 lL di neutralizzazione tampone per placare. </li><li> Ulteriori diluire il campione come descritto al punto 7.2 per rendere il resto dei campioni per l&#39;esperimento. Le concentrazioni modello iniziale nelle reazioni indicate erano 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg, e 1,6 fg per microlitro. Nota: Le concentrazioni modello finali dopo mastermix Inoltre erano 526 fg, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, 2.63 fg, 526 ag, e 263 ag per microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 e attesi copie Lambda per gocciolina, rispettivamente. </li><li> Generare e analizzare le goccioline di ogni campione come descritto nei passaggi 2.5-5.3. </li><li> Acquisire le immagini mostrate fluorescenza (Figura 2,3) utilizzando una fotocamera digitale montata a un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 10x a temperatura ambiente. Acquisire dodici campi di vista per ogni campione. Immagini di fluorescenza Correggere un&#39;immagine di sfondo ottenuta con uno scivolo a fluorescenza. </li><li> Utilizzare una camera di contenuto per l&#39;imaging 37 come l&#39;olio di emulsione evapora rapidamente. </li><li> Analizzare singole intensità gocciolina utilizzando una macro ImageJ (file di codice supplementare). <ol><li> Scegliere un&#39;intensità di fluorescenza soglia che meglio separa le goccioline non fluorescenti in NImmagini TC delle gocce fluorescenti nelle immagini ad elevata concentrazione di template. Per ciascun campione sconosciuto, calcolare la frazione di goccioline con una intensità di fluorescenza di sopra della soglia. </li></ol></li></ol> 8. Le reazioni alla rinfusa PCR e MDA <ol><li> Preparare reazione PCR. <ol><li> Serialmente diluire DNA templato con un fattore di diluizione di 0,1. Per ogni diluizione, unire 10 ml di modello con 45 ml di tampone di denaturazione e incubare a temperatura ambiente per 3 min. Unire la diluizione con 45 ml di neutralizzazione Buffer. </li><li> Preparare 20 ml di PCR mastermix per campione. La miscela di reazione maestro 1.1x PCR è costituito da 60 unità / microlitri DNA polimerasi Taq, 11 mm Tris-HCl, 55mm KCl, 1.65 mM MgCl 2, 0,22 mM dNTP, tintura, 1.1x tintura di riferimento, e 550 nm 1.1x dsDNA vincolante ogni primer. </li><li> Unire 2 ml di modelli diluiti e 20 ml di Mastermix. Nota: Le concentrazioni del modello finale in tegli Pcr reazioni mostrate erano 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, e 0 g di DNA lambda per microlitro, e sono stati eseguiti in triplicato. </li><li> Reazione Thermocycle PCR in macchina qPCR con il seguente programma. Eseguire 40 cicli di 95 ° C per 30 sec, 57 ° C per 20 sec, 72 ° C per 30 sec prima 2 min a 72 ° C per 2 min e mantenimento a 4 ° C. </li><li> Normalizzare dsDNA legame colorante fluorescente con colorante fluorescente di riferimento prima di ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Preparare reazione MDA. <ol><li> Diluire i campioni come descritto al punto 8.1.1. </li><li> Preparare 11 ml di miscela maestro per campione sul ghiaccio. La miscela di maestro di reazione 2x MDA si compone di tintura 2x dsDNA vincolante, tintura di riferimento 2x, 50 micron oligo randomizzato, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA polimerasi tampone di reazione, 4.8 dNTP mM, acqua priva di nucleasi, e 40 mg / ml Phi29 polimerasi del DNA. </li><li> Aggiungere la DNA polimerasi Phi29 a 40 mcg / ml durare per garantire la polimerasi dOES non incontrare livelli di pH molto superiore o inferiore a 7,5. Mescolare bene. </li><li> Denaturare 3.3 ml di modello diluito con 3,3 ml di denaturazione tampone in una provetta qPCR. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 3.3 ml di neutralizzazione Buffer. </li><li> Combinare 10 ml di modello denaturato e 10 ml di miscela master. Mescolare bene. </li><li> Eseguire reazione MDA in macchina qPCR con il seguente programma. </li><li> Tenere a 30 ° C per 4 ore, misurare la fluorescenza ogni 7,5 min. </li><li> Inattivare a 75 ° C per 1 min. </li><li> Normalizzare dsDNA vincolante fluorescenza colorante con riferimento colorante fluorescente. Ulteriori normalizzare per la fluorescenza massima per ogni campione. </li></ol></li></ol>

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	<li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+strategies+in+the+development+and+analysis+of+molecular+biomarkers+for+personalized+medicine.">Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine.</a> Methods. 59 (1), 101-107 (2013).</li><li>Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RefSeq+microbial+genomes+database:+new+representation+and+annotation+strategy.">RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+genomic+diversity,+one+cell+at+a+time.">Dissecting genomic diversity, one cell at a time.</a> Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).</li><li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Something+from+(almost)+nothing:+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology.">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).</li><li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria.">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li><li>Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+on+a+SlipChip..">Digital PCR on a SlipChip..</a> Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).</li><li>Heyries, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megapixel+digital+PCR.">Megapixel digital PCR.</a> Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).</li><li>Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+single+DNA+molecules+into+fluorescent+magnetic+particles+for+detection+and+enumeration+of+genetic+variations.">Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).</li><li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets.">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics.">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics.">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li><li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems.">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li><li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR.">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays.">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li><li>Lage, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+genetic+alterations+in+small+DNA+samples+using+hyperbranched+strand+displacement+amplification+and+array-CGH.">Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH.</a> Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).</li><li>Dean, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell.">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe-vacuum+microfluidics:+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions.">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells.">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618 (2013).</li><li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).</li><li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G.M.+Softlithographie.">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).</li><li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification.">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).</li><li>Hindson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+hot-start+amplification+via+a+multiple+emulsion.">System for hot-start amplification via a multiple emulsion.</a> US patent. , (2014).</li><li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Saggi digitali sono potenti metodi che consentono il rilevamento di cellule rare e conteggio dei singoli di molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali non sono ancora applicati routinariamente nei laboratori di analisi, in parte a causa del costo di attrezzature specializzate associati ai metodi disponibili in commercio. Qui si descrive un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura analogico semplificata utilizzando un real-time quantitativa macchina PCR standard. Questo met...

Saggi digitali per la quantificazione degli acidi nucleici (PCR digitale) 1-4 e la base ordine (sequencing) sono fortemente incidono le scienze della vita e la medicina. Saggi digitali forniscono quantificazione dei conteggi molecolari su scala assoluta (non relativo a un controllo), fornendo l&#39;alta sensibilità, consentendo facili confronti di tutti gli esperimenti, e, soprattutto, permette la costruzione di grandi banche dati contenenti dati comparabili 5 (Tabella 1). Negli ultimi 15 anni, tutto l&#39;amplificazione del genoma (WGA) è emersa accanto PCR come uno strumento generale per l&#39;amplificazione degli acidi nucleici. Come PCR, WGA è utile per le applicazioni analitiche e preparative amplificando elementi minuto di campionamento fino a un livello che può essere facilmente individuata o utilizzati per le successive analisi, come il sequenziamento di base. A differenza di PCR, WGA non è specifico per un particolare locus DNA, piuttosto che permette l&#39;amplificazione di tutte le sequenze del campione, tra le sequenze sconosciute.Questa differenza fondamentale tra PCR e WGA rende i metodi complementari tra loro e dà luogo a diversi problemi nella loro applicazione. L&#39;alto rendimento di reazioni WGA 6 consente l&#39;amplificazione di routine di DNA genomico da molecole singole 7, celle singole 8 e altri campioni a bassa biomassa 9 per la quantificazione e ulteriori analisi. Le sfide principali associate alla WGA chimica sono la sua estrema sensibilità ai contaminanti e l&#39;amplificazione irregolare attraverso singole molecole modello 6. Tuttavia, WGA sta guadagnando popolarità come il sequenziamento di singole cellule è emerso come il &quot;killer application&quot; della tecnologia WGA 10, e il modello di quantificazione da WGA è importante in molti campi di applicazione 7. Strumentazione per il digitale quantificazione di acidi nucleici è stata precedentemente descritta in una varietà di con valvola e senza valvole forma microfluidicats 11-14, tra saggi basati gocciolina-15,16 (Tabella 2). Tuttavia, i sistemi microfluidici commerciali per l&#39;analisi digitale richiedono attrezzature specializzate per la configurazione di reazione e la rilevazione dei prodotti 17. Microfluidica personalizzati valvolati sono flessibili, ma richiedono precisione microfabbricazione e sistemi di controllo pneumatici 18. Mentre è relativamente semplice da fare monodisperse micro-goccioline di emulsione a base-saggi digitali 19,20, lettura digitale è tecnicamente gravoso, che richiede sia su larga scala di immagini a grande campo (simile alle famose tecnologie di sequenziamento di prossima generazione) o 21,22 ad alta velocità del flusso basato sul rilevamento delle gocce 23-25. Idealmente, un saggio digitale sarebbe semplice dal set-up di lettura, riducendo la necessità di strumentazione complessa e consentendo un gran numero di campioni da leggere rapidamente. Qui si descrive un metodo semplificato per la lettura dei saggi goccioline digitali che utilizza un convenzionale PCR in tempo reale iNstrument per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-. Mentre il nuovo approccio può essere applicato a PCR digitali, è particolarmente vantaggioso per le analisi WGA digitali che analogici dosaggi di amplificazione in tempo reale (che danno risultati eccellenti per PCR) sono problematici. WGA è comunemente applicato a campioni con molecole modello eterogenee in sequenza, lunghezza, e il contenuto di base. Queste diverse molecole modello vengono amplificati a tassi differenti 6, rendendo necessario l&#39;uso di un riferimento (&quot;standard&quot;) campione con caratteristiche corrispondenti. Spesso, tale standard è disponibile, o le caratteristiche dei campioni in ingresso sono sconosciute. L&#39;eterogeneità del materiale in ingresso e la proprietà lunghezza-dipendente delle farmacie WGA 26 inoltre complicare l&#39;interpretazione dei risultati creando ambiguità quanto viene quantificato - la massa di ingresso, il numero di molecole di ingresso, una combinazione dei due, o nessuno. Finalmente, la sequenza non specificità rende quantitativo spostamento amplificazione multipla (MDA) più sensibili alla contaminazione di PCR quantitativa in quanto le molecole contaminanti di qualsiasi sequenza hanno un potenziale di interferire. Saggi digitali microfluidica affrontare la contaminazione separando le molecole di modello e di ridurre i volumi di reazione in modo tale che un minor numero di agenti inquinanti vengono campionati. Qui usiamo un popolare metodo di WGA isotermico, MDA 27. Da segnalare, diversi altri chimiche WGA tra cui PicoPlex e MALBAC 28 dipendono in modo cruciale passi iniziali di spostamento isotermico filo. Passi isotermici aggravano la sfida di applicare analisi real-time quantitativa analogici per WGA. WGA può essere né impossibilitato durante l&#39;installazione, con conseguente indesiderato variabile pre-amplificazione, né discretizzato (&quot;ciclato&quot;) in un modo in cui la replica di molecole eterogenee può essere guidato a completamento e fermato prima del ciclo successivo come PCR 11 </sup&gt; (Figura 1). Un formato digitale per test WGA accoglie tipiche procedure di impostazione reazione dovuta alla segregazione di ogni molecola per il conteggio a livello di endpoint del test (in modo pre-amplificazione non influenza il risultato) di lettura originale significa accuratezza sarebbe in gran parte indipendente di variazione in termini di efficienza di amplificazione. Il dosaggio dipende goccioline nell&#39;olio con volumi uniformi, come il livello del segnale per droplet alla endpoint dosaggio dipenderà dal volume delle gocce, e non vogliamo la coerenza dei risultati dipendono da una media attraverso una distribuzione di dimensioni delle gocce. Fare goccioline monodisperse ora è una procedura standard (circa 3.500 documenti gocciolina monodisperse sono stati pubblicati dal 2013), ma richiede strumentazione microfluidica 25. In realtà, più di sei aziende hanno sviluppato prodotti commerciali indipendenti che si basano sulla produzione di tali goccioline, e chip microfluidici-gocciolina fare sonocommercialmente disponibile 23,29. Per questo studio, abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici personalizzato autoprodotti (vedi Protocol). Siringa Pompe per guidare il flusso attraverso i dispositivi sono anche disponibili in commercio, ma in alternativa, può essere sostituito con una singola siringa monouso per flusso guidato-vuoto per ridurre i costi 30.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Saggi digitali sono potenti metodi che permettono il rilevamento di cellule rare e il conteggio delle singole molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali sono ancora abitualmente applicata, a causa del costo e attrezzature specifiche associati ai metodi disponibili in commercio. Qui vi presentiamo un metodo semplificato per la lettura di saggi gocciolina digitali utilizzando uno strumento di PCR in tempo reale convenzionale per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-. Abbiamo caratterizzare le prestazioni del test lettura bulk utilizzando miscele gocciolina sintetici e digitale dosaggio gocciolina multiple displacement amplification (MDA). Quantitative MDA particolare beneficia di un formato di reazione digitale, ma il nostro nuovo metodo si applica a qualsiasi dosaggio digitale. Per i protocolli di analisi digitali affermati come la PCR digitale, questo metodo serve ad accelerare e semplificare test di lettura. La nostra metodologia di massa lettura porta i vantaggi di partitionesaggi d senza la necessità di strumentazione lettura specializzata. I principali limiti del metodo di lettura bulk sono ridotte gamma dinamica rispetto piattaforme gocciolina di conteggio e la necessità di un campione standard, anche se i requisiti di questo standard sono meno rigorosi per un esperimento in tempo reale convenzionale. Quantitative intero amplificazione del genoma (WGA) viene utilizzato per verificare contaminanti nei reazioni WGA ed è il modo più sensibile per rilevare la presenza di frammenti di DNA con sequenze sconosciute, dando il metodo grande promessa in diverse aree applicative, tra cui il controllo farmaceutico di qualità e astrobiologia.

Mentre letture di massa convenzionale / in tempo reale possono essere utilizzati sia per la PCR quantitativa e saggi WGA quantitativi (figura 1), analisi quantitative digitali forniscono vantaggi (Tabella 1). Nel metodo descritto, andremo a leggere saggi digitali in formato micro-goccia con una semplice misura endpoint bulk (Figura 2). Anche se questo metodo è ampiamente applicabile, ci si concentra sulla quantitativa WGA (MDA) perché questo metodo presenta sfide part...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

Video: Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Biologia

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ polimerizzazione saggi: protocolli semplici e considerazioni

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching come una lettura comportamentale quantitativa per il rilevamento di stimoli nocivi

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...