著者は、親切に魚の施設や線の優れたケアのためZebrabow-Mトランスジェニック系統、pDestにベクトルのジェフリー・バーンズとレニーエティエ-Daigle氏を共有するためのアレックスSchierに感謝します。 資金調達： 私たちは、シュライナーズ子ども病院から子供（ECL）とポスドク研修フェローシップのためNIDCR RO3DE024490とシュライナーズホスピタルからの寛大な資金援助（LRとYK）のために感謝しています。

マサチューセッツ総合病院施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、プロトコル番号＃2010N000106下にあるすべての手順を承認しました。これは、評価のための協会と認定研究所の動物ケア・インターナショナル（AAALAC）のガイドラインに準拠しています。 1.試薬及び材料の準備<ol><li> 50X E3胚培地の1リットルを準備した （表2 を参照してください）（ 表1を参照 ）と1XのE3胚培地の1リットルを準備します。 </li><li> 1X E3 1LにPTU 30mgを追加することにより、N-フェニルチオ尿素（PTU）とのE3胚培地を準備します。 PTUが完全に溶解していることを確実にするために、O / Nをかき混ぜます。室温で保管してください。 </li><li>プロナーゼ溶液を調製するには、1X E3 15mlでプロナーゼ150μlの（0.5 mg / mlの）を希釈します。この量は、1ペトリ皿に十分です。すぐに使用してください。 </li><li>メチルセルロース溶液を調製します。 <ol><li> 25 mlの0.2％トリカイン75mlのを混合することによりE3-トリカイン溶液を調製します1X E3の。 E3-トリカイン液75mlの中にメチルセルロースの3グラムを煮。 </li><li> E3-トリカイン溶液で100ミリリットルの最終容量をアップしてください。最終メチルセルロース溶液は粘性と黄色がかった色合いで不透明です。ストレージ：RTは、光から保護。 </li></ol></li><li>タモキシフェンストックと誘導ソリューション<ol><li> 4-ヒドロキシ100％エタノールに溶解することにより5mMのにタモキシフェンのストック溶液を調製します。 -80℃での店舗在庫。 </li><li>誘導溶液を得1X E3で欲求濃度でタモキシフェンの新鮮な希釈を準備します。注意！使用前にMSDSを参照してください。 </li></ol></li><li> 表3の通り0.2％トリカインの1リットルを準備します。 </li><li>共焦点スライドを入手します。ブロックを形成するために一緒に4カバーガラス（18×18）を接着した後、中盤の胚の取​​付けできるように2センチメートル離れて24×60カバーガラスの上に2ブロックを配置します。 </li></ol> 2.胚の準備<ol><li>トランスジェニック系統。 <br/&gt;注：Zebrabow-MはアレックスSchierの研究室からの寛大な贈り物でした。 </li><li> SOX10：ERT2-Creを 注：標準的な分子クローニング法を用いて、ERT2-Creをし、商業的にクローン技術を組換えを得た：ターゲティングベクターpDestTol2- SOX10を生成します 。 <ol><li>レンズ先とのLR反応にエントリークローン（pENTR3&#39;-ポリA）を組み合わせ、5 &#39;SOX10プロモーターの 7.2Kb、ゲートウェイミドルクローン（PME-ERT2-CRE）、および3を含むエントリークローン（pENTR5&#39;- sox10p）」ベクトルpDestTol2-αクリスタリン ：YFP。 </li><li>構造物を精製pDestTol2- SOX10：ERT2-Creを。 1細胞期のWT胚（F0）にTol2のトランスポザーゼのmRNA（50 ngの/μL）で精製した構築物（100 ngの/μl）を共同注入。 </li><li> F1胚において、強い黄色の蛍光に基づいて、生殖系列伝達のための画面F0大人の創設者。 </li></ol></li><li> SOX10：ERT2-のCre; Zebrabow-M <ol><li> Zebrabow-Mを異系交配ERT2-Creをトランスジェニックライン：SOX10と行（2.1.1）。 </li><li>強いユビキタスRFPの発現とYFPレンズマーカを示す胚を選択して、大人になるまで、それらを育てます。 </li></ol></li></ol> 3.胚コレクション<ol><li> SOX10のいくつかのペアに設定しますERT2-Creをし、1日目の午後5時までと午後6時間のZebrabow-Mトランスジェニックゼブラフィッシュ。 </li><li>次の日は、午前中に仕切りを引き出し、正午頃卵を集めます。 </li><li>ペトリ皿や胚をdechorionateするプロナーゼ溶液15mlを追加し、それらを転送します。 </li><li>胚の約60％がdechorionatedされるまで、1〜5分間胚を培養します。プロナーゼ液をデカントすることによって反応を停止し、新鮮なE3培地で胚を3〜4回​​洗浄します。 </li><li> RT O / NでE3でdechorionated胚をインキュベートし、それらを10体節段階に到達するために開発してみましょう。異なる発達成長を回避するために、クラッチごとに50〜60の胚をインキュベートします。 </li></オール&gt; 4.治療<ol><li>彼らは10体節段階であることを確認するために、光照射野顕微鏡下で胚「発達段階を確認してください。 </li><li>赤色蛍光タンパク質（RFP）フィルター付き蛍光顕微鏡を使用して、明るい赤の胚を分離します。 </li><li>ペトリ皿にヒドロキシタモキシフェン溶液10μMを添加し、3時間28.5℃で分離された胚を培養することによってのCre組み換えの誘導に進みます。 </li><li>タモキシフェンソリューションをデカントし、E3で胚を数回洗浄します。 注意！特別な生物学的廃棄物容器内のタモキシフェンのソリューションを捨てます。 </li><li> 28.5°のCO / Nで胚を培養します。 </li><li>胚が約28〜29体節期（24時間の周り受精後）である場合には、E3-PTUソリューション以下で28.5℃で胚を培養します。 注：PTUは、ここで発生中の胚に黒色素胞の形成を阻害するために使用されます。この処理はする必要があります自動蛍光色素胞によって蛍光の信号の歪みを避けます。 </li><li> 28.5℃で胚をインキュベート</li></ol> 5.胚の選択<ol><li>完全に開発された頭蓋顔面構造を可視化するために、レッド信号とのCre発現マーカー陽性（網膜の黄）の強度を4日後に受精で胚を選択します。 </li><li> E3 / 0.015％のトリカイン溶液で胚を麻酔。麻酔を穏やかに胚をつついたときにアクティブな動きやフィン活動が観察されないときに確認されました。 </li></ol> 6.メチルセルロースで胚をマウントします<ol><li>メチルセルロースの低下を含むペトリ皿にイメージングのために選択された胚を移し、優しくメチルセルロースで胚を防腐処置を施します。 </li><li>きれいな共焦点のスライドでは、新鮮なメチルセルロースの低下を置き、microloaderチップを使用して、ドロップ以内に胚をマウントします。触れないように注意を取って位置胚背側直接胚。 </li><li> 25×25カバーガラスを搭載した胚をカバーし、必要に応じてカバースリップを操作することにより、胚の位置を調整します。 </li><li>胚は今画像に準備ができています。 </li></ol>蛍光顕微鏡による7.分析<ol><li>胚を集束させるため、20倍のドライレンズ対物レンズ（ピンホールサイズ2.0μmの開口数0.75）を使用します。 </li><li>顕微鏡のL100ボタンを押して、ソフトウェアでチャンネルを選択します。 </li><li>共焦点セットアップボタンを選択し、「自動」をクリックしてウィンドウを閉じる前に、次のチャンネルを選択：Ch1の：CFP、CH2：GFP、CH3：RFPまたはmCherryを</li><li> 「インターロックを削除」ボタンをクリックする前に、CH2およびCH3をオンにします。スキャンを開始するには「プレイ」をクリックしてください。 </li><li>所望の画質がACになるまで最高の½フレーム/秒、高電圧（HV）150から開始し、それに応じて設定を調整することによって行われ、関心の構造に焦点を当てますhieved。 RFPは、したがって、HVを調整し、他の色よりも明るくなります。 YFPおよびRFP陽性細胞の両方を見つけるZ位置を変更します。 </li><li>設定で設定したら、あなたの胚の画像をキャプチャします。各分割チャネルにおける画像処理のための共焦点イメージングソフトウェアの形式やTIFF形式で画像を保存します。 </li><li>次に、CFPイメージングのため、CH2およびCH3をオフにして、Ch1をオンにしてください。フォーカスエリアを変更することなく、ステップ5のように設定を再調整します。 注：CFPは、ピンホールのサイズを調整することで回避することができる青チャネルでバックグラウンド信号による検出するのは本当に難しいことができます。大きなピンホールの大きさは、シグナル/バックグラウンドノイズ比を低減することにより、蛍光のより良い検出を可能にします。しかし、大きなピンホールは、画質を犠牲にすること、共焦点効果を減少させます。そのため、設定の慎重な調整が所望の画質と強度を達成するために必要とされます。 </li><li>画像をキャプチャし、フォーマット（共焦点ソフトウェアとTの両方に保存します画像処理用のIFF）。画像はその後、層を結合し、パンと8らによって記載されているように、カラーの設定を改善するために、一般的な画像処理ソフトウェアを用いて処理することができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

アルシアンブルーとphotoconvertibleトランスジェニック系統前述したように、軟骨と骨の発達の複雑なプロセスを定義するためにお互いを補完します。しかし、器官形成時のライブ細胞移動および組織が長く仮定し、間接的に実証されたが可視化されませんされています。軟骨特定のCreと相まってZebrabow-Mトランスジェニックラインは、骨および軟骨形成に関与するすべてのこれらの個別のイベ?...

頭蓋顔面の開発は、細胞増殖、遊走および分化1,2、3を駆動するための複雑な分子、細胞および組織の相互作用を必要とします。この厳密に調節し、複雑なプロセスは、頭蓋顔面奇形は、最も一般的な先天性奇形1-9中にあるように、遺伝的および環境的摂動の対象となります。外科的介入は、開発の基礎を理解し、頭蓋顔面異常を治療の中心残っているが、将来の治療法を革新することが不可欠です。したがって、収束と拡張および細胞統合における形態形成および機構を研究することは、頭蓋顔面の骨格1の形成に新たな洞察を提供しています。 頭蓋神経堤は、下顎をprefiguresメッケル軟骨を形成するために、拡張ペアの下顎のプロセスを形成した後、最初の咽頭弓を移行し、移入します。形態形成Oメッケル軟骨F方向性増殖、細胞分極と分化1,10を経由して軟骨細胞組織を必要とします。しかし、メッケル軟骨の成長と拡張に軟骨細胞組織の複雑さは不明なままです。動的な細胞の挙動を理解することは、このような形成不全下顎の表現型11と下顎の大きさに影響する先天性奇形を、理解するために重要です。 ゼブラフィッシュの胚はメッケル軟骨の形態形成の詳細な研究のための多くの発達と遺伝的利点を提供します。彼らの遺伝的扱いやすさ、透明性、ex vivoでかつ急速な発展は、ライブイメージング6による細胞運動と組織の観察のためによく、それを貸し強力な利点です。そのようなSOX10などの系譜トレースツール、 使用 ：楓トランスジェニック系統を、私たちと他の人は、胚の頭蓋顔面の骨格1,5の神経堤起源を描写しています。 USIUBIでERT2-Creを：SOX10 ngを Zebrabow-Mトランスジェニック系統は、頭蓋顔面の開発中の細胞の動きを詳細に探索することが可能になりました。 Zebrabow-Mは、異なる蛍光体の発現を駆動するユビキチンプロモーター、lox部位8が隣接し、それぞれに操作されたトランスジェニックラインです。 Zebrabow-Mのデフォルトのフルオロフォアは、RFPを発現し、レッドです。 Cre発現の誘導後、Zebrabow-Mは、再結合を構築し、細胞が胚におけるマルチスペクトル式を作成する異なる蛍光体（RFP、CFPとYFP）の組み合わせを発現します。別の並置された前駆細胞に由来する細胞集団がクローンラベル付けされるように、再結合イベントの後に標識された細胞から分裂し、すべての娘細胞は、その後、クローン、標識されています。このクローン細胞標識によって、クローンの解像度を有する細胞の増殖及び遊走（図1 及び2）に従うことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

脊椎動物頭蓋顔面構造の開発は、細胞遊走、増殖、接着および分化の正確な調整が必要です。メッケル軟骨のパターニングは、まず咽頭弓誘導体は、頭蓋神経堤（CNC）細胞およびプログレッシブパーティショニング、増殖および分化した軟骨細胞の組織の移行を伴います。いくつかの研究は、下顎の形態形成時にCNCの移行を説明しているが、軟骨細胞はメッケル軟骨の成長と拡張に組織を達成する方法の詳細は不明なままです。 SOX10制限され、化学的にCreリコンビナーゼ媒介組換えを誘発され、それによって別個のクローン集団を反映して、前駆細胞およびその子孫のマルチスペクトルラベルを作成し、個別の蛍光タンパク質（RFP、YFPとCFP）の順列を生成します。共焦点タイムラプス撮影を使用して、軟骨細胞を観察することが可能であるbehaviまたはゼブラフィッシュメッケル軟骨の開発中。 マルチスペクトル細胞標識は、メッケル軟骨細胞の拡張を実証するために、科学者を可能にします。下顎をprefiguresメッケル軟骨の延長フェーズでは、軟骨細胞は、彼らが組織的単細胞層状の列にスタックとして延長をもたらすためにインターカレートします。細胞伸長を媒介するこの組織的インターカレーションプロセスの失敗は、私たちは下顎の奇形で観察形成不全下顎のための細胞機構的説明を提供します。

ホールマウントアルシアンブルー汚れによる伝統的軟骨の可視化は、開発メッケル軟骨を観察し、一般的に、最終的な細胞の組織12（ 図1A）を視覚化するために使用非常に貴重となっています。さらに系統は、SOX10を使用してトレース、残業開発軟骨細胞を分析するには：楓トランスジェニック系統は、ライブ胚2,12（ 図1B）で細胞遊走、...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckelâ€™s Cartilage at JoVE.

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで イメージングは​​、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K ビュー.  Harvard Medical School. 頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで イメージングは​​、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における?...

ビデオ: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

発生生物学

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ<em&gt;インビトロ</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...