Name: bioluminescence imaging of an immunocompetent animal model for glioblastoma
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma at JoVE.com

We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.

以下で説明するすべての手順を見直し、ノースウェスタン大学の施設内動物の使用およびケア委員会によって承認され、滅菌条件下で実施されているされています。 ホタルルシフェラーゼを発現するレポーターでGL261細胞の1変更注：HIV-1ベースのレンチウイルスベクターは、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ（Fluc細胞）を発現します。光学レポーター遺伝子は、ベクタープラスミドpHRSIN-CSGW-dlNotIにクローニングされています。 <ol><li> 95を含有する加湿雰囲気中、37℃で、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したRPMI培地中で、10％ウシ胎児血清（FBS）およびGL261細胞を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で293-T細胞を維持します％の空気と5％の二酸化炭素（CO 2）。 </li><li> 293-T細胞培養物は、T-75フラスコ中で80％コンフルエントに達したときに、pHが一度細胞を洗浄Ca2 +およびMg2 +をなしosphate緩衝生理食塩水（PBS）、フラスコを保持することにより、5 mlのピペットで粉砕物がわずかに傾斜し、5分間37℃でトリプシン3mlの（0.05％）で細胞をインキュベートし、すべての細胞を回収フラスコの底から。 15 mlのコニカルチューブにトリプシン処理細胞懸濁液を3mlの転送、及び肉の7 mlのRPMI培地（細胞懸濁液を10mlの合計）を加えます。 </li><li> 5ミリリットルピペットでよく細胞懸濁液を混ぜます。チューブからの100μlの細胞懸濁液を取り、血球計数器を用いて細胞の数を数えます。これを行うには、トリパンブルー溶液300μlの細胞懸濁液100μlを混合し、血球計数器に混合物を2μlを挿入します。顕微鏡下で4つの別々のビューからブルー染色することなく、細胞数をカウントします。この数は、10 4細胞/ mlを表すように、各ビューからの細胞数を平均化します。 </li><li>一方、30で細胞懸濁液の入ったチューブを遠心分離7分間0 XG。培地を吸引し、1.0×10 6 / mlの密度でGL261細胞懸濁液を作製するために、新鮮なRPMI培地で細胞ペレットを再懸濁します。 27.5ミリリットルのDMEM（1日目）とT-175フラスコにRPMI培地の2.5 mlの種子2.5×10 6 GL261細胞。 </li><li> 24時間後、20ミリリットル新鮮なDMEM（2日目）で培地を交換してください。 </li><li>レンチウイルスベクターを製造するために、5分間の2ミリリットルの無血清DMEMで54μlのトランスフェクション試薬を混ぜます。トランスフェクション試薬を含むDMEMにギャグ-POLの3μgの、水疱性口内炎ウイルスGエンベロープ（VSV-G）の3μgの、およびFluc細胞の4.5μgの（PSIN-Fluc細胞）を追加し、室温で20分間インキュベートします。 293-Tフラスコ（T-175）に全体のDNAの混合物を落とし、48時間（2日目）、95％空気および5％CO 2を含む加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。 </li><li> （3日目）（約30 mlであるべきである293-T細胞培養培地の全体積）トランスフェクション後24時間で新鮮なDMEMを10mlを加えます。 </li><li> GL261細胞を分割するには24ウェルプレート、フラスコを保持することにより、5 mlのピペットで粉砕物がわずかに傾斜し、5分間37℃でトリプシン5mlの（0.05％）で細胞をインキュベートし、のCa2 +およびMg2 +を含まないPBSで細胞を1回洗浄、フラスコの底からすべての細胞を採取し、ステップ1.2のように血球計数器を介して細胞をカウントします。一方、7分間300×gでチューブを遠心します。培地を吸引し、2.5×10 4 / mlの密度でGL261細胞懸濁液を作製するために、新鮮なRPMI培地で細胞ペレットを再懸濁します。シード2.5×10 24ウェルプレート（3日目）でRPMI培地1mlの4 GL261細胞。 </li><li> 48時間後、トランスフェクションで293-Tフラスコ（T-175）から10 mlピペットでレンチウイルス上清の30ミリリットルを収集し、50mlコニカルチューブに上清を移します。吸引し、50mLの注射器を経由して30ミリリットルレンチウイルス上清、0.22μmのシリンジフィルターを通して、及び1mlアリコート（4日目）にウイルス上清を分取します。 </li><li> Rの1ミリリットルを交換PMIのレンチウイルス上清1mlでGL261細胞プレート（24ウェル）中の培地と加湿チャンバー（4日目）に、37℃でインキュベートします。 </li><li>レンチウイルス感染の48時間後、新鮮なRPMI（6日目）の1mlで培地を交換してください。 </li><li> 24時間後、GL261細胞（7日目）のレンチウイルス感染を繰り返します。 </li><li>レンチウイルス感染の2 番目の 48時間後、新鮮なRPMI（9日目）1mlの培地を交換してください。 </li><li>修飾されたルシフェラーゼGL261細胞を成長し続ける（GL261.lucセルと呼ぶことにする）と、T-75フラスコに細胞培養物を拡張します。 </li><li> GL261.luc細胞培養物は、T-75フラスコ中で70％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理により細胞を回収し、工程1.2と同様に血球計数器によりカウントします。卒業密度で24ウェルプレートにGL261.luc細胞をプレート（1.0×10 6 5.0×10 5、2.5×10 5、1.0×10 5、5.0×10 4、2.5×10 4細胞 /ウェル）、 humidiで37℃でインキュベート3時間、95％空気および5％CO 2を含む fiedがチャンバ。 </li><li>細胞のルシフェラーゼ活性の相対測定は、生物発光イメージング（ 図1）を使用して、U-87 MG（U87.luc）細胞を改変ルシフェラーゼします。 <ol><li> （デスクトップ上のアイコンをクリック）画像ソフトウェアを起動し（「初期化」ボタンをクリックします）イメージング・システムを初期化します。初期化が自動的に開始され、システムチェックアップと-90℃に冷却するカメラのいくつかの分かかる場合があります。 </li><li>各ウェルにルシフェリン25μlの（D-ルシフェリンカリウム塩、150mgの/キログラム）を追加します。 </li><li> 10秒間、プレートを室温で1分間、ルシフェリンと画像で細胞をインキュベートします。イメージング・システムを設定するには、「発光」、「10秒」の露光時間、および「中」ビニングを選択します。イメージングステーションの24ウェルプレートを配置し、画像を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。 </li><li>画像が正常に取得されたら、画像ウィンドウとツールPAが表示されます画面上レット。 「ROI（関心領域）ツール」をクリックして、スリットのアイコンから6×4を選択します。 24ウェルプレートの画像上の信号の領域をカバーし、測定タブ（鉛筆のアイコン）をクリックし、6×4のスリットを作成します。平方cm当たりステラジアンあたり毎秒光子（フォトン/秒/ SR / cm 2）での単位として、ROIの測定値のテーブルと窓を観察します。 </li><li>以前GL261ためにここで使用したものと同じで修飾されたレンチウイルスの使用U87.luc細胞は、形質導入GL261.luc細胞におけるルシフェラーゼ活性を評価するための対照として、11を変形しました。 </li></ol></li></ol> インビトロ増殖アッセイ2. <ol><li> GL261とGL261.luc細胞培養物は、T-75フラスコ中で70％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理により細胞株の両方を収穫し、ステップ1.2のように数え、1500細胞の密度で96ウェルプレートにプレート細胞よく時間ピペッティング誤差を最小化するためにマルチチャンネルピペットを使用してあたりRPMI培地80μlの。セED 20ウェルの合計に各細胞株。細胞によって取り込まウェル中の蒸発を制限するために、新鮮なRPMI培地100μlの空のウェルを埋めます。 </li><li>比色細胞増殖アッセイを使用して細胞増殖を評価します。ここでは、MTS細胞増殖アッセイを使用しています。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに20μlのMTS試薬を加えます。 </li><li> 3時間、95％空気および5％CO 2を含む加湿チャンバー中、37℃でプレートをインキュベートします。マイクロプレートリーダーを用いて490nmで吸光度を測定します。これはプレーティング後、1日目、2、4、および7で繰り返されます。吸光度値を正規化するために、毎日の値は、1日目（ 図2）で得られた対応する測定値で割ます。 </li></ol> 3.腫瘍細胞移植注：すべての機器をオートクレーブ。消毒剤（2％クロルヘキシジン溶液）を噴霧することにより、手術領域を準備し、absorbenでカバートンのカーテン。 、無菌状態を維持する手術中に無菌手術用手袋を着用し、色のテープで2つの領域に手術領域を分割するために。エリア1は、「クリーン」と表示された、滅菌供給を含んでいます。エリア2は、「ダーティ」と表示されたと使用される材料が含まれています。 <ol><li>動物の手術の前に、頭蓋内注射用の細胞懸濁液を準備します。 70％コンフルエントのT-75フラスコをトリプシン処理することにより、ステップ1.2のように血球計数器を介して細胞をカウントし、Ca 2+をすることなく、ハンクス平衡塩溶液中に1.0×10 5細胞 /μLの濃度で細胞懸濁液を作り、から収穫細胞Mg 2+を（HBSS）。 </li><li> 0.9％生理食塩水でキシラジンのケタミンを100mg / kgおよび10mg / kgを含む200μlの混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。適切な麻酔を確認するために、マウスのつま先をつまみます。マウスが完全に麻酔下であれば、マウスが刺激に応答すべきでありません。 </li><li> 0.1メートルの管理皮下注射によりグラム/ kgのブプレノルフィンは、術後の痛みを緩和します。 </li><li>バリカンを使用して、動物の頭の上を剃る、2％クロルヘキシジン溶液に浸漬綿チップアプリケーターで清掃してください。手術中に適切な潤滑を維持するために、眼軟膏を適用します。 </li><li>滅菌メスを用いて、頭頂後頭部の骨の上に約1cmの長矢状切開を行います。ブレグマを視覚化するために、3％過酸化水素水に浸した綿チップアプリケーターで頭蓋骨の表面を拭きます。 </li><li>ブレグマの右に、ちょうど冠状縫合の後ろに小さな穴3ミリメートルを作るために、無菌の25-G針で頭蓋骨をドリル。 </li><li>頭蓋内注射部位は頭蓋骨から3mmの深さにあることを確実にするために、はさみを使用して、20μlのピペットチップの先端から3ミリメートルをカットし、ピペット先端に注射器を挿入します。 </li><li>以前に作成した穴に垂直に注射器を挿入し、ゆっくりと腫瘍細胞のSUSを注入1分間かけて3μlのHBSS中3.0×10 5個の細胞を含む年金。別の分の場所にある針のままにして、ゆっくりと針を引き抜きます。 </li><li> 3％過酸化水素と2％クロルヘキシジン溶液に浸した綿先端アプリケーターで頭蓋骨を綿棒。綿チップアプリケーターで頭蓋骨の表面を乾燥させます。サイズは3約3ミリメートル無菌骨ワックスを切り出し、綿先端アプリケーターの端側の骨ろうを添付します。綿チップアプリケーターで穴をカバーするために、骨のワックスを適用します。 </li><li>ピンセットを用いて頭蓋骨の上に一緒に頭皮の各側面を描き、ステープルは、創傷を閉鎖します。 2％クロルヘキシジン溶液に浸漬綿チップで傷をきれいにしてください。 </li><li>彼らは歩行になるまで手術後、すべてのマウスを監視し、正常な活性を保持しています。典型的には、回復時間は約30分です。彼らは完全に麻酔から回復するまで、他の動物とのケージにマウスを返しません。 </li></ol><ol><li>清潔なペーパータオル上の消毒剤の寛大な量（0.05％ジメチル塩化アンモニウム溶液）をスプレーしてください。徹底的に動物がデバイスと接触するイメージング室内の黒いシート、ノーズコーンと分周器を拭くために消毒剤に浸したペーパータオルを使用してください。徹底的にきれいな乾いたペーパータオルですべての表面を拭いてください。もう一度これを繰り返し、5分間待ってください。 </li><li>ステップ1.14.1のように画像形成ステーションを初期化します。 </li><li>腹腔内注射によって、ケタミン/キシラジン200μlのルシフェリン100μlの（D-ルシフェリンカリウム塩、150mgの/キログラム）を含む300μlの混合物を用いて、マウスを麻酔。 </li><li>注射後10分待ってからマウスが尾をつまんで麻酔下で完全にされているかどうかを確認。イメージング・システムを設定するには、「発光」、「オート」、露光時間、および「中」ビニングを選択します。イメージングstatiにマウスを置きますで、画像を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。注射後の時間は、各撮像セッションと一致していることを確認してください。 </li><li>画像が正常に取得した後、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。 「ROIツール」をクリックして、サークルのアイコンから「自動」を選択します。関心領域を定義するには、画像上の信号の面積を取り囲む、その後SR光子/秒/ / cm 2の単位として、ROIの測定を行います。 </li><li>画像化チャンバの外にマウスを取り、彼らは歩行になるまでマウスを監視し、正常な活性を保持しています。典型的には、回復時間は約15分です。彼らは完全に麻酔から回復するまで、他の動物とのケージにマウスを返しません。 </li><li>体重減少（移植前の重量に対して20％以上の損失が相対的）、食欲不振（24時間のための完全な拒食症）、および持続的なpurposefuの欠如：動物は、以下の症状を提示するまで、週に二回生物発光イメージングによって腫瘍の成長を監視彼らは安楽死させるべき時に穏やかな刺激（最大得るために弱い試み）にL応答。頸椎脱臼に続いてCO 2チャンバーを用いて、これらの症状を有する動物を安楽死させます。 <ol><li>場所の安楽死室へのマウス（過密ないチャンバーを行う）と流入は5-6分間のCO 2を圧縮しました。すべての動物は、約5分後に呼吸無意識とではないことを確認します。 </li><li>チャンバからマウスを取ります。心臓は親指と人差し指の間に胸を感じによって暴行されていないことを確認し、全く点滅反射がないことを確認してください。 </li><li>平らな面に発生しやすい位置にマウスを拘束し、親指と他の手の人差し指と尾の片手と塩基と頭蓋骨の基部に首の後ろを把握します。 </li><li>頭部を拘束し、素早く後方尾を引きます。頭蓋骨は、親指と人差し指を使用して第1頸椎から分離されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>ノームステップ2.3（ 図3A）のように生物発光イメージングの最初の日で得られた対応する測定値に対する毎日のアリゼの発光値。 </li><li>統計分析のために、カプラン-マイヤー推定量12を用いて、生存曲線を生成し、ログランク検定を使用して、13生存曲線間の差を比較します。 </li></ol>

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There are no conflicts of interest to disclose.

同系の免疫応答性C57BL / 6マウスに頭蓋内に移植された場合のGL261マウス神経膠腫細胞は、ヒト神経膠腫異種移植動物モデルと比べていくつかの利点を提供します。異種移植腫瘍の多くは正確に浸潤性ヒト疾患を再現しないカプセル化された病変として成長。これとは対照的に、GL261腫瘍は、隣接する脳内に侵入するのを示しているだけでなく、血管新生、有糸分裂像、そして深い壊死7。腫瘍免疫学や免疫療法15、16を研究するとき最も重要なのは、C57BL / 6マウスは、完全な免疫系8を保持しています。以前の研究では、ヒト膠芽腫9、10に類似の免疫抑制T制御細胞を含む免疫抑制サイトカインTGF-βおよび頭蓋内腫瘍の強い発現を示しています。 ここで説明する簡単な方法は、GL261細胞によるルシフェラーゼの安定な発現を可能にします。我々は最近、シミを報告していますin vitroおよび GL261細胞と比較GL261.luc細胞の in vivoでの成長のLARは、同様の腫瘍の組織学的特性および免疫細胞に加えて17を浸透させます。 GL261.luc細胞を安定光子、従って検出可能な光に化学エネルギーに変換する基質ルシフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼを発現します。ルシフェリンは、安全に動物に投与し、腹腔内または静脈内注射後に血液脳関門を通過することができます。マウスのような小型の研究動物において、生物発光は、非侵襲的な方法11で外部から検知することができます。したがって、腫瘍増殖が直列動物の犠牲または高価なMRIまたはCT撮影を必要とせずに評価することができます。 プロトコルにおける重要なステップは、レンチウイルス形質導入だけでなく、任意のin vivo実験を開始する前に、in vitroでのルシフェラーゼの安定な発現の検証だけでなく、を含みます。伝達の損失がrequiがありリピートレンチウイルス感染の再。発現ベクターへの抗生物質耐性遺伝子の導入はまた、ルシフェラーゼ発現について選択するために使用することができます。細心の技術は、再現性の異なる治療群の比較を可能にするために正確な解剖学的位置における細胞の一貫した数を配置するために頭蓋内注入のために必要とされます。現在の研究およびルシフェラーゼを発現するGL261細胞の以前の研究の主な違いは、定位フレーム18の使用と比較して細胞を移植するためのフリーハンドの技術を使用することです。我々は以前フリーハンドテクニック19と整合注入の結果を示しました。フリーハンド技術の利点は、異なる治療薬のハイスループット分析を実行する能力です。私たちの手では、1時間で約60匹の動物を移植することができます。 技術を習得した後、技術の将来のアプリケーションは無限です。 GL261 demonstrとして有糸分裂のATE上昇し、ヒト膠芽腫に類似の腫瘍の急速な成長は、抗増殖治療を評価することができます。 GL261腫瘍は浸潤性及び血管形成であると同様に、抗浸潤および抗血管新生療法を使用することができます。人間のターゲットに向けた化学療法剤の効果を評価する際には注意が必要です。ルシフェラーゼ20を発現するヒト神経膠芽腫異種移植片を用いた以前の研究と比較すると、これは我々のモデルの限界と考えられます。また、腫瘍増殖の免疫療法戦略の効果は、GL261異種移植モデルで試験することができます。

Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4. 
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10. 
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Gold Biotechonology</td><td>LUCK-100</td><td>Store away from light</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>24-well; Standard tissue culture; flat-bottom</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>none</td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>none</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Control substance</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>none</td></tr><tr><td>28G Needle (with syringe)&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA Insulin Syringe</td></tr><tr><td>2% Chlorhexidine</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>AKA &amp;ldquo;Nolvasan&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>3% Hydrogen Peroxide</td><td>Fisher</td><td>H312P-4</td><td>Store away from light</td></tr><tr><td>Ophthalmic Ointment</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA &amp;ldquo;Akwa Tears&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 needle</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>none</td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Feather</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>none</td></tr><tr><td>Skin Stapler, Staples, Remover</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>none</td></tr><tr><td>PDI Alchol Prep Pads</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>none</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Remover</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>none</td></tr><tr><td>Single Ended Round Tip Swab with Wood handle</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>none</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>none</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>none</td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>599864</td><td>none</td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of an immunocompetent animal model for glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

インビトロでの生物発光イメージングのステップ 1で上述したようGL261細胞は、レンチウイルスを含むルシフェラーゼに感染させたヒト神経膠芽腫細胞株U87.luc陽性対照（ 図1）におけるレベルに類似ロバストルシフェラーゼ発現を示しています。予想されたように、非感染GL261細胞は、バックグラウンドのルシフェラーゼ発現を示さありません。このステップは、前の安定したルシフェラーゼ発現を確認するために、感染した細胞株を用いてさらに研究するために実行する、シンプルでありながら非常に重要です。 頭蓋内注入後のルシフェラーゼ発現。 頭蓋内注入前に、GL261細胞（ 図2）に比べGL261.luc の in vitroでの成長率に差を示さありませんでした。頭蓋内の増殖および生存分析のために、細胞を、BRに注入しましたGL261.luc腫瘍を有するマウスのステップ3腫瘍の増殖プロトコルに従ってC57BL / 6マウスのAINSはシリアルプロトコル手順4を用いて、生物発光イメージングのために分析し、検出可能な腫瘍増殖（ 図3A）を実証しました。迅速かつ一貫GL261.luc腫瘍を有するマウスは、瀕死状態になり、安楽死させました。重要なことには、GL261.luc動物軸受GL261腫瘍（ 図3B）との間の全体的な生存率の差はない。 インビボでの生物発光イメージングは、それ故、実験神経膠芽腫の治療に対する応答をモニターするために使用することができます。迅速な信頼性の腫瘍増殖及び短い全生存期間は、比較的短い時間で大量のデータを得ることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> GL261.luc細胞図1.ルシフェラーゼ活性。U87.luc、GL261.lucとGL261（ネガティブコントロール）細胞はの密度でプレーティングしました1.0×10 6、5.0×10 5、2.5×10 5、1.0×10 5、5.0×10 4、2.5×10 4細胞/ウェル、左から右へ。発光（光子/秒/ SR / cm 2）とルミナイメージングステーションで測定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> 図2.ルシフェラーゼ発現は、GL261細胞の増殖には影響を与えません。GL261.luc細胞は発生しません MTS細胞増殖アッセイによって実証されるように、増殖の差。平均吸光度値を比較することによって決定されるように、グラフは、1日目に比べて倍の増加を示し、（1日目での平均値にthespecified時点の比較のための不対のt検定値（平均±SEM）各細胞株の間で：P = 0.7796）、14。エラーバーは、それぞれの日に四連のサンプルの平均値（平均±SEM）を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> 図3.ルシフェラーゼ発現は 、in vivoでの 腫瘍増殖および動物の生存 に影響を与えない用量 。 （A）生物発光の監視、C57BL / 6マウスにおける頭蓋内GL261.luc腫瘍の進行成長を示している。（B）のカプラン・マイヤー生存分析は、GL261（実線）またはGL261.luc細胞のいずれかで頭蓋内に移植したマウスの全体的な生存率に差は示さありません（破線）。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

bioluminescence-imaging-an-immunocompetent-animal-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K ビュー.  University of California San Francisco. GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

ビデオ: Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

神経科学

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

医学

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting immunodeficient mice subcutaneously with cancer cells and measuring the tumor mass after it becomes visible and palpable. Orthotopic injections of cancer cells aim to introduce the xenograft in the microenvironment that most closely resembles the tissue of origin of the tumor being studied. Brain cancer research requires intracranial injection of cancer cells to allow the tumor formation and analysis in the unique microenvironment of the brain. The in vivo imaging of intracranial xenografts monitors instantaneously the tumor mass of orthotopically engrafted mice. Here we report the use of fluorescence molecular tomography (FMT) of brain tumor xenografts. The cancer cells are first transduced with near infrared fluorescent proteins and then injected in the brain of immunocompromised mice. The animals are then scanned to obtain quantitative information about the tumor mass over an extended period of time. Cell pre-labeling allows for cost effective, reproducible, and reliable quantification of the tumor burden within each mouse. We eliminated the need for injecting imaging substrates, and thus reduced the stress on the animals. A limitation of this approach is represented by the inability to detect very small masses; however, it has better resolution for larger masses than other techniques. It can be applied to evaluate the efficacy of a drug treatment or genetic alterations of glioma cell lines and patient-derived samples.

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Orthotopic intracranial injection of tumor cells has been used in cancer research to study brain tumor biology, progression, evolution, and therapeutic response. Here we present fluorescence molecular tomography of tumor xenografts, which provides real-time intravital imaging and quantification of a tumor mass in preclinical glioblastoma models.

膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

がん研究

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの</emマウス神経膠腫の>生物発光イメージング

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

免疫・感染学

2P-IVMを用いた脳腫瘍内ナノ粒子のマウスリアルタイム追跡

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the accumulation and distribution of macromolecules in brain tumors in vivo would greatly enhance our ability to understand and optimize drug delivery in preclinical models. This protocol describes a method for real-time in vivo tracking of intravenously administered fluorescent-labeled nanoparticles with two-photon intravital microscopy (2P-IVM) in a mouse model of glioblastoma (GBM).
The protocol contains a multi-step description of the procedure, including anesthesia and analgesia of experimental animals, creating a cranial window, GBM cell implantation, placing a head bar, conducting 2P-IVM studies, and post-surgical care for long-term follow-up studies. We show representative 2P-IVM imaging sessions and image analysis, examine the advantages and disadvantages of this technology, and discuss potential applications.
This method can be easily modified and adapted for different research questions in the field of in vivo preclinical brain imaging.

著者スポットライト:膠芽腫治療における薬物送達と早期発見を最適化するためのマルチモーダルイメージング戦略

We present a novel approach for two-photon microscopy of the tumor delivery of fluorescent-labeled iron oxide nanoparticles to glioblastoma in a mouse model.

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウス神経膠芽腫における画像誘導治療送達のための酸化鉄ナノ粒子

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:膠芽腫治療のための酸化鉄ナノ粒子による革新的ながん治療

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

要約

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生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの生物発光イメージング

定位頭蓋内注入と

生物発光細菌のイメージング

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達