Name: bioluminescence imaging of an immunocompetent animal model for glioblastoma
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma at JoVE.com

We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.

Tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale uso di animali e del Comitato di cura presso la Northwestern University e sono stati condotti in condizioni sterili. 1. Modifica delle cellule GL261 con Firefly luciferasi Esprimendo Reporter NOTA: vettori lentivirali basati su HIV-1 esprimono luciferasi di lucciola (Fluc) sotto il controllo del promotore della milza fuoco formando virus (SFFV). Il gene reporter ottico è stato clonato nel vettore plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI. <ol><li> Mantenere 293-T cellule modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e cellule GL261 in medium RPMI supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95 % di aria e 5% di anidride carbonica (CO 2). </li><li> Quando la coltura cellulare 293-T raggiunge 80% di confluenza in un pallone T-75, lavare le cellule una volta con phtampone osphate salino (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +, incubare le cellule con 3 ml di tripsina (0,05%) a 37 ° C per 5 min, triturare con una pipetta da 5 ml tenendo il pallone leggermente inclinato e raccogliere tutte le celle dal fondo della beuta. Trasferire il 3 ml di sospensione cellulare trypsinized in un tubo da 15 ml e aggiungere 7 ml di terreno RPMI carne (un totale di 10 ml della sospensione cellulare). </li><li> Mescolare la sospensione cellulare bene con una pipetta da 5 ml. Prelevare 100 ml di sospensione cellulare dal tubo e contare il numero di cellule utilizzando emocitometro. Per fare ciò, mescolare 100 ml di sospensione cellulare con 300 ml di soluzione trypan blu e inserire 2 ml della miscela in un emocitometro. Contare il numero di cellule senza colorazione blu da quattro viste separate sotto un microscopio. In media il numero di cellule da ogni punto di vista, dato che questo numero rappresenta 10 4 cellule / ml. </li><li> Nel frattempo, centrifugare la provetta contenente la sospensione cellulare a 300 xg per 7 minuti. Aspirare media e risospendere il pellet di cellule con mezzo fresco RPMI fare una sospensione cellulare GL261 a densità di 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 cellule GL261 con 2,5 ml di RPMI supporti in un pallone T-175 con 27,5 ml DMEM (giorno 1). </li><li> Dopo 24 ore, sostituire il supporto con 20 ml di DMEM fresco (giorno 2). </li><li> Per produrre il vettore lentivirale, mescolare 54 microlitri trasfezione reattivo con 2 ml di DMEM privo di siero per 5 min. Aggiungere 3 g di gag-pol, 3 mg di virus della stomatite vescicolare G busta (VSV-G), e 4,5 mg di Fluc (PSIN-Fluc) in DMEM con il reagente di trasfezione, e incubare per 20 minuti a RT. Eliminare la miscela DNA nella boccetta 293-T (T-175) e incubare a 37 ° C in una camera umidificata contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 48 ore (giorno 2). </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM fresco a 24 ore dopo la trasfezione (volume totale di 293-T terreno di coltura cellulare dovrebbe essere circa 30 ml) (giorno 3). </li><li> Per dividere le celle in un GL26124 pozzetti, lavare le cellule una volta con PBS senza Ca2 + e Mg2 +, incubare le cellule con 5 ml di tripsina (0,05%) a 37 ° C per 5 min, triturare con una pipetta da 5 ml tenendo il pallone leggermente inclinato , raccogliere tutte le cellule dal fondo del pallone, e contare le cellule tramite emocitometro come al punto 1.2. Nel frattempo, centrifugare la provetta a 300 xg per 7 minuti. Aspirare i media e sospendere nuovamente le pellet cellulari con fresco RPMI medio per effettuare una sospensione cellulare GL261 a densità di 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 cellule GL261 con 1 ml di media RPMI in una piastra da 24 pozzetti (giorno 3). </li><li> Raccogliere 30 ml del supernatante lentivirale con 10 ml pipetta dal pallone 293-T (T-175) a 48 ore dopo la trasfezione e trasferire il surnatante in tubo da 50 ml. Aspirare il supernatante 30 ml lentivirale tramite una siringa da 50 ml, attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron, e il surnatante virale Aliquotare in 1 ml aliquote (giorno 4). </li><li> Sostituire le 1 ml di RMedia PMI in piastra cellule GL261 (24 pozzetti) con 1 ml del supernatante lentivirale e incubare a 37 ° C in una camera umidificata (giorno 4). </li><li> Dopo 48 ore di infezione lentivirale, sostituire il mezzo di 1 ml di fresco RPMI (giorno 6). </li><li> Dopo 24 ore, ripetere l&#39;infezione lentivirale delle cellule GL261 (giorno 7). </li><li> Dopo il 2 ° 48 ore di infezione lentivirale, sostituire il mezzo di 1 ml di fresco RPMI (giorno 9). </li><li> Continua a crescere le cellule GL261 luciferasi modificato (ad essere indicato come cellule GL261.luc) ed espandere la coltura cellulare in un pallone T-75. </li><li> Quando la coltura cellulare GL261.luc raggiunge il 70% di confluenza in un pallone T-75, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e contare da emocitometro come al punto 1.2. Piatto la cellula GL261.luc in una piastra da 24 pozzetti a densità di laurea (1,0 x 10 6, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 cellule / pozzetto) e incubare a 37 ° C in un Humidicamera cato contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 3 ore. </li><li> Misurare cellulare attività luciferasi rispetto alla luciferasi modificato U-87 MG (U87.luc), le cellule utilizzando bioluminescenza (Figura 1). <ol><li> Avviare il software immagine (clic sull&#39;icona sul desktop) e inizializzare il sistema di imaging (fare clic sul pulsante &quot;inizializzare&quot;). L&#39;inizializzazione inizierà automaticamente e potrebbe richiedere diversi minuti per il sistema di check-up e la macchina fotografica di raffreddare fino a -90 ° C. </li><li> Aggiungere 25 ml di luciferina (sale di potassio D-Luciferin, 150 mg / kg) in tutti i pozzetti. </li><li> Incubare le cellule con luciferina per 1 minuto a temperatura ambiente e immagine la piastra per 10 secondi. Per configurare il sistema di imaging, selezionare &quot;luminescenti&quot;, &quot;10 secondi&quot; il tempo di esposizione, e binning &quot;Medio&quot;. Posizionare la piastra 24 pozzetti sulla stazione di imaging e fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare l&#39;immagine. </li><li> Dopo che l&#39;immagine viene acquisita con successo, si vedrà una finestra di immagine e strumento di palette sullo schermo. Fare clic su &quot;ROI (regioni di interesse) Strumenti&quot; e selezionare 6 x 4 dall&#39;icona fessura. Creare 6 x 4 feritoie per coprire l&#39;area del segnale sul immagine del 24-pozzetti e fare clic sulla scheda misure (icona della matita). Osservare una finestra con una tabella di misurazioni ROI come unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato (fotoni / sec / sr / cm 2). </li><li> Cellule uso U87.luc, in precedenza modificati con la stessa lentivirus usato qui per GL261 modifica 11, come un controllo per valutare l&#39;attività della luciferasi in cellule GL261.luc trasdotte. </li></ol></li></ol> 2. In Vitro proliferazione Assay <ol><li> Quando le colture cellulari e GL261 GL261.luc raggiungono il 70% di confluenza in un pallone T-75, raccogliere entrambe le linee cellulari mediante tripsinizzazione e contare come al punto 1.2, e cellule piastra in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 1500 cellule 80 ml di terreno RPMI per pozzetto con una pipetta multicanale per minimizzare il tempo e l&#39;errore pipettaggio. Seed ogni linea cellulare in totale 20 pozzi. Per limitare l&#39;evaporazione nei pozzetti popolati da cellule, riempire pozzi vuoti con 100 ml di fresco media RPMI. </li><li> Valutare la proliferazione cellulare utilizzando un test colorimetrico proliferazione cellulare. Qui usiamo il test proliferazione cellulare MTS. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 20 ml di reagente di MTS in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente cellule. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C in una camera umidificata contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 3 ore. Misurare l&#39;assorbanza a 490 nm usando un lettore per micropiastre. Questo viene ripetuto nei giorni 1, 2, 4, e 7, dopo la placcatura. Per normalizzare valori di assorbanza, i valori di ogni giorno sono divisi per i corrispondenti letture ottenute al giorno 1 (Figura 2). </li></ol> 3. Tumore delle cellule impianto Nota: Autoclave tutte le attrezzature. Preparare area chirurgica spruzzando un disinfettante (soluzione di clorexidina al 2%) e coprire con absorbent tende. Al fine di mantenere condizioni di sterilità, indossare guanti chirurgici sterili durante l&#39;intervento chirurgico, e dividere l&#39;area chirurgica in due aree di nastro di colore. Area 1 è etichettato come &quot;Clean&quot; e contiene forniture sterilizzati; Area 2 è etichettato come &quot;sporco&quot; e contiene materiali utilizzati. <ol><li> Prima dell&#39;intervento degli animali, preparare una sospensione di cellule per l&#39;iniezione intracranica. Celle di raccolta da un confluenti 70% T-75 pallone mediante tripsinizzazione e contare le cellule tramite emocitometro come al punto 1.2, e fare una sospensione cellulare con una densità di 1,0 x 10 5 cellule / microlitro in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;senza Ca 2+ e Mg 2+ (HBSS). </li><li> Anestetizzare topi con iniezione intraperitoneale di 200 microlitri miscela contenente 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg di xilazina in soluzione fisiologica 0,9%. Per confermare il corretto anestesia, pizzicare la punta del mouse. Se il mouse è completamente sotto anestesia, il mouse non dovrebbe rispondere allo stimolo. </li><li> Amministrare 0.1 mg / buprenorfina kg per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio. </li><li> Radere la parte superiore della testa degli animali utilizzando tagliaunghie e pulito con un applicatore di cotone imbevuto di tip soluzione di clorexidina al 2%. Applicare pomata occhio per mantenere un&#39;adeguata lubrificazione durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Eseguire un&#39;incisione sagittale lungo circa 1 cm sopra l&#39;osso parieto-occipitale con un bisturi sterile. Per visualizzare il bregma, pulire la superficie del cranio con un applicatore di cotone-tip imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. </li><li> Forare il cranio con un ago sterile da 25 G a fare un piccolo foro 3 mm a destra del bregma e appena dietro la sutura coronale. </li><li> Per assicurarsi che il sito di iniezione intracranica è ad una profondità di 3 mm dal cranio, tagliato 3 mm da estremità appuntita di un puntale di 20 microlitri con le forbici e inserire una siringa nella punta della pipetta. </li><li> Inserire la siringa perpendicolarmente al foro creato in precedenza, e iniettare lentamente il sus cellule tumoralipensione contenente 3.0 x 10 5 cellule in 3 ml HBSS, per un periodo di 1 min. Lasciare l&#39;ago in posizione per un altro minuto, e poi estrarre lentamente l&#39;ago. </li><li> Tampone cranio con applicatore cotone imbevuto di punta 3% di perossido di idrogeno e la soluzione di clorexidina 2%. Asciugare la superficie del cranio con l&#39;applicatore di cotone-punta. Tagliare la cera ossea sterile circa 3 mm 3 dimensioni e fissare la cera ossea sul lato dell&#39;estremità dell&#39;applicatore cotone punta. Applicare la cera osso per coprire il buco con l&#39;applicatore di cotone-punta. </li><li> Disegnare il ciascun lato del cuoio capelluto insieme sul cranio con pinze, e fiocco per chiudere la ferita. Pulire la ferita con un batuffolo di cotone imbevuto di punta soluzione di clorexidina al 2%. </li><li> Monitorare tutti i mouse dopo l&#39;intervento fino a quando diventano ambulatoriale e mantenere la normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è di circa 30 min. Non restituire i topi in gabbia con altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato da anestesia. </li></ol><ol><li> Spruzzare una generosa quantità di disinfettante (soluzione di dimetil cloruro di ammonio 0,05%) su un tovagliolo di carta pulito. Utilizzare il tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante-per pulire a fondo il foglio nero, coni naso e divisorio all&#39;interno della camera di imaging dove gli animali saranno in contatto con il dispositivo. Pulire accuratamente tutte le superfici con un fazzoletto di carta pulito e asciutto. Ripetere questo ancora una volta e attendere 5 minuti. </li><li> Inizializzare la stazione di imaging come al punto 1.14.1. </li><li> Anestetizzare il mouse con una miscela di 300 ml contenente 200 ml di ketamina / xilazina e 100 ml di luciferina (sale di potassio D-Luciferin, 150 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Attendere 10 minuti dopo l&#39;iniezione e confermare se i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare la coda. Per configurare il sistema di imaging, selezionare &quot;luminescenti&quot;, tempo di esposizione &quot;Auto&quot;, e binning &quot;Medio&quot;. Mettere i topi sulla ferr immaginisu e fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare l&#39;immagine. Verificare che il tempo dopo l&#39;iniezione è coerente con ogni sessione di imaging. </li><li> Dopo che l&#39;immagine viene acquisita con successo, dovrebbe apparire una finestra di immagine e tavolozza degli strumenti. Fare clic su &quot;Strumenti ROI&quot; e selezionare &quot;auto&quot; dall&#39;icona cerchio. Per definire ROI, circondare la zona del segnale dell&#39;immagine, e poi prendere le misure del ROI come unità di fotoni / sec / sr / cm 2. </li><li> Prendere i topi dalla camera di imaging e monitorare i topi fino a diventare ambulatoriale e mantenere l&#39;attività normale. In genere il tempo di recupero è di circa 15 min. Non restituire i topi in gabbia con altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato da anestesia. </li><li> Monitorare la crescita tumorale di imaging bioluminescenza due volte a settimana fino a quando gli animali presentano i seguenti sintomi: perdita di peso (perdita di oltre il 20% rispetto al peso prima dell&#39;impianto), inappetenza (anoressia completa per 24 ore), e la mancanza di purposefu sostenutarisposta a stimoli l dolce (debole tentativo di alzarsi), momento in cui devono essere eutanasia. Euthanize animali con questi sintomi utilizzando una camera di CO 2 seguita da dislocazione cervicale. <ol><li> Topi posto nella camera di eutanasia (fare non sovraffollate della camera) e afflusso compressi di CO 2 per 5-6 min. Osservare che tutti gli animali sono incoscienza e non respira dopo circa 5 min. </li><li> Prendere i topi dalla camera. Assicurarsi che il cuore non batte per sentire il petto tra il pollice e l&#39;indice e controllare che non vi è alcun riflesso corneale. </li><li> Trattenere il mouse in posizione prona su una superficie piana e afferrare la parte posteriore del collo alla base del cranio, con una mano e base della coda con il pollice e l&#39;indice dell&#39;altra mano. </li><li> Trattenere la testa e tirare rapidamente la coda all&#39;indietro. Assicurarsi che il cranio è separato dalla prima vertebra cervicale con il pollice e l&#39;indice. </li></ol></li><li> Normaalize valori di luminescenza per ogni giorno contro letture corrispondenti ottenuti al primo giorno dell&#39;imaging bioluminescenza come al punto 2.3 (Figura 3A). </li><li> Per l&#39;analisi statistica, generare curve di sopravvivenza utilizzando lo stimatore di Kaplan-Meier 12 e confrontare le differenze tra le curve di sopravvivenza con un log-rank test 13. </li></ol>

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(67), (2012).</li></ol>

There are no conflicts of interest to disclose.

GL261 cellule di glioma murino, quando impiantato intracranially in immunocompetenti singenico C57BL / 6 topi, offrono diversi vantaggi rispetto ai modelli di xenotrapianto animali glioma umano. Molti dei tumori xenotrapiantati crescere come lesioni incapsulati che non ricapitolano accuratamente la malattia umana invasiva. Al contrario, GL261 tumore dimostra non solo l&#39;invasione nel cervello adiacente, ma anche neovascolarizzazione, figure mitotiche, e profonda la necrosi 7. Soprattutto quando si studia immunologia tumore o strategie di immunoterapia 15, 16, il topo C57BL / 6 mantiene un sistema immunitario intatto 8. Studi precedenti hanno dimostrato robusto espressione della citochina immunosoppressiva TGF-β e tumori intracranici contenere immunosoppressori cellule T regolatori simili a glioblastoma umano 9, 10. La semplice tecnica qui descritta permette di espressione stabile della luciferasi da parte delle cellule GL261. Abbiamo recentemente riportato similar in vitro e in vivo la crescita delle cellule GL261.luc rispetto alle cellule GL261, oltre alle analoghe caratteristiche istologiche del tumore e cellule immunitarie infiltrarsi 17. GL261.luc cellule stabilmente esprimono luciferasi che catalizza l&#39;ossidazione del substrato luciferina conversione dell&#39;energia chimica per fotoni e quindi luce rilevabile. Luciferina può essere somministrato senza rischi negli animali e attraversa la barriera emato-encefalica dopo l&#39;iniezione intraperitoneale o endovenosa. In piccoli animali ricerca come topi, la bioluminescenza può essere rilevata esternamente in modo non invasivo 11. Pertanto, la crescita del tumore può essere valutata in serie senza la necessità di sacrifici animali o costose RM o TC. Le fasi critiche nel protocollo riguardano non solo la trasduzione lentivirale, ma anche la verifica di espressione stabile di luciferasi in vitro prima di iniziare qualsiasi esperimenti in vivo. La perdita di trasduzione può require infezione lentivirus ripetizione. Introduzione di un gene di resistenza agli antibiotici nel vettore di espressione può essere usato anche per selezionare per l&#39;espressione della luciferasi. È necessaria tecnica meticolosa per l&#39;impianto intracranico di inserire riproducibile un consistente numero di cellule in una posizione anatomica precisa per permettere il confronto di diversi gruppi di trattamento. Una differenza principale tra questo studio e studi precedenti luciferasi cellule esprimenti GL261 è l&#39;uso di una tecnica per la mano libera impiantare cellule rispetto all&#39;uso di un telaio stereotassico 18. Abbiamo precedentemente dimostrato risultati impianto coerenti con la tecnica a mano libera 19. Il vantaggio della tecnica libera mano è la capacità di eseguire analisi ad alto rendimento di diversi agenti di trattamento. Nelle nostre mani, siamo in grado di impiantare circa 60 animali in 1 ora. Dopo aver imparato la tecnica, le future applicazioni della tecnica sono illimitate. Come GL261 demonstrates elevati mitosi e la rapida crescita del tumore simile a glioblastoma umano, trattamenti anti-proliferativi possono essere valutati. Analogamente, terapie anti-invasive e antiangiogenici possono essere utilizzati come i tumori GL261 sono invasive e angiogenico. Deve essere usata cautela nel valutare l&#39;effetto di agenti chemioterapici volte a bersagli umani. Rispetto ai precedenti studi che utilizzano xenotrapianti glioblastoma umano esprimono luciferasi 20, questo sarebbe considerato una limitazione del nostro modello. Inoltre, l&#39;effetto di strategie di immunoterapia di crescita del tumore può essere studiato nel modello xenotrapiantati GL261.

Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4. 
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10. 
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Gold Biotechonology</td><td>LUCK-100</td><td>Store away from light</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>24-well; Standard tissue culture; flat-bottom</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>none</td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>none</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Control substance</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>none</td></tr><tr><td>28G Needle (with syringe)&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA Insulin Syringe</td></tr><tr><td>2% Chlorhexidine</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>AKA &amp;ldquo;Nolvasan&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>3% Hydrogen Peroxide</td><td>Fisher</td><td>H312P-4</td><td>Store away from light</td></tr><tr><td>Ophthalmic Ointment</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA &amp;ldquo;Akwa Tears&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 needle</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>none</td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Feather</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>none</td></tr><tr><td>Skin Stapler, Staples, Remover</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>none</td></tr><tr><td>PDI Alchol Prep Pads</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>none</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Remover</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>none</td></tr><tr><td>Single Ended Round Tip Swab with Wood handle</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>none</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>none</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>none</td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>599864</td><td>none</td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of an immunocompetent animal model for glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 cellule sono state infettate con luciferasi contenente lentivirus come descritto sopra nei passaggi 1. In vitro l&#39;imaging bioluminescenza dimostra espressione luciferasi robusto simile a livelli nel controllo positivo U87.luc linea cellulare di glioblastoma umano (Figura 1). Come previsto, le cellule non infette GL261 mostrano alcuna espressione sfondo luciferasi. Questo passaggio è semplice ma fondamentale da eseguire prima di ulteriori studi che utilizzano la linea di cellula infettata per confermare espressione stabile luciferasi. Espressione luciferasi dopo l&#39;impianto intracranico. Prima dell&#39;impianto intracranica, abbiamo dimostrato alcuna differenza nel tasso di crescita in vitro di GL261.luc rispetto alle cellule GL261 (Figura 2). Per la crescita intracranica e analisi di sopravvivenza, cellule sono state iniettate nella brains di topi C57BL / 6 come da protocollo punto 3. La crescita del tumore in topi portatori di tumori GL261.luc è stato analizzato in serie per l&#39;imaging bioluminescenza utilizzando il protocollo punto 4 e hanno dimostrato la crescita tumorale rilevabile (Figura 3A). I topi che portano rapidamente e in modo coerente tumori GL261.luc diventato moribondo e sono stati sottoposti a eutanasia. È importante sottolineare che non vi è alcuna differenza nella sopravvivenza globale tra GL261.luc e tumore GL261 cuscinetto animali (Figura 3B). In vivo bioluminescenza può quindi essere utilizzato per monitorare la risposta ai trattamenti sperimentali glioblastoma. La rapida crescita del tumore e la sopravvivenza globale affidabile breve può produrre grandi quantità di dati in un tempo relativamente breve lasso di tempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> Figura 1. Attività luciferasi in cellule GL261.luc. U87.luc, le cellule GL261.luc e GL261 (controllo negativo) sono stati placcati in densità di1,0 x 10 6, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, e 2,5 x 10 4 cellule / pozzetto da sinistra a destra. Luminescence (fotoni / sec / sr / cm 2) è stata misurata con la stazione di imaging lumina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> Figura 2. espressione luciferasi non influenza la proliferazione delle cellule GL261. GL261.luc cellule non provocano un differenza nella proliferazione come dimostrano MTS saggio di proliferazione cellulare. Il grafico mostra volte superiore, rispetto al giorno 1, come determinato dal confronto tra il valore medio di assorbanza (media ± SEM) al punto di tempo thespecified per il valore medio al giorno 1 (spaiati t valori -test per i confrontitra ogni linea cellulare: P = 0,7796) 14. Barre di errore rappresentano i valori medi (media ± SEM) da campioni quadruplicato in ogni giorno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> Figura 3. espressione luciferasi dose non influisce su in vivo la crescita del tumore e la sopravvivenza degli animali. (A) Monitoraggio bioluminescenza dimostra progressiva crescita del tumore intracranico GL261.luc in topi C57BL / 6. (B) analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier dimostra alcuna differenza nella sopravvivenza globale per i topi impiantati intracranially sia con GL261 (linea continua) o GL261.luc cellule (linea tratteggiata).Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

bioluminescence-imaging-an-immunocompetent-animal-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K Views.  University of California San Francisco. GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Video: Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Medicina

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting immunodeficient mice subcutaneously with cancer cells and measuring the tumor mass after it becomes visible and palpable. Orthotopic injections of cancer cells aim to introduce the xenograft in the microenvironment that most closely resembles the tissue of origin of the tumor being studied. Brain cancer research requires intracranial injection of cancer cells to allow the tumor formation and analysis in the unique microenvironment of the brain. The in vivo imaging of intracranial xenografts monitors instantaneously the tumor mass of orthotopically engrafted mice. Here we report the use of fluorescence molecular tomography (FMT) of brain tumor xenografts. The cancer cells are first transduced with near infrared fluorescent proteins and then injected in the brain of immunocompromised mice. The animals are then scanned to obtain quantitative information about the tumor mass over an extended period of time. Cell pre-labeling allows for cost effective, reproducible, and reliable quantification of the tumor burden within each mouse. We eliminated the need for injecting imaging substrates, and thus reduced the stress on the animals. A limitation of this approach is represented by the inability to detect very small masses; however, it has better resolution for larger masses than other techniques. It can be applied to evaluate the efficacy of a drug treatment or genetic alterations of glioma cell lines and patient-derived samples.

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Orthotopic intracranial injection of tumor cells has been used in cancer research to study brain tumor biology, progression, evolution, and therapeutic response. Here we present fluorescence molecular tomography of tumor xenografts, which provides real-time intravital imaging and quantification of a tumor mass in preclinical glioblastoma models.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Ricerca sul cancro

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Imaging batterica<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Immunologia e infezioni

Tracciamento in tempo reale di nanoparticelle nei tumori cerebrali utilizzando 2P-IVM nei topi

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the accumulation and distribution of macromolecules in brain tumors in vivo would greatly enhance our ability to understand and optimize drug delivery in preclinical models. This protocol describes a method for real-time in vivo tracking of intravenously administered fluorescent-labeled nanoparticles with two-photon intravital microscopy (2P-IVM) in a mouse model of glioblastoma (GBM).
The protocol contains a multi-step description of the procedure, including anesthesia and analgesia of experimental animals, creating a cranial window, GBM cell implantation, placing a head bar, conducting 2P-IVM studies, and post-surgical care for long-term follow-up studies. We show representative 2P-IVM imaging sessions and image analysis, examine the advantages and disadvantages of this technology, and discuss potential applications.
This method can be easily modified and adapted for different research questions in the field of in vivo preclinical brain imaging.

Autore in primo piano: Strategie di imaging multimodale per ottimizzare la somministrazione di farmaci e la diagnosi precoce nel trattamento del glioblastoma

We present a novel approach for two-photon microscopy of the tumor delivery of fluorescent-labeled iron oxide nanoparticles to glioblastoma in a mouse model.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanoparticelle di ossido di ferro per la somministrazione di terapia guidata da immagini nel glioblastoma murino

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Terapie innovative contro il cancro con nanoparticelle di ossido di ferro per il trattamento del glioblastoma

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

Stereotassica impianto intracranico e

Bioluminescent Imaging batterica

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma