NIH / NIDCD R01 DCでサポートされている011582.イメージング実験は大学で行ったのコロラドアンシュッツメディカルキャンパス高度な光学顕微鏡コアはNIH / NCRRコロラドCTSIグラント番号UL1 RR025780とロッキーマウンテンNeurlogical障害コアセンター助成NIH P30NS048154によって部分的にサポートされています。ソーク研究所から博士サシャ・デュ・ラックはGLYT2-GFPマウスを提供してくれました。

1.オプティカルジェノタイピングマウス子犬の1光学ジェノタイピング<ol><li>適切な励起波長のレーザポインタを使用してそれぞれの蛍光マーカーの発現を確認する（ここで説明した実験で405 nm）で励起波長を遮断するフィルタ眼鏡を対応するが、発光波長を通過させる（450 - ここで説明した実験で700 nm）の。ヘッドやマウスの仔の脊髄の背面にレーザーポインターを点（ 図1を参照）。目とレーザー光に対する皮膚の長い露出にレーザーを照射しないでください。 </li></ol>古い動物の2光ジェノタイピング<ol><li>深く腹腔内注射（120ミリグラム/ kg体重）を介して、ペントバルビタールの過剰摂取と（ここで説明した実験ではP138歳P14）は、マウスを麻酔。動物の反射神経をチェックして、適切な麻酔を確認してください（簡単番目の先端をつまみます電子耳や耳や足の後退反射を誘発するための後ろ足の1つ）。 </li><li>注意：動物はまだ理想的に生きているので、ペントバルビタールの過剰摂取の使用にもかかわらず（120ミリグラム/ kg体重）我々は、代わりに安楽死の「深麻酔」と注射手順を参照してください（ すなわち 、その心臓はまだ鼓動している）、時手術と灌流が開始されます。これは、脳を含む内臓のより効率的な灌流を保証します。 </li><li>動物は任意の反射を示していないならば、慎重に頭の後ろをカバーする皮膚の切開を作り、頭蓋骨の中央部に切断することにより頭蓋骨（ 図2A）を覆う皮膚を削除します。レーザー光に覆われていない頭蓋骨を露出させ、上記のようにフィルターゴーグルを通して蛍光を観察します。 GFP陽性シグナルが観察された場合、（第2 /私たちの次の安楽死の形を確保断頭を通じて動物を犠牲にし、いない場合は、ステップ2に進んでくださいIACUC規制）。 </li></ol>注：さらに古いマウスでは（&gt; 1ヶ月）の蛍光は、動物の目を通して観察することができます。 2. Transcardial灌流と脳の準備<ol><li>大部分から血液を除去するために、30gの注射針を使用して、氷冷リン酸緩衝食塩水（10mMの137 mMの、塩化カリウム：2.7ミリモル、KH 2 PO 4：1.76ミリモル、のNa 2 HPO 4のNaCl PBS）で経潅流動物。 <ol><li>まず、慎重に鋭いハサミで胸郭を開き、心臓の左心室に針を押し込みます。心臓や大動脈にPBSをポンプ起動し、すぐにこのステップが身体を終了し、血液を可能にするために、はさみで心臓の右心房を開き、次の。注：灌流5かかり - 動物のサイズに応じて10分。 </li></ol></li><li>灌流を介して放血した後、動物を刎ねる、ピンnにその頭を固定eedles（または30のG注射針）準備皿に目のソケットを介してそれらを貫通し、頭蓋骨から脳を削除することもできます。 <ol><li>ちょうど尾側動物の眼の側面にカットし、頭部の背側の正中線に沿って切断し、頭の後ろに小さな切開を行います。まず、頭蓋骨を重ねる肌を遮断するために、鋭いハサミを使用最後に、完全に頭の後ろの皮膚のフラップを除去するために、尾方向に切断。 </li><li>次に、頭蓋骨自体の同じカッティングパターンを繰り返し、これはかなり最終的に脳幹の除去を簡素化しますので、その過程で両方の蝸牛を取り外してください。この手順の後、脳の尾半分が完全に露出あるべきです。 </li><li>次のステップでは、小脳から約45°〜約2mmの吻側の角度で全前脳を切断するために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。 ABと脳の分離前半をかき出しますENTへら。 </li><li>その吻側端に脳の尾半分を高め、その後、まだ腹側脳幹に接続されている脳神経を切断するために、スパチュラを使用します。最終結果として、脳幹を含む脳の尾の半分は、準備された動物の頭の残りの部分から自由落下する必要があります。 </li><li> （ステップを参照してくださいその腹側を露出するために、脳の除去された尾の半分を反転し、台形体を含む腹側に位置する「電球」の（逆行注射用）ちょうど吻側（順行注射用）またはちょうど尾側前頭面に沿って切断2.3）。 <ol><li>常に組織に過度の機械的ストレスによる細胞死を最小限にするために切断手順のために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。最終結果として、長さが約1cmにまたがるし、他の脳領域に沿って完全な上オリーブ複合体を含む脳の外植が得られているはずです。 </li></ol></li></ol> &lt;/ LI&gt; </ol>注：このプロトコルは、聴性脳幹に位置台形本体内にトレーサーを注入するための手順を示しています。必要に応じて、切断面と注射部位の位置と向きを調整します。それらが同定され、脳を切断せずに注入することができるように、脳表面に十分に近い関心嘘の蛍光脳領域（ 図2Bを参照）場合、冠状切断工程を省略することができます。 <ol start="3"><li>台形体（VNTB）の腹側核を含む二腹目立つ「球根」と台形体を識別します。 </li></ol>注：これらの切断面のおおよその定位位置に関する更なる解剖学的参考のため、フランクリン＆Paxinos、2008年アトラスのパネル78、ブレグマ〜-5.7 mmは台形体（= MNTB）の内側核を示しているを参照してくださいTzを」と表示&quot;。パネル69は、台形BOの腹側核を示しています「MVPO」（medioventral periolivary核）19としてラベルDY（VNTB）。 3.順行/逆行トレース注：RT（25℃）で、次のすべての手順を実行します。 <ol><li> 125 mMの、のKCl：2.5mMの、のMgCl 2を1mM、のCaCl 2：0.1mMのグルコース切断した後、酸素（95％O 2、5％CO 2）解剖溶液（NaClを含む製剤皿に脳幹の外植片を配置：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25ミリモル、のNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mm）を、30gの注射針とそれを固定します。注射の面積が上を向いていることを確認します。 </li><li>ホウケイ酸ガラスから注入ピペットを引き、次の三つの解決策の一つでそれらを埋める：コレラトキシンサブユニットB PBS 12-13でアレクサフルオロフォア555に共役（主に逆行性輸送に使用される）、BのA）1.0 mg / mlのソリューション）1％-d万MWのデキストランTRITC 555の0.9％生理食塩水でのデキストラン（主に逆行性輸送に使用される3000メガワット）テトラメチルローダミン555またはc）1％-dilutionの0.9％生理食塩水でilution（主に）順行輸送に使用されます。 <ol><li> 4引っ張っサイクル - その注入ピペットの抵抗が2.5から3.5オームの範囲であり、それらが3で製造されていることを確認してください。ここに記載される実験のために、予めプログラムされたピペットプラー上でアルゴリズムを引っ張るを選択することによって、これを達成します。 </li></ol></li><li>適切な波長（;ここで説明した実験では、波長405nm、図3Aの項目番号2）の静的に取り付けられたレーザーポインタを使用して、脳の外植片を照らします。注射のためのガイドとしてのレーザーポインタを使用し、注入される蛍光標識された脳核または目的の細胞にレーザー光を目指しています。 </li><li> 70 - 互換性のあるフィルターゴーグル（450を装着したまま検索し、双眼顕微鏡を通して照射ターゲット領域を観察ここに記載した実験において0nmのバンドパスフィルタ）。関心領域にマイクロマニピュレーターを経由して注入電極を挿入します。 </li><li>トレーサー物質を注入します。脳切片内の関心領域（ROI）内に垂直に向け圧力噴射装置を用いて、50ミリ秒ごとに、15 psiで10圧力パルス - 注射は2から成ります。拡散する染料を可能にするために15秒 - 10の間隔で各圧力パルスを管理します。 </li><li>テトラメチルローダミン（TRITC）注射剤の場合には、付加的に（ここで記載した実験でMNTBとVNTB）関心のある脳領域に配置された電極をエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増強するために、電気的に刺激します。 <ol><li> 50ミリ秒パルス間の間隔で50ミリ秒、刺激によって駆動され、刺激分離ユニット（項目7号及び図3Bの 9）で55 Vに増幅するために8ボルトの8 TTLパルスを使用してください。このプロトコルの20回繰り返し、adminis - 10を使用してください数分7,8を介して結。適切に電極を接地していることを確認します - アース線は、浴溶液に接続する必要があります！ </li></ol></li><li>注射の成功のために確認してください。以来長い発光波長を有する蛍光トレーサーはまた、レーザーで領域を照射し、フィルターゴーグルを通して見ながら視覚的に注入された目標領域に色素取り込み/スプレッドをチェックし、より短い波長のレーザー励起により蛍光シグナルを発しています。 </li></ol> 4.インキュベーション<ol><li> 125 mMの、塩化カリウム：2.5 mMの、のMgCl 2：1 mMの、のCaCl 2：2 mMのグルコース：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25 mMの、塩化ナトリウム;注入後、酸素化人工脳脊髄液（ACSFでbrainstemsをインキュベートNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mMの、95％のO 2を通気-室温で5％のCO 2）1（RT、25℃） - 4時間、しばらく色素が輸送されています。バブル全体の潜伏期間中にソリューションを提供します。 </li><li>一晩（O / N）の後固定を可能にするために4℃でそれをし、インキュベートする;（PFA / PBS混合物のためにpH7の約100ml）で、続いて、PBSに溶解した4％パラホルムアルデヒド（PFA）でbrainstemsを転送します。 </li></ol> 5.組織スライスと取り付け<ol><li>次の日、PBSで3回（各洗浄工程のために5分に）脳幹を洗って、4％の寒天でそれをカバーして、50にカット - ビブラトーム上の80μmの厚さにスライス。ガラススライド、及びカバーガラスの取り付けメディアを使用してマウントスライス。 </li><li>必要に応じて、（：AB培地で100倍希釈で例えば青ニッスル）25分間蛍光ニッスルを持つセクションにラベルを付けます。 <ol><li> 、AB培地を調製0.2 Mリン酸緩衝液250mlを混合する（PB; 51 mMのKH 2 PO 4、150mMののNa 2 HPO 4）、15 mlの5 M NaClを、15 mlの10％のTriton-X、220ミリリットルのddH 2 Oそして5gのウシ血清アルブミン。 </li><li> PrecePBS中で3回の洗浄工程（10分毎）によるニッスル標識工程をデ、成功。 </li></ol></li></ol>注意：厚いセクションをマウントして分析する必要がある場合には（そのようなスライスここで説明した実験で100だった - より大きな距離での軸索の接続を維持するために、厚さ500ミクロン）、技術が組織のクリアと組み合わせることができます。我々はClearT2 12が成功した20であることが判明します。組織のクリアステップが含まれている場合には、セクションをマウントする前にそれを行います。

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我々は、開示することは何もありません。

、in vivoでのトレースの研究とは対照的に、in vitroでのトレーサーエレクトロポレーションの一般的な強さは、高価な定位（多くの場合、電気生理学）装置を必要としない、それは研究者に、したがって関心との脳領域へのより良いアクセスを与えることです。デキストランアミンとの他のトレーサーの使用に関する詳細なレビューを参照してください（in vivoでのトレー?...

特定の神経細胞（マイクロ）回路を定義するためには、言った回路、及びその接続パターンの多様な参加者を見つけることによって開始する必要があります。以来lesioning 1を介して神経解剖学的トレーシング技術の多種多様なトレースneurofiberについてウォーラーの出版物は、確立されています。これらの技術のいくつかは、1971 5-6の発見として、他は、生きたニューロン中の染料の能動輸送に依存して、固定された組織の死後2-4に適用することができます。後者はさらに、（与えられた投影の源 、 すなわちへの注入領域から。地域請求する突出しているニューロンの細胞体）アクティブな逆行性の利点を活かした方法とを区別する2つのグループに細分化することができ、アクティブな順行性（注入からの指定された投影の対象の領域、 すなわち軸索投射および標識された神経細胞の軸索端末）輸送。また、場合によっては、TRACER材料は、他の例では、外植脳が注入されている間、（ 生体内のトレーサー注射で ）数日または数週間の注射を生き残るためには、人工脳脊髄液中に注入した後、数時間インキュベート生きた動物に注入された（in vitroでのトレーサー注射を） 。 このプロトコルでは、我々 は 、in vitroエレクトロポレーション技術7-8に 、既存のトレース物質としてコレラトキシンサブユニット-Bおよびテトラメチルデキストランを使用して、順行と逆行追跡実験で、神経細胞体とプロセスにラベルを付けるように変更。このプロトコルの全体的な目標は、トレーサー注射の間に精度を標的に増加させるために使用可能なトランスジェニックマウス系統と基本光学機器を利用しながら、異なる脳核の間の神経接続のパターンを追跡するための効率的なツールを使用して神経科学を​​提供することです。順行と逆行トレースを使用する方法が、コレラ毒素およびデキストランアミンおよびそれらのそれぞれの蛍光標識複合体は、（ 例えば 、エレクトロポレーションの方法であるとして。ハースら 14）新しい9-13ではないが、脳組織のブロックを含むin vitroでの準備でエレクトロポレーションとトレーサー注射の組み合わせより最近の開発7です。生きた動物でのトレーサー染料の同じタイプを使用して、神経トレーシング技術上の主な利点があるため、染料がエレクトロニューロンによって取り込まされていると、より高い効率の増加標識強度です。実験者は、注入の対象領域上の視覚的制御を持っているので、追加の利点は、トレーサ注入中（染料の輸送に必要）を短く潜伏期間であり、その増加目標精度。後者はまた、高価な定位装置は、関心の核または脳の領域を見つけるために必要とされないことを意味します。 ADDIへtionally精度をターゲットに増加、我々は、ニューロン15と405 nmの波長と一致するバンドパスフィルタゴーグルのハンドヘルドレーザポインタ（450からなる基本的な光学機器のそのグリシン部分集団でGFPを発現するトランスジェニックマウス系統、利用しました- 700 nm）で。したがって、我々は、蛍光シグナルを介して注入領域を識別することによって精度を標的にし、土着のGFPシグナルとトレーサーとの間の相互作用の観察を通して注入領域内の色素の広がりを制御するための微細な方法を提供することによって、かなりの更なる増加を達成し蛍光。私たちの技術は、トレーサーを充填したもの（他のマウス系統または興奮）GFP陽性抑制性ニューロンを識別することにより、その接続性とともに、回路の機能性を明らかにすることができます。 要約すると、我々はさらに脊椎動物の脳のコネクトームを研究し、Tを評価するための強力な神経科学のツールを強化しました彼与えられたneurocircuitの異なる神経解剖学的特徴。安価で広く入手可能な光学機器と一緒にトランスジェニックマウスを使用することにより、我々は大幅に私たちの注射のターゲットと精度を高めることができました。さらに、トランスジェニックマウスは、聴覚脳幹における阻害マイクロ回路の機能を明らかに役立っている、私たちは、トレース接続の種類を識別することができました。

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate di-basic</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td></td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td></td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td></td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td></td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td></td><td>A2153</td><td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>optional, for brain clearing</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>optional, for brain clearing</td></tr><tr><td>Choleratoxin subunit-b</td><td>Molecular Probes</td><td>C-34776 (Alexa 555)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (blue)</td><td>optional</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass filaments</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Zeitz Instruments, Germany</td><td>DMZ Universal Puller</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion setup</td><td>Custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser pointer&amp;nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Filter/safety goggles</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Bionocular microscope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M3</td><td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC with installed MC Stimulus software</td><td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-channel stimulator</td><td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Stimulation isolation unit</td><td>A.M.P.I., Israel</td><td>Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige, Japan</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

私たちは、処置中に対象となるレーザ照射と一致するフィルターゴーグルと脳の外植片にエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増加させるために、電気的および圧力一連のパルスを使用してin vitroでのトレーサー注入プロトコルを組み合わせた手法を提示します。それ自体でのin vitroエレクトロポレーションの記載された技術は、脳の特定の領域をターゲットするための比較的良好な視覚的なコントロールが得られます。レーザー蛍光遺伝子マーカーの励起とその読み出しバンド通過フィルタゴーグルを通して、遺伝的に標識された細胞/核と蛍光トレース色素の排出量を拾うことができ、研究者は、実質的に注射の精度を向上させることができるとそれを組み合わせることで関心領域を見つけ、はるかに効率的に注入領域における染料拡散/取り込みを制御することによって。また、レーザー照射技術はPROVによって与えneurocircuitの機能を研究することを可能にしますGFP発現は、神経細胞の亜集団によって発現される送信機の種類にリンクされている場合に、特定の領域に突出した神経細胞のタイプに関する情報をiding。

レーザーポインターとレーザーゴーグルは、迅速かつ安価にリターからのGFP陽性動物の遺伝子型を決定するために使用することができるか1および図2は図 。若いマウスの仔の例では、技術は、非侵襲的に頭蓋骨とその上の皮膚（ - D図1A）を介して動物の脳におけるGFPのラベルを識別するために使用することができます。放射された蛍光は、少なくともア?...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。 

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

遺伝学

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

生物学

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

神経科学

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point measurements and can therefore only evaluate longitudinal changes of cell migration and survival to a limited extent. This paper provides a reliable, minimally invasive protocol to transplant and longitudinally track neural progenitor cells (NPCs) in the adult mouse brain. Before transplantation, cells are transduced with a lentiviral vector comprising a bioluminescent (firefly-luciferase) and fluorescent (green fluorescent protein [GFP]) reporter. The NPCs are transplanted into the right cortical hemisphere using stereotaxic injections in the sensorimotor cortex. Following transplantation, grafted cells were detected through the intact skull for up to five weeks (at days 0, 3, 14, 21, 35) with a resolution limit of 6,000 cells using in vivo bioluminescence imaging. Subsequently, the transplanted cells are identified in histological brain sections and further characterized with immunofluorescence. Thus, this protocol provides a valuable tool to transplant, track, quantify, and characterize cells in the mouse brain.

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

We describe the intraparenchymal transplantation of human neural progenitor cells transduced with a dual reporter vector expressing luciferase-green fluorescent protein (GFP) in the mouse brain. After transplantation, the luciferase signal is repeatedly measured using in vivo bioluminescence and GFP-expressing grafted cells identified in brain sections using fluorescence microscopy.

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

要約

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この動画の章

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

からの神経外植文化

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

小脳軸索のレーザーNanosurgery

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と生体内生物発光追跡

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

要約

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生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

からの神経外植文化

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

小脳軸索のレーザーNanosurgery

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と生体内生物発光追跡