マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

細胞ベースの治療は、脳の再生に大きな可能性を秘めています。ここで実証したプロトコルは、マウス脳内の移植細胞の縦断的なin vivoイメージングを可能にするため、価値があります。このプロトコルは、一定期間にわたる同じ動物における移植片の移動および生存に関する洞察を得るために特に有用である。

この手順は、マウス脳に移植された任意のルシフェラーゼ発現細胞株に適用することができる。しかしながら、シグナル強度は、移植の深さまたはそれぞれの細胞株におけるルシフェラーゼ発現に応じて変化し得る。手順を実演するのは、私たちの研究室の優秀な博士課程の学生であるRebecca Weberです。

マイナス150°Cの貯蔵から細胞のバイアルを収集し、実験室に移すことから始めます。氷の結晶が溶解するまで、バイアルを摂氏37度で2〜3分間焼戻しした水浴に素早く移す。次いで、バイアルをバイオセーフティキャビネットに移し、全内容物を滅菌15ミリリットルの円錐管にピペットする。

9ミリリットルの滅菌PBSを加え、300Gで室温で5分間遠心分離する。ペレットを乱すことなく吸引によって上清を除去し、自動セルカウンターを使用して最終スピンの前に細胞をカウントする。誘導チャンバから定位フレームに動物を輸送し、フェイスマスクを使用して麻酔を維持する。

眼科用潤滑剤を塗布して、目が乾燥するのを防ぎます。マウスの頭皮を電気カミソリで剃り、綿棒を使って5%ベタジン溶液で皮膚を消毒します。マウスの頭を固定し、イヤーバーを外部ミータスに挿入します。

外科用歯科用ドリルで頭蓋骨に直径2〜3ミリメートルの穴を開けます。調製した細胞をチューブに再懸濁し、2マイクロリットルの細胞懸濁液をシリンジに引き込む。シリンジを標的部位の上に置き、針を硬膜の表面にゆっくりと動かし、深さ座標を計算する。

「リビング・イメージ」ソフトウェア・アイコンをダブルクリックし、ドロップダウン・リストからユーザー ID を選択します。次に、表示されるコントロールパネルの[初期化]をクリックします。リビングイメージソフトウェアで、コントロールパネルの[発光]ボックスと[写真]チェックボックスをオンにし、[自動露出]を選択します。

視野を選択します。被写体の高さを入力し、[被写体の高さのフォーカスを使用]オプションを選択します。大きなビニング、F/ストップ、ブロック励起フィルタ、オープンエミッションフィルタなどのフィルタリングパラメータを手動で設定します。

ルシフェリンを腹腔内に注射し、5分後、連続イソフルラン供給で動物を麻酔する。鎮静した動物を従来のヘアシェーバーを使用して頭部に剃ります。動物をイメージングチャンバーに入れ、ルシフェリン注射の15分後にコントロールパネルの[取得]をクリックしてイメージングを開始します。

神経前駆細胞をマウス脳に移植する前に、細胞をインビトロでのEGFPの発現による形質導入の成功について試験した。移植の成功は、赤色のホタルルシフェラーゼシグナルの存在によって確認された。マウスの右感覚運動野に6,000~180,000個の細胞を移植した後、生物発光シグナルは全ての濃度で検出可能であった。

細胞は移植後少なくとも5週間生存した。移植された細胞を、EGFPレポーターおよび抗ヒト核による免疫染色によるその後の組織学的分析においてエキソビボで首尾よく検出した。ターゲット部位を見逃さないように、注入座標を慎重に計算することが非常に重要です。

また、逆流を避けるために、移植後少なくとも5分間シリンジを所定の位置に放置してください。in vivo生物発光イメージング後、脳組織を組織学的分析のために調製するか、または移植細胞をFACSを使用して単離し、異なるまたは混合技術で特徴付けることができる。全体として、この技術は、脳内の移植細胞の定量的かつ継続的な追跡を提供し、脳卒中および外傷性脳損傷を含む膨大な数の神経学的疾患に適用することができる。