Financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC 011582. experimentos de imagem foram realizados na Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus Avançado Microscopia de Luz Núcleo apoiado em parte pelo NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Número UL1 RR025780 e os Transtornos Rocky Mountain Neurlogical Núcleo Centro Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac, do Instituto Salk nos forneceu os ratos GLYT2-GFP.

1. A genotipagem Optical 1. Optical Genotipagem do mouse filhotes de cachorro <ol><li> Entrada para a expressão do respectivo marcador fluorescente usando um ponteiro laser do comprimento de onda de excitação apropriado (405 nm, nas experiências descritas aqui) e correspondente óculos de filtro de bloqueio do comprimento de onda de excitação, mas passando o comprimento de onda de emissão (450 - 700 nm, nas experiências descritas aqui) . Apontar o ponteiro laser na parte posterior da cabeça ou espinal medula de rato a pup (ver Figura 1). Evitar que brilha o laser para os olhos e longa exposição da pele à luz laser. </li></ol> 2. Optical genotipagem de animais mais velhos <ol><li> Profundamente anestesiar o rato (p14 envelhecido ao p138 nas experiências descritas aqui) com uma overdose de pentobarbital através de uma injecção intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme anestesia adequada, verificando os reflexos do animal (apertar brevemente a ponta do the orelha ou uma das patas traseiras para o reflexo de retração da orelha ou na perna). </li><li> Nota: Apesar do uso de uma overdose de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos ao procedimento de injeção como &quot;anestesia profunda&quot; em vez de eutanásia, porque o animal é idealmente ainda vivo (ou seja, seu coração ainda está batendo), quando o cirurgia e começar a perfusão. Isto assegura uma perfusão mais eficiente dos órgãos internos incluindo o cérebro. </li><li> Uma vez que o animal não mostram quaisquer reflexos, remover cuidadosamente a pele que cobre o crânio (Figura 2A), fazendo uma incisão na pele que cobre a parte traseira da cabeça de corte e para o meio do crânio. Expor o crânio expostos a luz laser e observar a fluorescência através dos óculos de filtro, conforme descrito acima. Se um sinal de GFP positiva é observada, vá para a etapa 2, se não, sacrificar o animal através de decapitação (segunda / garantindo forma de eutanásia seguindo a nossaRegulamentos IACUC). </li></ol> Nota: Nos ratos mais velhos mesmo (&gt; 1 mês) a fluorescência podem ser observados através dos olhos do animal. 2. transcardial perfusão e Preparação Cérebro <ol><li> Perfundir transcardialmente com gelada salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4, 10 mM) utilizando uma agulha de seringa de 30 L para remover em grande parte do sangue a partir de o animal. <ol><li> Primeiro, abra cuidadosamente a caixa torácica com uma tesoura afiada e, em seguida, empurre a agulha para o ventrículo esquerdo do coração. Começar a bombear a PBS para o coração e a aorta e imediatamente após este passo abrir o átrio direito do coração com a tesoura para permitir que o sangue saia do corpo. Nota: Perfusão leva de 5 - 10 minutos, dependendo do tamanho do animal. </li></ol></li><li> Após sangria por meio de perfusão, decapitar o animal, garantir a sua cabeça com o pino needles (ou 30 g) por agulhas de seringa perfurar-los através dos soquetes de olho em um prato preparação e remover o cérebro do crânio. <ol><li> Em primeiro lugar, utilizar uma tesoura afiada para cortar a pele que cobre o crânio: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça, em seguida, cortada ao longo da linha média do lado dorsal da cabeça, cortada aos lados apenas caudal de os olhos do animal e por último corte na direcção caudal, para remover completamente os retalhos de pele na parte de trás da cabeça. </li><li> Em seguida, repetir o mesmo padrão de corte para o próprio crânio, certifique-se de remover ambas as cócleas no processo, porque isso irá simplificar significativamente a remoção do tronco cerebral no final. Após este procedimento, a metade caudal do cérebro deve situar-se completamente exposta. </li><li> No passo seguinte, utilizar uma lâmina de barbear afiada ou um bisturi para cortar através de todo o cérebro anterior com um ângulo de cerca de 45 ° e cerca de 2 mm rostral do cerebelo. Retire a metade da frente separados do cérebro com abespátula ent. </li><li> Usar uma espátula para elevar a metade caudal do cérebro na sua extremidade rostral e subsequentemente cortar os nervos cranianos que ainda estão ligados ao tronco cerebral no seu lado ventral. Como resultado final, a metade caudal do cérebro, incluindo o tronco cerebral devem cair livremente fora do resto da cabeça preparados para animais. </li><li> Vire a metade caudal removido do cérebro para expor seu lado ventral e corte ao longo do plano coronal apenas rostral (para as injeções anterógradas) ou apenas caudal (para as injeções retrógradas) das &quot;lâmpadas&quot; ventrally localizados contendo o corpo trapézio (veja o passo 2.3). <ol><li> Utilize sempre uma lâmina afiada ou um bisturi para o procedimento de corte para minimizar a morte celular causada por estresse mecânico excessivo sobre o tecido. Como resultado final, um explante cérebro que mede cerca de 1 cm de comprimento e contendo o complexo olivar superior completa ao longo de outras regiões do cérebro deve ter sido obtida. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Nota: Este protocolo demonstra o processo de injecção de um traçador no corpo trapezoidal localizado no tronco cerebral auditivo. Adaptar a localização e a orientação dos planos de corte e dos locais de injecção, conforme necessário. Se as regiões do cérebro fluorescentes de interesse estão muito próximas o suficiente para a superfície do cérebro, de modo que eles podem ser identificados e injectados sem cortar o cérebro (ver Figura 2B), então o passo de corte coronal pode ser omitido. <ol start="3"><li> Identificar o corpo trapézio como dois ventrais proeminentes &quot;lâmpadas&quot; contendo o núcleo ventral do corpo trapézio (VNTB). </li></ol> Nota: Para mais referência anatômica em relação à localização estereotáxica aproximada desses planos de corte, consulte Franklin &amp; Paxinos de 2008. Panel 78 dos atlas, Bregma ~ -5,7 mm mostra o núcleo medial do corpo trapezóide (= MNTB) rotulados como &quot;Tz &quot;. Painel 69 mostra o núcleo ventral do bo trapezoidaldy (VNTB) rotulados como &quot;MVPO&quot; (núcleo periolivary medioventral) 19. 3. anterógrada / retrógrada Tracing Nota: Execute todos os procedimentos a seguir em RT (25 ° C). <ol><li> Após o corte, colocar o explante do tronco cerebral em um prato de preparação contendo oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) dissecando solução (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glicose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO3 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), prendendo-o com 30 g de agulhas de seringa. Assegure-se que a área de injecção está virada para cima. </li><li> Puxar pipetas de injecção de vidro de borosilicato e enchê-los com uma das três soluções seguintes: a) um / ml, solução 1,0 mg de subunidade choleratoxin-b conjugado com um fluoróforo Alexa 555 em PBS 12-13 (usado principalmente para transporte retrógrado), b ) um -d 1%ilution em 0,9% de solução salina de tetramethylrhodamine dextrano 555 (3.000 MW, usado principalmente para transporte retrógrado) ou c) um -dilution 1% em solução salina 0,9% de 10.000 MW dextrano-TRITC 555 (usado principalmente para o transporte anterógrado). <ol><li> Assegure-se que as resistências das pipetas de injecção gama 2,5-3,5 MOhm e que eles são fabricados em 3 - 4 ciclos de tracção. Para as experiências aqui descritas, conseguir isto seleccionando um algoritmo pré-programado puxando o puxador na pipeta. </li></ol></li><li> Iluminar o explante cérebro usando um ponteiro laser montado estaticamente do comprimento de onda apropriado (produto n ° 2 na Figura 3A; comprimento de onda de 405 nm, nas experiências descritas aqui). Use o ponteiro laser como um guia para as preparações injectáveis, e tem como objectivo o feixe de laser no núcleo cérebro marcado fluorescentemente ou células de interesse que será injectada. </li><li> Encontrar e observar a área alvo iluminado através de um microscópio binocular enquanto usava os óculos de filtragem compatíveis (450 - 700 nm, filtro passa-banda, nas experiências descritas aqui). Inserir o eléctrodo de injecção através do micromanipulador para a área de interesse. </li><li> Injectar a substância marcadora. As injecções de composto de 2 - 10 impulsos de pressão a 15 psi durante 50 ms cada, utilizando um dispositivo de injecção à pressão, dirigido perpendicularmente para a região de interesse (ROI) no interior da secção de cérebro. Administrar cada impulso de pressão em intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que o corante se espalhar. </li><li> No caso das injecções de tetrametilrodamina (TRITC), adicionalmente estimular electricamente para melhorar a absorção do corante através de electroporação com o eléctrodo colocado na área do cérebro de interesse (MNTB e VNTB nas experiências descritas aqui). <ol><li> Use 8 pulsos TTL de 8 Volts por 50 ms com 50 ms de intervalo entre intervalos, impulsionado por um estimulador e amplificados a 55 V com uma unidade de isolamento, a estimulação (itens No. 7 e 9 na Figura 3B). Use 10 - 20 repetições deste protocolo, administered durante vários minutos 7,8. Certifique-se para aterrar o eletrodo corretamente - o fio terra deve ser conectado à solução do banho! </li></ol></li><li> Entrada para o sucesso da injecção. Uma vez que um marcador fluorescente com um comprimento de onda de emissão também já está a emitir um sinal de fluorescência após excitação laser com comprimentos de onda mais curtos, para verificar visualmente a absorção do corante / espalhar na área alvo injectado enquanto iluminando a área com o laser e observando através dos filtros de óculos. </li></ol> 4. Incubação <ol><li> Após a injecção, incubar o tronco cerebral em oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucose 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, fez-se borbulhar 95% de O2 - 5% de CO2) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, enquantoo corante está a ser transportado. Bolha da solução durante todo o período de incubação. </li><li> Subsequentemente, transferir os tronco cerebral em 4% de paraformaldeído (PFA) dissolvido em PBS (aproximadamente 100 mL;. PH 7 para a mistura de PFA / PBS) e incuba-se-lhes a 4 ° C para permitir a pós-fixação durante a noite (O / N). </li></ol> 5. Tissue corte e montagem <ol><li> No dia seguinte, o tronco cerebral lavar três vezes em PBS (5 min para cada passo de lavagem), cobri-lo em 4% de agar e, em seguida, cortada em 50 - 80 pm de espessura fatias em um vibratome. Fatias de montagem utilizando um meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, e lamela. </li><li> Opcionalmente, rotular as secções com Nissl fluorescente durante 25 min (por exemplo, azul de Nissl em uma diluição de 1: 100 em meio AB). <ol><li> Para preparar meios AB, misturar 250 ml de tampão fosfato 0,2 M (PB; KH 51 mM 2 PO 4, 150 mM de Na 2 HPO 4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml de 10% de Triton-X, de 220 ​​ml ddH2O e 5 g de albumina de soro bovino. </li><li> Precede e sucede à rotulagem passo Nissl por 3 etapas de lavagem em PBS (10 min cada). </li></ol></li></ol> Nota: Nos casos em secções mais espessas necessitam de ser montadas e analisadas (em experiências aqui descritas tais fatias foram 100 - 500 mícrons de espessura para preservar ligações axonais ao longo de distâncias maiores), a técnica pode ser combinada com a limpeza dos tecidos. Nós encontramos o ClearT2 12 para ser bem sucedido 20. Quando um passo de compensação tecido está incluído, realizá-la antes da montagem das seções.

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A força geral de in vitro tracer eletroporação, ao contrário de estudos in vivo de rastreamento, é que ele dá aos pesquisadores um melhor acesso à área do cérebro de juros e, portanto, não envolve estereotáxica caro (e muitas vezes eletrofisiológico) equipamentos. Além disso, o período de sobrevivência requerido para os explantes cerebrais abrange apenas algumas horas (1 - 4) em vez de dias ou mesmo semanas, no caso de in vivo injecções marcador (ver uma revisão detalhada sob...

A fim de estabelecer um certo (micro) circuito neuronal, deve-se começar por encontrar os vários participantes do referido circuito, e seu padrão de conexão. Desde a publicação de Waller sobre rastreamento através de Lesão uma grande variedade de técnicas de rastreamento neuroanatomical neurofiber foi estabelecida. Algumas destas técnicas podem ser aplicadas no tecido fixa post mortem 2-4, outros contam com o transporte activo do corante em neurónios vivos, como descoberto em 1971 5-6. Os últimos podem ainda ser subdivididos em dois grupos que discriminam entre os métodos aproveitando retrógrada activo (a partir da zona injectada para a fonte de uma determinada projeção, ou seja. O somata de neurónios que se projectam para a referida área) e anterógrada activo (a partir do injectados área para o destino de uma determinada projeção, ie. as projeções axonal e os terminais axonais dos neurônios marcados) de transporte. Além disso, em alguns casos tramaterial de CER é injectada em animais vivos que, em seguida, sobrevivem a injecção por vários dias ou semanas (em injecções vivo tracer), enquanto que em outros casos cérebros explantados são injectados e incubar durante várias horas após a injecção no líquido cerebrospinal artificial (in vitro injecções tracer) . Neste protocolo, modificou um já existente na técnica de eletroporação vitro 7-8 para rotular somata e processos neuronais em anterógradas e rastreamento retrógrado experimentos usando choleratoxin subunidade-b e tetramethylrhodamine dextrano como as substâncias de rastreamento. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar neurocientistas com uma ferramenta eficiente para traçar padrões de conectividade neuronal entre diferentes núcleos cerebrais, enquanto aproveita as vantagens das linhas de camundongo transgênico disponíveis e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão do alvo durante injeções traçadores. Embora o método de anterógrada e retrógrada usando o rastreamentocholeratoxin e amina de dextrano e os seus respectivos conjugados marcados com fluorescência não é nova 9-13 (como é o método de electroporação, por exemplo. Haas et ai. 14), a combinação de marcador com injecções electroporação numa preparação in vitro envolvendo blocos de tecido cerebral é um desenvolvimento mais recente 7. A sua principal vantagem sobre as técnicas de rastreio neuronais utilizando o mesmo tipo de corantes marcador nos animais vivos é o aumento da intensidade de marcação, em virtude da maior eficiência com que o corante é a electroporação podem ser tomados por neurónios. Uma vantagem adicional é o período de incubação encurtado (necessário para o transporte de corante) e da sua maior precisão o alvo durante a injecção do traçador, porque o experimentador tem o controlo visual sobre a área alvo da injecção. Este último também significa que nenhum equipamento caro estereotáxica é necessário para encontrar núcleo ou o cérebro área de interesse. Para addicionalmente aumentar a precisão da focalização, que se aproveitou de uma linha de camundongo transgênico, que expressa GFP na sua subpopulação glicinérgica de neurônios 15 e equipamentos ópticos de base constituídos por um ponteiro laser de mão de 405 nm óculos de filtragem comprimento de onda e correspondência passa-banda (450 - 700 nm). Assim, conseguimos uma aumento significativo no direccionamento precisão, identificando a área de injecção através do seu sinal de fluorescência e ao proporcionar uma forma mais fina para controlar a difusão do corante dentro da área de injecção através da observação da interacção entre o sinal de GFP nativa e o traçador fluorescência. A nossa técnica também permite descobrir a funcionalidade de um circuito, juntamente com a sua conectividade por identificar neurónios inibitórios GFP positivas (ou excitatório em outras linhas de rato) que foram preenchidos com o traçador. Em resumo, ainda mais reforçada uma poderosa ferramenta para estudar o neuroscientific conectoma do cérebro de vertebrados e avaliar tEle características diferentes neuroanatomical de um determinado neurocircuit. Ao usar camundongos transgênicos, juntamente com equipamentos ópticos barata e amplamente disponível, fomos capazes de aumentar significativamente a precisão da focalização dos nossos injeções. Além disso, os ratinhos transgénicos nos permitiu identificar o tipo das ligações rastreadas, que ajudaram a descobrir a funcionalidade de um microcircuito inibitório no tronco encefálico.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate di-basic</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td></td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td></td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td></td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td></td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td></td><td>A2153</td><td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>optional, for brain clearing</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>optional, for brain clearing</td></tr><tr><td>Choleratoxin subunit-b</td><td>Molecular Probes</td><td>C-34776 (Alexa 555)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (blue)</td><td>optional</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass filaments</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Zeitz Instruments, Germany</td><td>DMZ Universal Puller</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion setup</td><td>Custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser pointer&amp;nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Filter/safety goggles</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Bionocular microscope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M3</td><td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC with installed MC Stimulus software</td><td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-channel stimulator</td><td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Stimulation isolation unit</td><td>A.M.P.I., Israel</td><td>Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige, Japan</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Nós apresentamos uma técnica que combina um protocolo in vitro injecção traçador, que utiliza uma série de impulsos eléctricos e de pressão para aumentar a absorção do corante através de electroporação em explantes de cérebro com iluminação laser direcionados e correspondentes óculos com filtro durante o procedimento. A técnica descrita de electroporação in vitro, por si só produz relativamente bom controlo visual para o objectivo de certas áreas do cérebro. Combinando-a com excitação laser de marcadores genéticos fluorescentes e sua leitura através de óculos de proteção do filtro de passagem de banda, o que pode pegar as emissões das células geneticamente marcadas / núcleos e o corante de rastreamento fluorescente, um pesquisador pode aumentar substancialmente a precisão das injeções encontrando a área de interesse e para controlar a propagação de corante / absorção na área de injecção muito mais eficientemente. Além disso, a técnica de iluminação do laser permite estudar a funcionalidade de um determinado neurocircuit por provIding informações sobre o tipo de neurónios que se projectam para uma determinada área em casos em que a expressão da GFP está relacionada com o tipo de transmissor expressa por uma sub-população de neurónios.

As Figuras 1 e 2 mostram como o ponteiro laser e óculos de laser podem ser usados ​​de forma rápida e barata genótipo animais positivos para GFP de uma ninhada. Em casos de jovens filhotes de rato, a técnica pode ser utilizada para identificar de forma não invasiva etiqueta GFP em cérebros do animal através do crânio e a pele sobrejacente (Figura 1A - D). A fluorescência emitida pode ser visto através da pele e o crânio de filhotes de rato, pelo menos até ao dia pós-nat...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K visualizações.  University of Colorado School of Medicine.  Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem. 

Vídeo: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genética

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Biologia

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurociência

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Um método para fazer uma craniotomia no crânio ventral de neonatos Roedores

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point measurements and can therefore only evaluate longitudinal changes of cell migration and survival to a limited extent. This paper provides a reliable, minimally invasive protocol to transplant and longitudinally track neural progenitor cells (NPCs) in the adult mouse brain. Before transplantation, cells are transduced with a lentiviral vector comprising a bioluminescent (firefly-luciferase) and fluorescent (green fluorescent protein [GFP]) reporter. The NPCs are transplanted into the right cortical hemisphere using stereotaxic injections in the sensorimotor cortex. Following transplantation, grafted cells were detected through the intact skull for up to five weeks (at days 0, 3, 14, 21, 35) with a resolution limit of 6,000 cells using in vivo bioluminescence imaging. Subsequently, the transplanted cells are identified in histological brain sections and further characterized with immunofluorescence. Thus, this protocol provides a valuable tool to transplant, track, quantify, and characterize cells in the mouse brain.

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

We describe the intraparenchymal transplantation of human neural progenitor cells transduced with a dual reporter vector expressing luciferase-green fluorescent protein (GFP) in the mouse brain. After transplantation, the luciferase signal is repeatedly measured using in vivo bioluminescence and GFP-expressing grafted cells identified in brain sections using fluorescence microscopy.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Resumo

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