この作品は、のSStにスイス国立科学財団（31003A_135278）からの助成金によってサポートされていました。 MOPはAXA研究基金から博士助成金の受益者です。我々は、 図1の設計のヘルプはパトリシア・ニグに感謝します。

開始前の注意：使用層流フード、適切な生物学的封じ込め生ウイルスでの作業。ここで、我々は、培養インフルエンザウイルス株A / WSN / 33の適切な成長条件を説明します。感染多重度（MOI）およびインキュベーション時間は、使用されるウイルス株に依存して変化し得ます。 ビオチン化、A / WSN / 33ウイルスの作製<ol><li>シードマディンダービーイヌkindey（MDCK）を、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて、T175のcm 2のフラスコへの細胞。約70％コンフルエントになるまで37℃で培養細胞に到達します。 </li><li>感染の前に、培地を除去し、細胞単層をカバーするのに十分大きな容量を追加することにより、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.0-7.3）で細胞を洗浄します。 </li><li> PBSを削除し、10 -4のMOIで、A / WSN / 33を細胞に感染します。 PBS中のウイルスを希釈0.02ミリグラムのMg 2+、0.01ミリグラムの Ca 2+ &lt;を補っ/ SUP&gt;、0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（感染-PBS）。 T175センチ2フラスコのために4ミリリットルの接種材料を使用してください。 </li><li>細胞を37℃で1時間インキュベートします。フラスコに0.3％BSAを添加し、吸引ピペット10ミリリットルのDMEMによって接種物を取り除き、20mMのHEPES、及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン。 </li><li>その後、収穫上清表示されており、細胞変性効果（CPE）まで約37℃で3日間細胞をインキュベートします。 CPEは、細胞14の剥離や死に続いて細胞の切り上げとして認識することができます。 </li><li>細胞の破片を除去するために5分間、450×gで上清をスピン。新しいファルコンチューブに上清を移し、この手順をもう一度繰り返します。ペレットを廃棄します。 </li><li>超遠心管とNTE緩衝液（10mMトリス[pHが7.4]、100mMのNaCl、1mMのEDTA）で希釈した30％スクロース、5 mlの下敷き上清へ転送上清。超遠心分離の前にチューブのバランスをとり、30ミリリットルの最終容量に到達するためにPBSでいっぱい。スピンsuperna112398×gでtantsは、超遠心機で90分間（SW28ローターのための25,000 RPMに相当します）。 </li><li>ピペットで注意深く上清を除去し、250μlのPBS中に4℃で一晩ウイルスペレットを浸します。ピペッティングにより再懸濁ペレット。 Bradfordアッセイ15によって精製されたウイルスのタンパク質含有量を測定します。 </li><li>ビオチン化、A / WSN / 33を生成するために、ビオチン化キットを使用してください。製造元の指示に従ってください。 </li><li>簡潔には、精製されたウイルスを、適切な量のビオチンを添加し、氷上で2時間インキュベートします。超遠心管にウイルスを移し、30ミリリットルの最終容量に到達するためにPBSでチューブを埋めます。超遠心機で90分間112389×gでウイルスをスピン。ピペットで上清を除去し、250μlのPBSを追加します。 4℃で一晩ペレットを浸します。ビオチン化ウイルスをアリコートし、格納、少なくとも24ヶ月間安定である-80℃で保存しました。 注：これは、ビオチン化Pの力価を決定するために役立つかもしれません標準的なプラークアッセイによりIAVの賠償。しかし、後続のプロトコルのみをビオチン化ウイルス粒子を測定することに留意すべきです。不完全なビオチン化のために残りの非ビオチン化粒子は、プラークアッセイにより感染力価に貢献ではなく、添付ファイル/内在化アッセイで測定された信号になります。 </li></ol> 2.ビオチン化ウイルスの必要量を決定します注：添付ファイル/内在化アッセイが行われる前に、試料の全ての細胞を感染させるために必要なビオチン化されたウイルスの量を決定することが重要です。 <ol><li>製造業者の指示に従ってA549細胞を培養し、トリプシン処理。セルチャンバーを用いて細胞を数えます。 FACSディープウェルチューブに20万A549細胞をピペット。スピン450×gで3分。上清を除去し、200μlのPBSでペレットを再懸濁。クールダウン細胞を氷上で10分間。 </li><li> biotiの5倍連続希釈液を調製します感染-PBS中にウイルスストックをnylated。 </li><li> 450 x gで3分間、4℃で細胞を含有するスピンチューブ。 100μlのウイルス含有感染-PBSで上清と再懸濁したペレットを削除します。モック対照として、ビオチン化ウイルス感染なし-PBSを使用しています。 1時間氷上でチューブをインキュベートします。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。この手順をもう一度繰り返します。 </li><li>固定のために、450 x gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）の100μl中にペレットを再懸濁。 RTで10分間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄工程）を繰り返します。 </li><li>透過性のために、450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 0.5％のトリトンX-100を含む100μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。室温で6分間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄工程）を繰り返します。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、ペルを再懸濁STV-のCy3を含むPBSで希釈した50μlの2％BSAでら。 （STV-のCy3の適切な濃度は、実験を開始する前に決定されるべきで、注意してください1の濃度で開始します。1まで200及びテスト2倍希釈：2400我々の手では、1の希釈：1,000証明最適です。） </li><li>室温で暗所で1時間インキュベートします。その後、繰り返し洗浄工程は、2.4で説明したが、PBSで希釈した200μlの2％BSA中でペレットを再懸濁。 </li><li> 16フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。 Cy3で陽性集団の門。 A549集団中のCy3陽性細胞数の最大値が得られたビオチン化ウイルスの最低濃度を選択してください。 </li></ol> 3.ストレプトアビジンの必要量を決定します 注：外ウイルス由来のシグナルを遮断する効率がアッセイの検出範囲を決定します。したがって、できるだけSTV-Cy3シグナルを排除することが重要です。目STVのE必要量は、（セクション2で決定）を使用し、ビオチン化ウイルスストックの量に依存する必要がありました。 <ol><li>手順2.1から2.4に従いますが、セクション2で決定したウイルス濃度を使用しています。 </li><li> 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈したSTVの5倍連続希釈液を調製します。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、50μlのSTVの希釈でペレットを再懸濁。モック対照としてSTVずに2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSを使用します。氷上で30分間チューブをインキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>ステップ2.5から2.9に従ってください。内在化アッセイのために、（何STVが存在しないた試料と比較して）のCy3シグナルの強力なブロックの結果STVの最低濃度を選択します。このため、CY3陽性細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度の比率を使用することができます。理想的には、STV処理サンプルのCy3シグナルは、偽感染からの信号の近くに配置してくださいできるだけ細胞。 </li></ol> 4.添付ファイル/内在化アッセイ 注：アッセイを開始する前に、すべての試薬を準備していることを確認してください。プロトコルへの3つの制御結果セクション（モック感染細胞、ノイラミニダーゼ前処理した細胞とアジ化ナトリウムで処理した細胞）に提示グループの小さな変更のために必要とされます。 <ol><li>それぞれ200,000 A549細胞を含む16ディープウェルのチューブを準備します。次の4管から成る実験セットに、3制御条件、4チューブを必要とする各があります：モック感染した細胞は、ノイラミニダーゼ（NA）は、細胞とアジ化ナトリウムで処理した細胞を-pretreated。各グループは、「0分」、「0分+ STV &#39;、&#39;30分&#39;、&#39;30分+ STV」とラベルされた4のチューブで構成されています。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 </li><li> 450×gで4℃でスピンチューブ。上清を除去し、ペルを再懸濁0.3％のBSA、20mMのHEPESおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（培養培地）を含有する200μlのDMEMにおいてら。 37℃で30分間インキュベートします。 注：使用細菌ノイラミニダーゼ（例えばシアリダーゼビブリオコレラから）mlの細胞を再懸濁するために、インキュベーション培地に希釈/ 200ムーの濃度で：ノイラミニダーゼ制御のため。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 10分間氷上でチューブを冷却、その後、この手順をもう一度繰り返します。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 （感染-PBSで希釈したセクション2で決定したウイルス濃度を使用）、100μlのビオチン化ウイルスで上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で1時間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄ステップを繰り返します。 注：モック感染制御の場合：ウイルス感染せず、PBSを使用してください。アジ化ナトリウムを制御するために：感染-PBSで希釈したウイルスを使用し、0.1％のアジ化ナトリウムを補充しました。 </li><li>プロの氷上での感染後のサンプルのcessing： <ol><li>他のサンプルが固定されるまで、「0分」のサンプルについて、4℃でステップ2.5と店舗のサンプルに従ってください。 </li><li> 450×gで3分間、4℃で0分+ STV」のサンプル、スピンチューブ用。 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈した50μlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）（サンプルの処理中に内在化を防ぐために）で上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4​​から2.5とストアのサンプルに従ってください。 </li><li> 450×gで3分間、4℃で&#39;30分 &#39;サンプル、スピンチューブ用。 2％BSAを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 37℃で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4​​から2.5とストアのサンプルに従ってください。 注：アジ化ナトリウム制御について：使用PBSを37℃で30分間のインキュベーションのために、2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました。 </li><li> 「3の場合0分+ STV」のサンプルは、450×gで3分間、4℃でチューブをスピン。 2％BSAを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 37℃で30分間インキュベートします。その後、450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈した50μlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）（サンプルの処理中に内在化を防ぐために）で上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4​​から2.5とストアのサンプルに従ってください。 注：アジ化ナトリウム制御について：使用PBSを37℃で30分間のインキュベーションのために、2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました。 </li></ol></li><li>手順2.6から2.8に従って、フローサイトメトリーによってサンプルを分析。各サンプル中のCy3陽性細胞の割合を決定します。 </li><li>パーセンテージ添付ウイルスおよび内在化ウイルスの相対的な量を計算します。 <ol><li>付着したウイルスの量を計算するために、Cy3でPOSITIの割合を使用しゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度をまし。比較のために、100％（ 図4B）に未処理細胞を設定します。 注：添付ウイルスの割合を「0分」サンプルによって記述されます。 </li><li>内在化ウイルスの量を計算するには、「30分」のサンプル（ 図5B）に「30分+ STV」のサンプルの比を取ります。 注：上記のように、Cy3の正のゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度の比率を使用することができます。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーにより、ウイルスの付着および内在化を測定する簡単な方法を説明します。これは、ウイルス様粒子（VLP）の使用と比較して、より厳密に模倣ウイルス感染標識野生型ウイルスの使用を可能にします。我々のプロトコルは、IAVの付着および内在化を測定するために最適化されているが、容易に他のウイルスに適合させることができます。フロー?...

インフルエンザAウイルス（IAV）のエントリは、標的細胞1の細胞膜上の受容体へのウイルスの結合で開始する多段階プロセスです。 IAVの受容体は、糖タンパク質および糖脂質の多種多様に存在するシアル酸です。ウイルスエンベロープ中に存在するIAVのヘマグルチニン（HA）タンパク質は、シアル酸に結合し、それによって標的細胞2の原形質膜へのウイルス粒子の付着を媒介します。ウイルスは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して細胞に入るだけでなく、マクロピノサイトーシスなどの代替エントリー経路は、3-6に記載されています 。 HAとシアル酸との間の相互作用は、付着およびウイルス粒子7の内在化をトリガ両方を媒介するのに十分であるように見えます。それにもかかわらず、代替エントリー受容体が提案されているとIAVエントリにおける役割は、現在、1,8,9を検討されています。 CURrently、努力が緊急に必要とされる、新規な抗ウイルス治療法10-12開発を目的としたウイルスのライフサイクルに関与する宿主因子を同定するために行われます。ウイルス侵入は、その最も早い時点でウイルス感染を阻止するために、IAV増殖を標的とするための有利なステップになります。ウイルスの通常大量の着信ウイルスを検出するために必要とされる実験IAVエントリの異なる段階を測定することは困難です。加えて、ウイルス侵入の変化の検出範囲のみによりウイルス複製の欠如に線形です。これは、高感度のアッセイのための必要性を強調する。 ここで本発明のアッセイは、細胞表面に付着したウイルスの検出ならびに細胞関連ウイルスの合計量に対する内在ウイルスの検出を可能にします。ビオチン化野生型ウイルスの使用は、STV-Cy3およびフローサイトメトリーによる読み出しに染色を通じて便利な測定を可能にします。ビオチン化ウイルスは、細胞に冷結合していますSを付着させるが、ウイルス粒子の内在化を防止することができます。細胞は、固定された透過性および添付のウイルスを測定するために、STV-Cy3で染色することができます。ブロッキング工程は、細胞が非標識ストレプトアビジン（STV）と一緒にインキュベートされた固定の前に適用される場合、細胞外、添付ビリオンからの信号を排除することができます。次のステップでは、ビオチン化IAVの取り付け後、温度を37℃にシフトされ、ウイルス粒子の内部移行を行わせます。内在粒子は、それによって細胞外および細胞内のウイルスとの識別を可能STVの結合から保護されています。 実験条件ごとに、4つのサンプルが必要とされている：「0分」：最初のサンプルは、標識された「0分」、細胞表面で冷間結合ウイルスを測定することです。 「0分+ STV &#39;：&#39; 0分+のSTV「標識された第二のサンプルは、実験のベースライン信号強度を与えます。添付ウイルスはウィットをブロックされていますSTV-Cy3で染色以下の時間STVと信号が「0分」のサンプルと比較してはるかに低いことが必要です。 &#39;30分 &#39;：第三のサンプル、&#39;30分&#39;が原因で30分間、37℃に温度シフトに取り付けられ、ウイルスを内在化含まれています。 &#39;30分+ STV &#39;：第4のサンプル、&#39;30分+ STV」対策ウイルスの細胞内画分。 STVブロッキング工程は、30分のインキュベーション期間の後に適用されます。その結果、細胞表面でのウイルス粒子は、STV-Cy3で染色するための唯一の内在化ウイルスは、利用可能な脱離STVによって結合されます。内在化ウイルスの相対的な量は、「（サンプル&#39;30分によって記述）ウイルスの総量で割った（サンプル&#39;30分+ STVで測定される）「内在ウイルスの比として計算することができます。 コントロールとして、我々はモック感染した細胞を含むことを示唆しています。モック感染細胞のSTV-Cy3の染色以下の信号はバックグラウンドを提供します染色プロトコルに起因します。 IAV結合のためのコントロールは、細菌ノイラミニダーゼ（NA）を用いた細胞の前処理です。細胞性糖タンパク質からシアル酸をオフNAを切断し、それによって細胞表面から付着受容体を除去します。アジ化ナトリウム（SA）は、強力な代謝阻害剤であり、それによって、ブロックが13をエンドサイトーシス。アジ化ナトリウムで処理した細胞は、内在化のための結合ウイルスに陽性であるが負でなければなりません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

四つの異なる実験条件を説明する漫画は 、図1に示されている代表的な実験の結果を図2に提示されている- 。5。 「0分」のサンプルでは、ビオチン化したウイルスは、低温結合であるSTV-Cy3の染色によって可視化することができる細胞を標的とするために（ 図1および 2）。 （ &quot;0分+ STV」サンプルで）ブロッキング?...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K ビュー.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

ビデオ: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

免疫・感染学

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.