The authors thank Davy Opdenacker for technical assistance and photography. We greatly thank Dr. Annick Bleys for helpful suggestions to improve the manuscript. This work was financed by the Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS' from the Belgian Federal Science Policy Office, by the FWO grant G027313N and by the Agency for Innovation by Science and Technology, IWT (IR).

1. 애기 장대 LRIS 프로토콜 참고 : 텍스트는 &quot;작은&quot;또는 &quot;큰&quot;규모의 실험을 의미한다. 이러한 마커 라인 분석 및 조직 학적 염색법 6, 14 등의 소규모 실험은 단지 몇 개의 샘플을 필요로한다. 이러한 정량적 실시간 QRT-PCR 마이크로 어레이 9-11 또는 RNA 시퀀싱 같은 대규모 실험은 샘플의 더 많은 양을 필요로한다. 따라서, 샘플 1000 모종이 Vanneste 등의 알에 의해 사용되었다 ~의. (11) 양이 루트 세그먼트 절개 후 마이크로 어레이 실험을 수행 할 수 있습니다. DAY 1 <ol><li> 애기 씨의 살균 참고 : 종자 살균을위한 다음 절차 중 하나를 선택합니다. 그들 중 임의의 프로토콜의 다음 단계에 적합하다. 가스 멸균 (1.1.2) 액체 살균 (1.1.1)을 통해 두 가지 장점을 제공합니다 : 큰 감각을 처리 할 때이 시간이 적게 걸립니다씨앗 어, 더 피펫 개별 샘플에 대한 발생이 없기 때문에, 및 소독 종자 장기간 저장 될 수있다. 그러나, 건조기 및 취급에주의가 필요합니다. <ol><li> 액체 살균 <ol><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 종자의 수를 붓는다. 2 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 1.5 ML 튜브에 20 mg의 (~ 800 씨앗) 또는 40 밀리그램 (~ 1600 씨앗)까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. 반전 또는 부드럽게 2 분 동안 흔들어. </li><li> 15 분 동안 1 ml의 살균 용액으로 70 % 에탄올을 교체합니다. (신선한 살균 솔루션 준비 : 3.85 ml의 차아 염소산 나트륨 (NaOCl에) 주식 (12 %) (주의 :이) 후드를 연기 5 μL 트윈 (20), 물 10 ㎖까지의 모든 씨앗이 올 있는지 확인하기 위해 튜브를 여러 번 전환. 용액과 접촉. </li><li> 반복하여 층류 공기 유동 캐비닛, 5 분 동안 종자 5 회 1ml의 멸균 증류수로 멸균 용액을 대체 린스LY 신선한 멸균 증류수 1 ㎖로 교체. </li></ol></li><li> 가스 멸균 <ol><li> 2 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 종자의 수를 붓는다. 여러 개의 독립적 인 라인 작업을 할 때 각각의 튜브를 사용하여, 그들을 플라스틱 마이크로 원심 분리기 튜브 상자 또는 홀더에 열 준비. 하나의 튜브에서 씨앗의 수가 500 (12.5 mg)을 초과하는 경우, 성공을 보장하기 위해 멸균 튜브의 적절한 수의 씨앗을 분할. 이웃 튜브의 캡은 서로를 가리지 않도록해야합니다. 이 살균뿐만 아니라 건조기에 있어야 같이, 하단 박스의 덮개를 함께 장착한다. </li><li> 유리 비커와 함께, 데시 케이 터의 그릇에 상자를 놓고 (주의 :이 후드를 연기). </li><li> (: 사용 흄 후드주의) 12 %의 NaOCl 100 mL로 비커를 입력합니다. 데시 케이 터에 뚜껑을하는 듯했으나 비이커 저장하는 작은 구멍을 둡니다. </li><li> (CAU을 37 % 염산 (발연)의 3 ML을 추가TION : 사용은 작은 구멍을 통해 비커에 후드를) 연기 빠르게 건조기를 닫습니다. CL 2 - 가스 형성으로 인해 약간의 시간에 대한 솔루션 의지 거품. 시스템을 남기기는 O / N (또는 적어도 8 시간)을 마감했다. </li><li> 데시 케이 터의 뚜껑을 제거합니다. 상자를 꺼내 운송 중에 오염을 방지하기 위해 뚜껑을 커버한다. </li><li> , 층류 공기 흐름 캐비닛에 상자를 넣어 뚜껑을 제거하고 가스 방출을 허용하도록 실온에서 약 1 시간 동안 씨앗을 둡니다. 참고 : 씨앗 안전하게 4 ° C에서 최대 2 주 동안 폐쇄 마이크로 원심 분리기 튜브에 건조를 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 애기 장대에서 측면 루트 유도 <ol><li> 측면 루트 억제 (NPA 처리) <ol><li> 체외 성장을위한 성장 매체를 준비합니다. 배지는 무라 시게 및 반 강도 스쿡 염 혼합물 (15), 0.1 g / 리터 미오 - 이노시톨, 10g / L 수 크로스를 포함하고 0.5로 버퍼링G / L 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 산 (MES). </li><li> 1 M KOH와 5.7 pH를 조정합니다. 식물 조직 한천 8g / L를 첨가하고 121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브 매체. </li><li> 디메틸 설폭 시드 (DMSO) (: 장갑을 사용주의) NPA의 25 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. 층류 공기 유동 캐비닛 (병을 손에 유지 될 수있는 온도이다) 약 65 ° C까지 멸균 배지를 냉각하고, 10 μM NPA의 최종 농도를 얻기 위해 25 mM의 NPA 스톡 용액을 첨가. </li><li> 부드럽게 10 초 동안 병을 흔들어 또한에 균질화. 사각형 페트리 접시 당 배지 50 ㎖ (12cm X 12cm)를 따르십시오. 주 : 대규모 실험의 경우, 환경 전송을 보장하기 위해 나일론 메쉬 (20 ㎛의)을 적용한다. 고압 증기 멸균 (그림 1A)를위한 메쉬 (9cm X 9cm)를 준비합니다. 멸균되면 무균 핀셋 (도 1b)을 사용하여 성장 배지에 메쉬를 적용한다. 부드럽게 인트를 사용하여 성장 배지에 메쉬를 밀어(: 무균 조건에서 작업주의)는 성장 매체 (그림 1B)와 잘 접촉되어 있는지 확인 drigalsky을 rilized. </li><li> NPA-접시에 씨앗을 뿌리고. , 경우 대규모 실험이 계획되어있다 (1.2.2.3 참조) 샘플링을 용이하게하기 위해 (50) 씨의 2 조밀하고 잘 정렬 된 행을 뿌리 참고. <ol><li> 액체 살균 경우, 200 μL 피펫을 사용하여 NPA-접시에 씨앗을 뿌리다. 3 잘라 - 위해 멸균 조건 (또는 팁 멸균 전)에 피펫 팁의 끝 4 MM은 씨앗을 피펫 할 수 있습니다. 피펫 위로 씨앗을 다시 중단 할 몇 번 다운 후 10 약 150 μL 멸균 물을 피펫 - (20) 씨와 팁의 맨 아래에있는 씨앗 침전물 때까지 기다립니다. (주의 : 무균 조건에 대한 작업) 참고 : 끝으로 부드럽게 한천 또는 메쉬를 터치하면, 씨앗과 물 한 방울은 그것 (그림 1C)에서 발표 될 예정이다. </li> &lt;가스 멸균 경우 리&gt;, 접착 표면을 보장하기 위해 씨앗을 복용하기 전에 멸균 toothpicks.Pinch에게 한천에 이쑤시개를 이용하여 씨앗을 뿌리다. 이쑤시개를 사용하여 하나 씨앗 하나를 들고 플레이트 (그림 1D)에 씨앗을 배포 할 수 있습니다. (: 무균 조건에서 작업주의) 또는 씨앗에 멸균 물을 추가하고 1.2.1.5.1에​​ 기술 된 바와 같이 뿌리다. </li></ol></li><li> 통기성 접착 테이프로 번호판을 봉인하고 최소 2 일 최대 일주일 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 그들에게 접시를 저장합니다. 이것은 계층화 동기화 보장하고보다 효율적인 발아 필요하다. 주 : 대안 적으로, 종자는 파종 전에 성층 적은 냉장고 공간을 필요 마이크로 원심 분리기 튜브, 증류수에 침지 될 수있다. 이 경우, 4 ° C에서 적어도 하나의 주 튜브를 저장하고, 즉시 (1.2.1.7 참조​​) 파종 후 생장 캐비닛 판을 이동. 3 일 </리&gt; <li> 성장 캐비닛에 판을 이동 (연속 빛 (110 μE 분 -2 S-1), 21 ° C를) 거의 수직 위치에 오일 (발아 2 일 및 성장 3 일)에 대한 (80-90 °) 매체의 루트에 성장하지를 보장합니다. 8 일 </li></ol></li><li> 측면 루트 유도 (NAA 처리) <ol><li> 1.2.1.1 및 1.2.1.2에 기재된 것과 같은 성장 배지를 준비한다. (: 장갑을 사용주의) DMSO에서 NAA의 50 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. 아래로 65​​ ° C로 멸균 매체 쿨 10 μm의 NAA의 최종 농도 얻기 위해 매체에 NAA 솔루션을 추가 (주의 : 무균 조건에서 작업을). <ol><li> 부드럽게 10 초 동안 병을 흔들어 또한에 균질화. 사각형 페트리 접시 당 배지 50 ㎖ (12cm X 12cm)를 따르십시오. </li></ol></li><li> 그 SUP 10 μM NPA 보충 된 성장 배지를 함유하는 플레이트로부터 모종을 전송할10 μm의 NAA와 plemented. <ol><li> 모종의 자엽에서 곡선 핀셋의 팔을 걸고 부드럽게 판에서 제거합니다. 만 뿌리가 완전히 바람직 아래로 NPA 성장 매체와 접촉 성장하는 모종을 전송합니다. </li><li> 작은 거리에 걸쳐 NAA 함유 증식 배지 표면 위에 뿌리 탈지. 식물 뿌리가 성장 매체와 잘 접촉되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 핀셋 성장 배지 표면에 부드럽게 루트를 누른다. 주 : 대규모 실험의 경우, 핀셋 개의 상부 모서리에서 메쉬를 올려 메쉬와 전사와 접촉하지 않는 모든 묘목을 제거한다. 확인 메시는 작은 거리 (그림 1E)를 통해 한천 표면에 메쉬를 감추고하여 NAA 함유 매체와 좋은 접촉합니다. </li></ol></li><li> 통기성 테이프로 새 판을 밀봉 (성장 캐비닛에 콘을 배치연속적인 빛 샘플링까지 유도 후 원하는 시간에 대한 수직 위치 (110 μE 분 -2 S-1), 21 ° C를). 주 : 대규모 실험의 경우, 메시 한꺼번에 직접 루트 세그먼트를 잘라내어 부드럽게 메쉬의 표면을 긁어 그들을 샘플 메스를 사용한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRIS 옥수수 프로토콜 <ol><li> 옥수수 커널의 계층화 <ol><li> 최소 1 주일 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 옥수수 커널을 품어. 주 :이 프로토콜은 B73 옥수수 근친 라인을 사용하여 개발되어왔다. </li></ol></li><li> 옥수수 커널의 살균 DAY 1 주 : 옥수수 묘목 멸균 조건에서 재배 할 필요는 없지만, 그것은 종이 롤 곰팡이 성장을 방지하는 옥수수 커널을 살균 및 멸균 재료와 함께 작동하도록 권장체계. <ol><li> 멸균 유리 비커에 옥수수 커널의 필요한 번호를 넣습니다. </li><li> (물에 6 %의 NaOCl) 살균 용액 (: 사용 흄 후드주의) 100 ㎖를 추가합니다. </li><li> 자기 교반 막대를 추가하고 5 분 동안 실온에서 낮은 교반 속도 (약 250 RPM)에서 자석 교반기에 비커를 놓습니다. </li><li> 신선한 멸균 물 100ml와 솔루션을 대체하여 5 분 동안 다섯 번 씻어. </li></ol></li><li> 옥수수 커널 파종 <ol><li> 오염의 위험을 감소시키고, 종이 타올의 롤을하기 위해 장갑을 착용 할 것. </li><li> 두 장 (약 92cm X 24cm)의 총 길이와 손 타월 용지 두 뻗어을 눈물과 깨끗한 표면 (그림 2A)에 서로의 상단에 배치합니다. </li><li> 시트 길이 (약 92cm X 12cm) (그림 2A)를 통해 두 번 접습니다. </li><li> T를 통해 상단에서 약 2cm에서 10 커널을 배포하는 핀셋을 사용하여그는 용지의 전체 길이, 양쪽 끝 (그림 2B)에서 무료로 각각의 커널과 8cm 사이 8cm의 공간을 유지하면서. 커널의 잔뿌리가 아래로 용지 (그림 2B)를 향하도록되어 있는지 확인합니다. </li><li> 씨앗 장소에서 (그림 2B)를 유지하면서 부드럽게, 길이에 걸쳐 용지를 굴립니다. 압연을 용이하게하기 위해, 먼저 무균 물 종이 스프레이 선택적이다. </li><li> 약 6cm 직경 14cm 높이 (예를 들어, 250 ML의 원심 분리기 튜브)의 멸균 유리 튜브의 용지 롤을 넣고 랙 (그림 2C)에 배치합니다. </li></ol></li><li> 옥수수의 측면 루트 유도 <ol><li> (DMSO에 용해) 50 mM의 NPA 주식 솔루션 (: 장갑을 사용주의)를 준비합니다. </li><li> 각 튜브를 들어, 멸균 유리 비이커에 125 ㎖의 멸균 수에 50 mM의 NPA 스톡 용액 125 μL를 첨가하여 50 μM NPA 용액을 만든다. </li><li> 잘 믹스튜브에서 롤 페이퍼 위에 50 μM NPA 용액 125 ㎖에 붓는다. 종이 롤 용액을 흡수하여 완전히 침지 될 것이다. 참고 : 다른 크기 용지 롤 및 튜브를 사용하는 경우, 그에 따라 볼륨을 조정합니다. 액체는 충분한 흡수를 보장하기 위해 중간 관에 도달한다. </li><li> 삼일 (27 ° C, 연속 빛, 70 % 상대 습도)에 대한 성장 캐비닛에 용지 롤 시스템을 놓습니다. 이 솔루션은 시간 (그림 2D)를 통해 증발하기 때문에 용지 롤이 추가로 50 μm의 NPA 솔루션을 추가하여 젖은 상태로 있는지 확인합니다. 4 일 </li><li> (DMSO에 용해)의 50 mM NAA 주식 솔루션 (: 장갑을 사용주의)를 준비합니다. </li><li> 각 튜브를 들어, 멸균 유리 비이커에 125 ㎖의 멸균 수에 50 mM의 스톡 NAA 125 μL를 첨가하여 50 μM의 NAA 용액을 제조 하였다. </li><li> 조심스럽게 종이 롤에 남아있는 NPA 솔루션의 대부분을 짜내 및 배치5 분 동안 멸균 M은 (: 장갑을 사용주의)을 씻어. 조심스럽게 종이 롤에서 대부분의 물을 짜내. 이 세척 단계를 세 번 반복합니다. </li><li> 잘 믹스와 튜브의 용지 롤을 통해 50 μM의 NAA 솔루션을 붓는다. 그들이 완전히 담가되어 있는지 확인합니다. </li><li> 유도 후 원하는 기간 동안 성장 캐비닛 (27 ° C, 연속 빛, 70 % 상대 습도)에 용지 롤 시스템을 놓습니다. </li></ol></li><li> 옥수수의 외래성 크라운 뿌리에 측면 루트 유도 참고 : LRIS를 기본 루트에 측면 뿌리를 유도하는 상술 한 바와 같이. 그러나, 옥수수와 함께 그들의 측면 뿌리와 다른 외떡잎, 기본 루트와 배아 정액 뿌리에서, 개발 모종 동안 주로 중요하다. 식물 성장의 후기 단계에서, 포스트는 부정근 배아 줄기에 발생하고 또한 새로운 루트 시스템 (16)을 형성하는 측면 뿌리를 개발한다. LRIS도 사용 될 수 있습니다d는 배아 기본 루트에 LRIS에 약간의 조정에 따라이 후 배아 우발적 인 크라운 뿌리에 측면 뿌리를 유도한다. <ol><li> 용지 롤을하려면, 외부 측면에 손 타월 종이 각각 두 개의 층, 및 내 발아 용지 두 레이어 논문의 샌드위치를​​ 만들 수 있습니다. 발아 용지의 두 시트 사이에 살균 커널 (단계 2.2 2.1 참조) 놓습니다. 발아 용지, 핸드 타올 용지에 비해 용지의 개방 나중에 쉽게 롤 만들 것입니다 루트 머리와 측면 뿌리에 의해 침투 될 경향이 덜 될 것입니다. 한편, 핸드 타월 용지 두 외부 층은 액체의 흡수를 촉진 할 것이다. </li><li> 700 mL 유리 튜브에 롤을 삽입하고 그들을 경찰청없이 멸균 물을 부어. 그들이 완전히 담가되어 있는지 확인합니다. </li><li> 성장 캐비닛의 살균 커널 발아 (단계 2.4.9 참조). </li><li> 우발적 인 크라운 뿌리까지 모종을 성장(B73 6 일간) 등장하기 시작합니다. 용지 롤이 필요한 경우 멸균 물을 추가하여 항상 젖은 유지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 세척 단계 후 50 μM의 NAA 솔루션 경찰청 솔루션을 대체하여 측면 루트 개시 유사한 유도 다음 사일 (단계 2.4.4에 2.4.1 참조) 25 μm의 NPA 용액에 전송한다 (단계 2.4 참조 2.4.9에 .5). </li></ol></li></ol>

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	<li>Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+branch+or+not+to+branch:+the+role+of+pre-patterning+in+lateral+root+formation.">To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation.</a> Development. 140, 4301-4310 (2013).</li><li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organisation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root.">Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root.</a> Development. 119, 71-84 (1993).</li><li>Bell, J. K., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histological+study+of+lateral+root+initiation+and+development+in+Zea+mays.">A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays.</a> Protoplasma. 70, 179-205 (1970).</li><li>Benkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local,+efflux-dependent+auxin+gradients+as+a+common+module+for+plant+organ+formation.">Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation.</a> Cell. 115, 591-602 (2003).</li><li>Beeckman, T., Burssens, S., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peri-cell-cycle+in+Arabidopsis.">The peri-cell-cycle in Arabidopsis.</a> J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).</li><li>Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inz&#233;, D., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-mediated+cell+cycle+activation+during+early+lateral+root+initiation.">Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation.</a> Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).</li><li>Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+system+for+lateral+roots+in+Arabidopsis+thaliana+and+maize.">Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize.</a> Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).</li><li>Casimiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+transport+promotes+Arabidopsis+lateral+root+initiation.">Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation.</a> Plant Cell. 13, 843-852 (2001).</li><li>Himanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profiling+of+early+lateral+root+initiation.">Transcript profiling of early lateral root initiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).</li><li>De Smet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-like+kinase+ACR4+restricts+formative+cell+divisions+in+the+Arabidopsis+root.">Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root.</a> Science. 322, 594-597 (2008).</li><li>Vanneste, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+progression+in+the+pericycle+is+not+sufficient+for+SOLITARY+ROOT/IAA14-mediated+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana.">Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin.">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).</li><li>Jansen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomics+as+a+tool+for+the+identification+of+root+branching+genes+in+maize.">Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize.</a> Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).</li><li>Parizot, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarch+symmetry+of+the+vascular+bundle+in+Arabidopsis+root+encompasses+the+pericycle+and+is+reflected+in+distich+lateral+root+initiation.">Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation.</a> Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitious+roots+and+lateral+roots:+similarities+and+differences.">Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences.</a> Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).</li><li>Grunewald, W., Parizot, B., Inz&#233;, D., Gheysen, G., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+roots:+One+common+pathway+for+all+angiosperms?.">Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms?.</a> Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).</li><li>Parizot, B., Beeckman, T., Crespi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+root+development.">Genomics of root development.</a> Root Genomics and Soil Interactions. , 3-28 (2012).</li><li>Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting+of+plant+protoplasts.">Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection,+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types:+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize.">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15, 583-596 (2003).</li><li>Ludwig, Y., Hochholdinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+cells.">Laser microdissection of plant cells.</a> Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).</li><li>Beeckman, T., Engler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+technique+for+the+clearing+of+histochemically+stained+plant+tissue.">An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).</li><li>Ditengou, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+induction+of+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana.">Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).</li><li>Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+fluxes+in+the+root+apex+co-regulate+gravitropism+and+lateral+root+initiation.">Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation.</a> J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).</li><li>Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+root+formation+in+rice+(Oryza+Sativa.+L.):+differential+effects+of+indole-3-acetic+acid+and+indole-3-butyric+acid.">Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid.</a> Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).</li><li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings.">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li><li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethylene+on+uptake,+distribution,+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C.">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li><li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2,4-dichlorophenoxy+acetic+acid,+naphthalene-1-acetic+acid,+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells.">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li><li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgenomics:+genome-scale,+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers.">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li><li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor.">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

애기 LRIS 프로토콜에서, 오직 완전히 NPA 함유 증식 배지와 접촉 성장한 묘목을 전송하는 것이 중요하다. 이 측면 루트 개시는 전체 루트 길이에 걸쳐 차단되는 것을 보장한다. 전송 중에 묘목 부상 방지하기 위해, 만곡 된 포셉 팔 종묘의 자엽 하에서 후크 될 수있다. 전송시, 묘목의 뿌리가 NAA 함유 한천 배지와 충분한 접촉에 있는지 확인하십시오. 이것은 작은 거리에 걸쳐 한천 표면에 뿌?...

이 토양에서 앵커리지 및 물 섭취와 영양분을 보장 이후 루트 시스템은 식물 성장에 중요하다. 루트 시스템의 팽창은 주로 측면 뿌리의 생산에 사용하기 때문에, 그 개시 및 형성은 널리 연구되고있다. 측면 뿌리는 설립자 세포 1이라고 pericycle 세포의 특정 부분 집합으로 시작됩니다. 옥수수와 같은 외떡잎에, 그들은 사부 극 3에서 발견되는 반면, 같은 애기 장대와 같은 대부분의 dicots, 이러한 세포, protoxylem 기둥 2에 있습니다. 설립자 세포는 특정 세포주기 유전자의 발현에 이어 증가 옥신 반응 (4)에 의해 표시된다 (예를 들어, 사이클린 B1 1 / CYCB1는 1), 그 후 그들이 비대칭 배사 부문 (5)의 첫 번째 라운드를 겪는다. 조정 배사와 periclinal 부문의 일련의 후 측면 루트 primordium 최종적으로 부상 할 것으로 형성된다utonomous 측면 루트. 이러한 이벤트가 풍부한이나 동기화도 있기 때문에 위치 및 측면 루트 개시 타이밍은, 그러나 예측하지 않습니다. 여기에는이 과정을 연구하기 transcriptomics 분자 접근법의 사용을 방해한다. 이를 해결하기 위해, 횡 루트 유도 성 시스템 (LRIS)는, 6 개발되었다 (7).이 시스템에서는, 묘 먼저 따라서 횡 루트 개시를 막고, 옥신 전송 및 축적을 억제하는 N -1- naphthylphthalamic 산 (NPA)로 처리 8. 이어서 합성 옥신 -1- 나프탈렌 초산 (NAA)를 함유하는 배지에 종묘를 전송함으로써, 전체 pericycle 층함으로써 대규모 고가 옥신 레벨 유도부 횡 루트 개시 세포 분열 (6)에 응답한다. 이와 같이,이 시스템은 후반의 특정 스테이지에 대해 농후 루트 샘플의 수집을 용이하게, 고속 동기 및 광범위한 측면 뿌리 시작 (initiation)에 이르게RAL 루트 개발. 이어서, 이들 샘플은 횡 루트 형성 동안 게놈 전체의 발현 프로필을 결정하기 위해 사용될 수있다. LRIS 다른 식물 종에이 시스템을 적용하는 측면 루트 애기 장대의 시작과 옥수수 9-13,하지만 필요에 대해 이미 상당한 지식을 나왔고 더 게놈 서열대로보다 명확하게하고 경제적 중요한에게 지식을 전달하는 관심이 높아지고있다 종. 여기, 애기 장대와 옥수수 LRISs의 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 다음, 시스템의 사용의 예는 옥수수 LRIS 얻은 transcriptomics 데이터가 다른 식물 종에 걸쳐 횡 루트 개시 동안 보존 된 기능을 가질 기능적 동족체를 식별하기 위해 사용할 수있는 방법을 예시하여 제공된다. 다른 종의 식물이 제안에 대해 마지막으로, 지침 LRIS을 최적화합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ARABIDOPSIS LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gas sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>glass desiccator</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic micro-centrifuge tubes box or holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%</td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog salt mixture</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Sucrose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Making a mesh for transfer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Synthetic nylon mesh 20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square petri dish plates</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN tubes</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&amp;nbsp;50 ml centrifuge tubes</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cut pipette tips</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving</td></tr><tr><td>breathable tape&amp;nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth room</td><td></td><td></td><td>21 &amp;deg;C, continuous light</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MAIZE LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maize kernels</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of kernels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetic stirrer&amp;nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &amp;micro;M (maize primary root), 25 &amp;micro;M (maize adventitious root)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &amp;micro;M (maize)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paper hand towels</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>seed germination paper</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# seed germination paper</td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (centrifuge) tubes</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml tubes</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylinders, round foot tube, D 60&amp;nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>for maize tubes, home made</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth cabinet</td><td></td><td></td><td>27 &amp;deg;C, continuous light, 70% relative humidity</td></tr></tbody></table>

lateral root inducible system in arabidopsis and maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

LRIS의 응용 프로그램 측면 루트 개시 과정의 비교 Transcriptomics를 수행하는 LRIS의 하나의 응용은 다른 종에서 횡 루트 형성시와 비교하여 유전자 발현 양상의 상관 관계이다. 비교 transcriptomics는 다른 종의 측면 루트 개발 과정에 참여 orthologous 유전자를 찾아 낼 수있는 가능성을 만들어 접근한다. 이미 형성된 루트 ...

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Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

의 측면 루트 유도 성 시스템<em&gt; 애기 장대</em&gt;과 옥수수

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

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Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

연구

생화학

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

유전학

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

생체공학

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

환경과학

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

발생학

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

생물학

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-mediated Hairy Root Induction and Regeneration in Plants(식물의 Agrobacterium 매개 털뿌리 유도 및 재생)

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

저자 스포트라이트: Optimization Hairy Root-based Transformation Protocols for Enhanced Efficiency in Brassicaceae

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

의 측면 루트 유도 성 시스템

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