Name: using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography
Uploaded: 2016-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
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私たちはコメント博士ウィリアム・マーゴリンに感謝します。私たちは、博士からSerialEMのサポートに感謝しています。デビッドMastronardeとチェン徐。 DM、BHとJLは、ウェルチ財団から国立アレルギー感染症研究所、総合医科学研究所（NIGMS）から補助金R01GM110243とR01GM107629、グラントAU-1714からの助成金R01AI087946によってサポートされていました。直接電子検出器は、健康賞S10OD016279の国立研究所によって資金を供給されました。

1.ミニ細胞の準備<ol><li> S.を作成するにはフレクスナーミニ細胞は、構成的にスペクチノマイシン耐性プラスミド5μlのエレクトロストレプトマイシン耐性血清型5aの（M90T-SM）、エレクトロポレーションによって細胞に低コピーから大腸菌細胞分裂遺伝子ftsQ、ftsA、とのFtsZを発現するプラスミドpBS58、1μlのを変換します1ミリメートルのキュベット中で5ミリ秒のために2.5 kVの時。 </li><li> 1.5ミリリットル極低温マイクロチューブ中で15％グリセロール中で-80℃で保存するミニ細胞のサンプル。スペクチノマイシンとするとき使用するための準備ができて、ピペットチップを使用して解凍していないマイクロチューブからの細胞の約5μLをこすりし、4ミリリットル中に細胞を懸濁トリプシン大豆ブロスを、100μg/ mlの濃度に加えました。 37℃でO / Nを成長させます。 </li><li>ピペット再び100μg/ mlの濃度になるように追加されたスペクチノマイシンと1.2 200ミリリットルにトリプシン大豆ブロスからの培養の2ミリリットル。後期対数期に37℃で成長します。 </li><li>ミニセル、遠心分離機を豊かにします5分1,000×gで1.3からの培養の200ミリリットル。慎重に10分間20,000×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に上清画分を注ぎます。慎重にオフ注ぎ、上清画分を廃棄し、静かにピペットチップを使用して残りの液体とペレットを混合し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにペレット混合物の約100μlのを転送します。 </li></ol> 2. EMグリッドの準備<ol><li>スライドガラス上にR2 / 2穴あきカーボン膜200メッシュ銅グリッドの炭素側を上に置きます。 注：R2 / 2 200メッシュのグリッドは、依然として試料を支持し、カメラの視野内に炭素膜の端部を配置しながら、単一のグリッド正方形で取得するように設定することができ、チルト系列の数を最大化するように選択されます所望の倍率で。細かいグリッドは、メッシュや、R1.2 / 1.3 400メッシュのような小さい穴あきカーボンフィルムは、より高い倍率で撮像されたサンプルのために使用することができます。このようR3.5のような大きな穴あき炭素膜/ 1 200メッシュを使用することができますサンプルについてのdは低倍率で撮像または顕微鏡写真は、R1のようなより大きな間隔を有する炭素エッジとホーリーカーボン膜を含むべきではない場合は、/ 4、200メッシュの関心領域にステージを揃えるから地域を保護を支援するために使用することができます露出オーバーのルーチンをフォーカス及びトラッキングインチ</li><li>グロー放電装置におけるプラットフォーム上でスライドを置きます。 注：私たちは、陽極とプラットフォームは、真空デシケーター内に機械加工されており、高周波発生器によって供給されている社内のデバイスを使用しています。真空を作成した後、グリッドをグロー放電する1分間のプローブのアノードと電源に高周波発生器のプローブを接続します。グリッドをグロー放電に必要な時間は数秒から分の範囲とすることができます。グロー放電時間を変化させることのないガラス質氷で乾燥現れる検体濃度およびグリッドの問題を診断するために使用することができます。 </li><li>ピンセットのセットでグリッドを削除し、鉗子が弾性Bで閉鎖ロックそして。 </li><li> 1.4で製造したミニ細胞をマイクロ遠心チューブに10nmの金コロイド溶液100μlを加え、穏やかに指でチューブをフリックすることによって混合します。 2.2で製造したグリッド上の混合物の新しいピペット場所4μlの。 注：金コロイドは、サイズやケアの様々な利用可能ですが不明瞭な機能には大きすぎるものではないが、金の大きさは、取得した倍率で処理される顕微鏡写真のピクセルサイズ与えられた5ピクセル以上であることに注意しなければなりません興味を持っている。 </li><li>プランジ​​凍結装置を準備します。液体窒素で凍結外側の容器を満たす、次に液体エタンと内側室を埋めます。プランジ​​ャロッドにグリッドに鉗子を接続し、上昇位置にプランジャロッドをロックします。 注：商業プランジ凍結装置の使用を記載するプロトコルにイアンクら 20を参照してください。 </li><li>注意深くtに濾紙片に触れることによって、グリッドをブロット彼はその後すぐにグリッドを凍結、プランジャロッドを解放し、グリッドとろ紙分離して停止したろ紙上に吸い上げ間のメニスカスまでサンプルのドロップします。慎重にプランジャロッドから鉗子を除去し、グリッドホルダーにグリッドを配置します。 </li><li>液体窒素でローディングエリアと吸収ポンプ容器に充填することによりクライオEM転送ステーションを準備します。ローディングエリア一旦液体窒素温度の場所でグリッドホルダとローディングエリアにおける顕微鏡標本カートリッジです。 </li><li>慎重以前Polara顕微鏡以降のモデルでは、Cスタイルのクリップリング上の小さなネジ付きロックリングのいずれかであるロックリングを取り外します。鉗子を使用してカートリッジへのEMグリッドを配置し、静かにグリッドを確保カートリッジに戻ってロックリングを再接続します。 </li><li>顕微鏡からの複数の試料ホルダーを外し、搬送ステーションに接続します。カートリッジ鉗子使用してホルダーに試料カートリッジを置きますローディングエリアからホルダーを撤回し、顕微鏡に戻って、複数の試料ホルダーを転送dは。 注：Chenら21 2.1から2.9の詳細を視覚的プロトコルを参照してください。 </li></ol> 3.ハイスループット自動チルトシリーズコレクション<ol><li>低倍率マップのコレクション<ol><li> SerialEM 10の「ナビゲータ」メニュー（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM）の「開く」をクリックして、新しいNavigatorウィンドウを開きます。 </li><li>許容可能な撮像条件が含まれているグリッドの正方形を探す（ すなわち、薄い氷、無汚染、関心の対象）は、低倍率で蛍光スクリーンを使用して（〜2,300Xミニ細胞標本用）。 注：[ オプション：このステップは、グリッド全体をモンタージュによってSerialEMで自動化することができます、しかし、それは単に手動でいくつかの領域を選択するために、高速になります。] </li><li>その後、調整し50℃に試料ホルダーを傾けることによってユーセントリックの高さにステージを調整しますステージのxy翻訳までZ高さは、傾斜と非傾斜ビュー間の最小です。 </li><li>グリッドの正方形の中央に移動し、現在のステージ位置を保存するためにナビゲータウィンドウで「追加ステージ順位」ボタンをクリックします。 </li><li>すべての許容可能なグリッドの正方形のステージ位置が保存されるまで、上記の手順3.1.1-4を続行します。 </li><li> 「ファイル」メニューの「新しいモンタージュ」をクリックして、新しいモンタージュMRCファイルを開きます。開くモンタージュ設定ダイアログでは、全グリッドの正方形（標準200メッシュグリッドのための例えば、10×10）を取得しますXとYにおけるピースの数を選択します。このような8の高ビニングを使用し、「画像をシフトさせる代わりにステージを移動して「ラジオボタン」の作品整列させるために使用相関スキップ」を選択します。 </li><li>ナビゲータウィンドウで最初のステージの位置をクリックして、「獲得」のチェックボックスをチェックして取得するように設定します。ナビゲータウィンドウの各ステージ位置のためにこれを繰り返します。 </li><li>ナビゲーターは、「ナビゲータ」メニューの「ポイントで取得」をクリックしてダイアログを取得開きます。 「獲得マップ画像」と「ラフeucentricity」チェックボックスをチェックし、他のすべてのチェックボックスがオフであることを確認してください。各ステージ位置でのモンタージュを収集するために、「進む」をクリックします。 </li></ol></li><li>チルトシリーズの取得<ol><li>ナビゲータウィンドウで獲得したマップのいずれかを選択し、「ロードマップ」ボタンをクリックします。 </li><li>ナビゲータウィンドウでチルトシリーズの取得をする時にマップ内のボタン「ポイントの追加」を選択しポイントをクリックします。その後、ボタン「ポイントの追加の停止」をクリックします。収集された各マップの繰り返し。 </li><li>カメラメニューで「パラメータ」を選択し、フォーカス、裁判、および録音モードのパラメータを定義します。 [ オプション：用量分画したデータは、記録モードのパラメータで指定することができます。] </li><li>ナビゲータウィンドウでポイントを選択し、「チルトシリーズをチェック9;チェックボックスをオンにします。チルトシリーズのコレクションのために必要なパラメータを選択し開きチルトシリーズの設定]ダイアログウィンドウで。 Navigatorウィンドウで選択されたポイントの残りのために繰り返しますが、マップを選択しないでください。 </li><li>ナビゲーターメニューで再び「ポイントで取得」を選択します。ナビゲータでダイアログを取得選択し、オートフォーカス」を項目に再調整 &#39;&#39;と &#39;ラフeucentricityの予備的作業として、選択し「ときにすべての列を閉じるには「チルトシリーズの取得」プライマリタスクとして、および選択&#39;末端に閉じる列バルブを点の収集されました。チルトシリーズを進むと、各マップの各ポイントで収集されます。 </li></ol></li></ol> Tomoautoを使用4.ハイスループット自動チルトシリーズの処理と復興<ol><li>線量分画データでビーム誘起運動の補正[オプション] 注：TomoautoがMOTIONCORR 22を使用しています （http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htミリリットル）、用量分画し顕微鏡写真からビーム誘起運動を削除します。 NOTIONCORR 16は、システムにインストールする必要があります。 <ol><li>オリジナルのチルトシリーズとSerialEM 10およびすべての現在の作業ディレクトリ内の個々の用量分画した画像から、出力ログ、端末内のコマンドを実行します。 &lt;filename.st&gt; dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt;プロセスにチルト系列の名前です。 </li></ol></li><li>チルトシリーズのアライメント・復興 注：デフォルトでTomoautoチルトシリーズの自動化基準モデル生成、配置、コントラスト伝達関数（CTF）、CTF補正23、の決意を処理するために（http://bio3d.colorado.edu/imod/）IMOD 13を使用し、再建。あるいは、ユーザーは、自動化された基準モデル生成、CTFのために（IMODに含まれる）RAPTOR 24を使用するには tomoautoでオプションを持っていますCTFを決定するFIND4 25（http://grigoriefflab.janelia.org/ctf）、および再構成のためかによるソフトウェアパッケージの任意の組み合わせで（https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d）26 tomo3d設定。各パッケージで利用可能なこの構成だけでなく、パラメータは、ローカル設定ファイルは、特定の検体に使用する詳細パラメータ、コレクションに作成することができる一方で、最も一般的に研究室で使用される値に合わせて編集することができ、グローバルコンフィギュレーション・ファイルによって処理されますセットまたは個々のチルトシリーズ。使用することを希望するすべてのパッケージがシステムにインストールする必要があります。 <ol><li>現在の作業ディレクトリにチルトシリーズでは、ターミナルでコマンドを実行 tomoauto --CTF --mode =揃える&lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;filename.st&gt;チルトシリーズが処理されると&lt;fid_diam&gt;はディアメですナノメートル単位の基準マーカーのター。このコマンドは、自動的にチルトシリーズのCTFを揃えると推定されます。これは、コマンドからの--CTFオプションを除去することによって、CTF処理をスキップすることが可能です。 </li><li>アライメント処理の任意の明白なエラーを視覚的に整列チルトシリーズを検査し、コマンドを実行することにより、推定CTFを調べます： 3dmod &lt;ファイル名&gt; .ali submfg &lt;ファイル名&gt; _ctfplotter.com それぞれ、 ここで、&lt; ファイル名&gt;は接尾辞なしチルトシリーズの名前です。また、アライメント品質の定量的統計で整列によって生成された平均残留誤差を、見るためにtomoautoコマンドの出力を確認してください。 </li><li>許容可能なアライメント与えられたコマンドを実行して処理を続行します： tomoau--CTF --mode =に&lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt;再構築 4.2.1と同様に、ユーザ置換を伴います。このコマンドは、CTFを修正チルトシリーズの基準マーカーが消去され、再構築を計算します。ここでもCTF処理は4.2.1のように省略することができます。 </li><li>目視検査手順をスキップし、完全にコマンドを実行し、処理し、再構築を自動化するには、[オプション] tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [オプション]ローカル設定ファイルを生成する方法についてtomoautoのドキュメントを参照して、特定のローカル構成を使用して、コマンドを実行するには tomoauto [オプション] -L &lt;LOCAL_CONFIG&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; ここで、&lt;LOCAL_CONFIG&gt;は、ローカルのconfの名前です。igurationファイル。 </li></ol></li></ol> 5.サブ断層アベレージ注：我々は、サブ断層像の平均化実験を処理するために（http://www.electrontomography.org/）i3のパッケージ 15 を使用し 、しかし、プロトコルは説明最も利用可能なサブ断層平均ソフトウェアpackages16toプロセスサブ断層像の平均化実験、一般的に適用され、しかし、このプロトコルは、ほとんどの利用可能なサブ断層の平均化ソフトウェアパッケージ16-18に、一般的に適用される説明しました。 <ol><li>現在の作業ディレクトリに復元された断層像でコマンドを実行することによって粒子ピッキングのための断層像を開きます： tomopick &lt;ファイル名&gt; .rec ここで、&lt;ファイル名&gt;は4.2.2のようになります。 injectisomeを選択し、tomograのスライスを通してリフには、上下矢印キーを使用して最初の基礎体温、その後、針の先端を上にクリックし、マウスの左ボタンを使用して表示されるウィンドウでメートル。このようにすべての可視injectisomesを選択します。これは、テキストフ​​ァイル内の座標は構造物の長軸を定義するだけでなく、構造体の向きを記述3オイラー角の2を推定格納します。 </li><li>計算上のコマンドを実行して定義された長軸の中点を中心とする断層像から400 3ボクセルの立方体を抽出します。 クリップサイズ変更-CX &lt;X&gt; -cy &lt;Y&gt; -cz &lt;Z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;ファイル名&gt; .rec &lt;ファイル名&gt; _001.mrc ここで、&lt;x&gt;は、&lt;y&gt;を、&lt;Z&gt;構造の中点座標があり、&lt;ファイル名&gt;は4.2.2のようになります。抽出された立方体の大きさは、構造によって変化すべきであると倍率が使用され、適切にこのサンプルの400 3ボクセルで関心のある構造を、同封するのに十分な大きさでなければなりません。 </li><li>ダウンサンプル（ビン）コマンドを実行することにより、初期位置合わせのための計算時間を削減する4倍サブ断層。 binvol -b 4 &lt;ファイル名&gt; _001.mrc &lt;ファイル名&gt; _001.bin4.mrc ここで、&lt;ファイル名&gt;は5.2のようになります。 </li><li>決定オイラーサブ断層像に角度適用し、コマンドを実行することにより、初期テンプレートを生成するために世界の平均を計算します。 I3totsum.sh </li><li>合わせて、細胞質領域のバイナリ分類マスクを使用して、ダウンサンプリングされたサブ断層像を分類します。断層の特徴欠落しているウェッジアーティファクトを最小限にするために、フーリエ空間でサブ断層像の平均化を実行します。 4データをビニングするために、SAMPFACT = &quot;4 4 4」を使用してください。 i3mramsacls.sh </li><li>ダウンサンプリング係数2でサブ断層像を使って手順を繰り返し5.5（= SAMPFACT＆＃34; 2 2 2」）ともう一度、元のデータと（SAMPFACT = &quot;1 1 1」）。 i3mramsacls.sh </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomo3D+2.0+&#8211;+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+(AVX)+for+3D+reconstruction.">Tomo3D 2.0 &#8211; Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li><li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi.">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li><li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection.">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li><li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W:+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells.">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome 19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明す?...

III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な3など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ6によって明らかにされました7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。 クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性赤痢菌株でそのままinjectisomesを画像化しました。クライオETの他の制限は、非常に迅速に、サンプル中の高解像度の情報を破棄し、電子ビームによって誘起される放射線に対する試料の感受性です。適切な用量は、完全傾斜シリーズ間で分散することができるように、その結​​果、非常に低い用量は、個々の傾斜画像に使用されます。これは、非常に困難なことは断層像のノイズの大量から被写体の構造的特徴を区別することを可能にすると冷凍のことで達成できる解像度を制限し、最終的な再構成における信号対雑音比（SNR）を低下させますET。 Conventiこのようなフーリエ変換し、実空間フィルタなど、ならびにダウンサンプリングonal画像処理、コントラストを高めるために使用されるが、高解像度の情報の多くをフィルタリングを犠牲にすることができます。最近、副断層像の平均を大幅にサブナノメートルレベル8,9にSNR、その後いくつかのケースでは、最終的な解像度を増加させることが可能となった。複合体のより詳細な分析は、計算含むサブ断層像の数千を抽出することによって可能となりますより高いSNRと高分解能でその場複雑な構造で決定するために、サブ断層像を位置合わせし、平均化し、元の断層像からの関心のある分野。これらの方法は、高分子集合体とネイティブ細胞環境での動的なコンフォメーションにさらに大きな洞察を提供するために、遺伝的アプローチと統合することができます。 一般的には、数十または数千のサブ断層像の何百もの高い決定するために平均化される必要がありますその場での -resolution構造。サブ断層像のこの大量生産するために必要なチルト系列の十分な数の取得が迅速にボトルネックとなります。その結果、チルトシリーズは、多くの場合、再構成の前に整列するようにチルトシリーズをもたらすために解決しなければならないビーム誘起シフト、ステージバックラッシュだけでなく、拡大、回転、スキュー欠陥の影響を受けています。チルトシリーズは、一般的に、伝統的にまだ別のボトルネックを引き起こし、チルトシリーズの検査によって手動で選択されている金基準マーカを、追跡することによって整列されます。多くのソフトウェアパッケージは、コンピュータ制御の電子顕微鏡10を介して自動化された傾斜シリーズ取得のために開発された11,12、傾斜シリーズのアライメントおよび再建13、14及びサブ断層像は、15-18を平均化されています。これらのパッケージは、クライオETのワークフローの個別の操作を処理するように、システムAのプロセスに抽象度の高いを構築することが望ましくなりますtically単一のパイプラインに全体のスキームを効率化します。したがって、我々は集中的に各コンポーネントの完全な設定を維持しながら、簡単なユーザ操作を可能にする、単一の半自動化されたユニットにこれらのパッケージの数を整理するために設計されたソフトウェアのラッパー・ライブラリー」tomoauto」を開発しました。ライブラリは、オープンソースは、よくオンラインリモートソースコードリポジトリ（http://github.com/DustinMorado/tomoauto）によって開発やさらなる統合を合わせて、継続的に開発され、使用のために自由に利用できる、文書化されています。 この高スループットクライオETパイプラインは 、Sにおける無傷injectisomesを可視化するために利用されていますフレクスナーミニセル。 1917断層像の合計は、サブ断層像19を平均することによって決定した細胞質ソーティングプラットフォームを含むインタクト機の現場構造における高分解能を明らかに、この方法を使用して生成されました。一緒に野生型およびMの分子モデリングとutantマシンは、当社の高スループットパイプラインは、ネイティブの細胞状況にそのままinjectisomeの構造と機能を理解するための新しい道を提供します。

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Tyrptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Apparatus</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Cuvette</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Cryogenic Tube</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>Glow Discharge Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&amp;nbsp;</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device</td></tr><tr><td>High-Frequency Generator</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-10A</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device.&amp;nbsp; CAUTION: This device generates high voltages.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>72705-D</td><td>Style 5 Anti-magnetic</td></tr><tr><td>Colliodal Gold</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Ethane&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>Plunger Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Cryogenic Grid Storage Box</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30&lt;br/&gt; (300 KeV)</td></tr><tr><td>Direct Detection Device Camera</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram Acquisiton Software</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td></tr><tr><td>Beam-induced Motion Correction Software</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires &gt;2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>Tilt-Series Alignment Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>Automatic Fiducial Marker Modelling Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>CTF Determination Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>Tilt-Series Reconstruction Software</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo</td></tr><tr><td>Tilt-Series Automated Processing Software</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>Particle Picking Software</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD</td></tr><tr><td>Subvolume Averaging Software</td><td>i3</td><td></td><td>Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

ミニ細胞Sのサンプルフレクスナーを回収し、 図2に詳述され、パイプラインを使用して、次のtomoauto概略図を図1に示したように処理しました。 傾斜シリーズは、低倍率のモンタージュマップ上でユーザにより指定されたポイントでの高スループット傾斜シリーズ取得を可能SerialEM 10（ 図3）を用...

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Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K ビュー.  University of Texas Health Science Center at Houston. 我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。 

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Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

免疫・感染学

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

生物工学

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

細菌細胞の電子Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

生物学

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

生化学

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for the high-resolution structure determination of biological macromolecules. Despite the remarkable advances in cryo-EM, there is still scope for improvement in various aspects of the single-particle analysis workflow. Single-particle analysis demands a suitable software package for high-throughput automatic data acquisition. Several automatic data acquisition software packages were developed for automatic imaging for single-particle cryo-EM in the last eight years. This paper presents an application of a fully automated image acquisition pipeline for vitrified biomolecules under low-dose conditions. 
It demonstrates a software package, which can collect cryo-EM data fully, automatically, and precisely. Additionally, various microscopic parameters are easily controlled by this software package. This protocol demonstrates the potential of this software package in automated imaging of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein with a 200 keV cryo-electron microscope equipped with a direct electron detector (DED). Around 3,000 cryo-EM movie images were acquired in a single session (48 h) of data collection, yielding an atomic-resolution structure of the spike protein of SARS-CoV-2. Furthermore, this structural study indicates that the spike protein adopts two major conformations, 1-RBD (receptor-binding domain) up open and all RBD down closed conformations.

Single-particle cryo-electron microscopy demands a suitable software package and user-friendly pipeline for high-throughput automatic data acquisition. Here, we present the application of a fully automated image acquisition software package, Latitude-S, and a practical pipeline for data collection of vitrified biomolecules under low-dose conditions.

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

極低温電子断層撮影の最適化戦略

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

要約

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低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

細菌細胞の電子Cryotomography

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノバクテリアの DNA 締固めの可視化

極低温電子断層撮影の最適化戦略

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

要約

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低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

細菌細胞の電子Cryotomography

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

極低温電子断層撮影の最適化戦略

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノバクテリアの DNA 締固めの可視化