Ringraziamo il Dr. William Margolin per i commenti. Siamo grati per il sostegno su SerialEM da Drs. David Mastronarde e Chen Xu. DM, BH e JL sono stati sostenuti da Grant R01AI087946 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive, Grants R01GM110243 e R01GM107629 presso l&#39;Istituto Nazionale di scienze mediche generali (NIGMS), e Grant AU-1714 dalla Fondazione Welch. Il rivelatore di elettroni diretto è stato finanziato dal National Institutes of Health Award S10OD016279.

1. Minicell Preparazione <ol><li> Per rendere S. minicells flexneri, trasformano 1 ml di plasmide pBS58, che esprime costitutivamente geni divisione cellulare Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ da un basso copy spectinomicina resistente plasmide in 5 microlitri electrocompetent streptomicina resistente sierotipo 5a (M90T-Sm), le cellule di elettroporazione a 2,5 kV per 5 msec a 1 mm cuvette. </li><li> Conservare i campioni minicell a -80 ° C in 15% glicerolo in una provetta da 1,5 ml criogenico. Quando si è pronti per l&#39;uso, raschiare circa 5 ml di cellule dalla provetta unthawed con un puntale e sospendere le cellule in 4 ml di brodo di soia trittico con spectinomicina aggiunto a 100 mg / ml di concentrazione. Crescere O / N a 37 ° C. </li><li> Pipettare 2 ml di cultura da 1,2 in 200 ml di brodo di soia trittico con spectinomicina ancora aggiunti a 100 mcg / ml concentrazioni. Crescere a 37 ° C per fase di log in ritardo. </li><li> Per arricchire minicells, centrifuga200 ml di coltura da 1,3 a 1000 xg per 5 min. Versare con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e centrifugare a 20.000 g per 10 min. Versare con cautela e scartare il surnatante, e mescolare delicatamente il pellet con il liquido restante con un puntale e trasferire circa 100 ml di miscela di pellet in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li></ol> 2. EM griglia Preparazione <ol><li> Posizionare un lato pellicola di carbonio da 200 maglie carbonio griglia di rame R2 / 2 bucata su un vetrino. NOTA: A / 2 griglia 200 mesh R2 è scelto per massimizzare il numero di tilt-serie che può essere impostato per acquisire in un unico quadrato della griglia supportando allo stesso tempo il campione e posizionando il bordo della pellicola di carbonio nel campo della telecamera Allo ingrandimento desiderato. Griglie maglie più fini e film di carbonio bucata più piccoli come R1.2 / 1.3 400-rete può essere utilizzato per i campioni imaged a maggiore ingrandimento; più grandi film di carbonio bucata quali R3.5 / 1 200-maglia può essere usod per campioni ripreso a ingrandimento minore o se la micrografia non deve contenere il bordo carbonio e carbonio film bucata con spaziatura più grande come R1 / 4 200 mesh può essere usato per aiutare con l&#39;allineamento della fase alla zona di interesse e proteggere aree da sovraesposizione nella messa a fuoco e il monitoraggio di routine. </li><li> Posizionare il vetrino sulla piattaforma in un dispositivo di scarica a bagliore. NOTA: Usiamo un dispositivo in-casa in cui un anodo e la piattaforma è stato lavorato in un essiccatore a vuoto ed è alimentato da un generatore ad alta frequenza. Dopo aver creato il vuoto, collegare la sonda generatore ad alta frequenza per l&#39;anodo e accendere la sonda per 1 min per Glow Discharge griglia. Il tempo necessario per Glow Discharge rete può variare da pochi secondi a un minuto. Variando il tempo di scarica luminescente può essere utilizzato per diagnosticare problemi di concentrazione del campione e le griglie che appaiono a secco senza ghiaccio vitreo. </li><li> Rimuovere la griglia con un set di pinze, e bloccare le pinze chiuse con un b elasticoe. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di 10 nm oro colloidale per la provetta con le minicells preparati in 1.4 e mescolare muovendo delicatamente il tubo con un dito. Con un nuovo posto pipetta 4 microlitri della miscela sulla griglia preparata in 2.2. NOTA: oro colloidale è disponibile in una varietà di formati e si deve prestare attenzione che la dimensione del oro è maggiore di 5 pixel date le dimensioni dei pixel delle micrografie da trattare con l&#39;ingrandimento acquisito, pur non essendo troppo grande per caratteristiche oscure di interesse. </li><li> Preparare l&#39;apparato tuffo antigelo; riempire il contenitore esterno di congelamento con azoto liquido e poi riempire la camera interna con etano liquido. Fissare la pinza con griglia per lo stantuffo e bloccare lo stantuffo nella posizione sollevata. NOTA: Vedere Iancu et al 20 per un protocollo che descrive l&#39;uso di un apparato affondamento freeze commerciale.. </li><li> Tamponare la griglia toccando attenzione un pezzo di carta da filtro a tegli goccia del campione fino menisco tra le separa griglia e carta da filtro e la traspirazione sulla carta da filtro ferma, quindi rilasciare immediatamente lo stantuffo, il congelamento della griglia. Rimuovere con cautela la pinza dal stantuffo e posizionare la griglia in un supporto griglia. </li><li> Preparare la stazione di trasferimento Cryo-EM riempiendo il contenitore pompa zona di carico e l&#39;assorbimento di azoto liquido. Una volta che la zona di carico è al liquido posto temperatura dell&#39;azoto titolare griglia e una cartuccia esemplare microscopio nella zona di carico. </li><li> Rimuovere con attenzione l&#39;anello di bloccaggio, che può essere un piccolo anello di bloccaggio a vite sui microscopi Polara precedenti o una clip anello C-stile sui modelli successivi; posizionare la griglia EM nella cartuccia con pinze e quindi ricollegare delicatamente la ghiera indietro sulla cartuccia di fissaggio della griglia. </li><li> Rimuovere il supporto del campione multiplo dal microscopio e fissarlo alla stazione di trasferimento. Posizionare la cartuccia del campione nel supporto con pinze Cartuccia Unad retrarre il supporto dalla zona di carico e trasferire il portacampioni multipli al microscopio. NOTA: Vedere Chen ed altri 21 per un protocollo visivo dettagli 2,1-2,9.. </li></ol> 3. Alta produttività automatizzata Tilt-Series Collection <ol><li> Raccolta di basso ingrandimento Maps <ol><li> Aprire una nuova finestra di navigazione cliccando su &#39;Open&#39; nel menu &#39;Navigator&#39; di SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM) </li><li> Trova quadrati della griglia che contengono condizioni di imaging accettabili (cioè, ghiaccio sottile, nessuna contaminazione, oggetto di interesse) utilizzando lo schermo fluorescente a basso ingrandimento (~ 2,300X per il campione Minicell). NOTA: [Facoltativo:. Questa fase può essere automatizzato con SerialEM dal montaging l&#39;intera griglia, ma può essere più veloce per selezionare semplicemente alcune aree manualmente] </li><li> Regolare la fase di altezza eucentrico inclinando il titolare del campione a 50 ° quindi regolarelo z-altezza fino a quando la traduzione xy del palco è minima tra i punti di vista inclinato e ruotato. </li><li> Spostare al centro della piazza della griglia e fare clic sul pulsante &#39;Aggiungi tappa Pos&#39; nella finestra Navigator per memorizzare la posizione attuale fase. </li><li> Continuare passi 3.1.1-4 sopra fino a quando sono stati salvati tutti i posti quadrati della griglia palco accettabili. </li><li> Aprire un nuovo file di montaggio MRC cliccando su &#39;Nuovo montage&#39; nel menu &#39;File&#39;. Nella finestra di dialogo di installazione in sequenza che si apre, selezionare un numero di pezzi in X e Y che acquisirà tutta la piazza della griglia (ad esempio, 10 x 10 per una griglia di 200 rete standard). Utilizzare un alto binning come 8 e selezionare il &#39;Sposta fase Invece di spostamento dell&#39;immagine&#39; e &#39;Vai correlazioni usate per allineare pezzi&#39; pulsanti di opzione. </li><li> Nella finestra di Navigator fare clic sulla prima posizione di fase e impostare da acquisire selezionando la casella &#39;Acquire&#39;. Ripetere questa operazione per ciascuna posizione fase della finestra del navigatore. </li><li> Aprire il Navigatore Acquire dialogo facendo clic su &#39;Acquire a Punti&#39; nel menu &#39;Navigator&#39;. Controllare l&#39;&#39;immagine della mappa Acquire&#39; e casella &#39;eucentricity ruvida&#39; e fare in modo che tutte le altre caselle di controllo siano deselezionate. Fare clic su &#39;Procedi&#39; per raccogliere un montaggio in ogni posizione fase. </li></ol></li><li> Tilt-series Acquisizione <ol><li> Nella finestra del Navigatore selezionare una delle carte acquisite e fare clic sul pulsante &#39;Carica mappa&#39;. </li><li> Nella finestra del navigatore cliccare su &#39;Aggiungi punti &quot;pulsante e selezionare i punti nella mappa in cui acquisire un tilt-series. Quindi fare clic sul &#39;smettere di aggiungere punti &quot;pulsante. Ripetere per ogni mappa raccolti. </li><li> Nel menu Fotocamera selezionare &quot;Parametri&quot; e definire i parametri per le modalità di messa a fuoco, di sperimentazione, e Record. [Opzionale:. Dose-frazionata i dati possono essere specificati nei parametri per la modalità Record] </li><li> Selezionare un punto nella finestra Navigatore e controllare il &#39;Tilt-Series9; casella di controllo. Nella finestra di dialogo Imposta Tilt-Series che si apre selezionare i parametri desiderati per la raccolta di inclinazione della serie. Ripetere l&#39;operazione per il resto dei punti selezionati nella finestra del Navigatore, ma non selezionare le mappe. </li><li> Nel menu Navigator di nuovo selezionare il &#39;Acquire a punti&#39;. Nella Navigator Acquisisci finestra scegliere &#39;Riallineare alla voce&#39;, messa a fuoco automatica &#39;e&#39; eucentricity Ruvido &#39;come operazioni preliminari, e selezionare&#39; Acquire serie tilt &#39;come il compito primario, e selezionare&#39; Chiudere le valvole delle colonne di fine &#39;per chiudere la colonna quando tutto dei punti sono stati raccolti. Al momento di procedere un&#39;inclinazione serie saranno raccolti in ogni punto in ogni mappa. </li></ol></li></ol> 4. Alto-throughput automatizzata Tilt-series di elaborazione e ricostruzione Utilizzando Tomoauto <ol><li> Correzione di movimento del fascio-indotta nei dati dose-frazionati [opzionale] NOTA: Tomoauto utilizza MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) per rimuovere il movimento fascio indotta da micrografie di dose frazionata. NOTIONCORR 16 deve essere installato sul sistema. <ol><li> Con l&#39;inclinazione della serie originale, il registro di output da SerialEM 10 e le singole immagini di dose-frazionata tutto nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando: dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt; &lt;Filename.st&gt; è il nome del tilt-serie da elaborare. </li></ol></li><li> Allineamento e Ricostruzione di Tilt-series NOTA: Tomoauto di default usa IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) per gestire tilt-serie generazione del modello fiduciale automatizzato, l&#39;allineamento, la determinazione della funzione di trasferimento di contrasto (CTF), CTF-23 la correzione, e ricostruzione. In alternativa, gli utenti hanno la possibilità di tomoauto per usare RAPTOR 24 (incluso nel IMOD) per automatizzata generazione del modello fiduciale, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) per determinare la CTF, e tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) per la ricostruzione o in qualsiasi combinazione di pacchetti software per configurazione. Questa configurazione, così come i parametri disponibili in ogni pacchetto è gestito da un file di configurazione globale che può essere modificato per soddisfare i valori più comunemente utilizzati in un laboratorio mentre i file di configurazione locali possono anche essere creati per i parametri di dettaglio utilizzati per uno specifico esemplare, di raccolta impostare o individuale di inclinazione della serie. Tutti i pacchetti che desiderano essere utilizzati devono essere installati sul sistema. <ol><li> Con l&#39;inclinazione della serie nella directory di lavoro corrente, in un terminale eseguire il comando tomoauto --CTF --mode = align &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;Filename.st&gt; è l&#39;inclinazione della serie per essere elaborati e &lt;fid_diam&gt; è il Diameter dei marcatori di riferimento nel nanometri. Questo comando allineerà e stimare la CTF dell&#39;inclinazione serie automaticamente. È possibile saltare elaborazione CTF rimuovendo l&#39;opzione --CTF dal comando. </li><li> Controllare l&#39;inclinazione-serie allineata visivamente per eventuali errori evidenti nella lavorazione di allineamento e ispezionare la CTF stimato eseguendo i comandi: 3dmod &lt;filename&gt; .ali submfg &lt;filename&gt; _ctfplotter.com rispettivamente, dove &lt;nomefile&gt; è il nome del tilt-serie senza suffisso. Controllare anche l&#39;uscita del comando tomoauto vedere l&#39;errore medio residuo generato dalla allineamento, che è una statistica quantitativa della qualità dell&#39;allineamento. </li><li> Dato un allineamento accettabile procedere lavorazione eseguendo il comando: tomoaua --CTF --mode = ricostruire &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; con le stesse sostituzioni utente come in 4.2.1. Questo comando correggerà la CTF, cancellare i marker fiduciali dalla inclinazione della serie e calcolare la ricostruzione. Anche in questo caso l&#39;elaborazione CTF può essere saltata come al punto 4.2.1. </li><li> [opzionale] Per saltare la fase di ispezione visiva e automatizzare completamente l&#39;elaborazione e la ricostruzione eseguire il comando tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [opzionale] Per utilizzare una configurazione locale specifica, consultare la documentazione tomoauto su come generare un file di configurazione locale, e poi eseguire il comando tomoauto [opzioni] -L &lt;local_config&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; dove &lt;local_config&gt; è il nome del locale confil file della configurazione della. </li></ol></li></ol> 5. Sub-tomogramma Averaging NOTA: Usiamo il pacchetto i3 15 (http://www.electrontomography.org/) per elaborare esperimenti di calcolo della media sub-tomogramma, ma il protocollo descritto si applica generalmente alla maggior parte disponibili sub-tomogramma esperimenti processo software media packages16to sub-tomogram delle medie, tuttavia il protocollo descritto si applica generalmente alla maggior parte dei pacchetti software media disponibili sub-tomogramma 16-18. <ol><li> Con il tomogramma ricostruito nella directory di lavoro corrente aprire il tomogramma per il prelievo delle particelle eseguendo il comando: tomopick &lt;filename&gt; .rec dove &lt;nome file&gt; è come in 4.2.2. Nella finestra che si apre con il tasto sinistro del mouse per fare clic sul primo corpo basale e poi la punta dell&#39;ago per selezionare un injectisome e utilizzare i tasti freccia su e giù per riff attraverso le fette della tomografiam. Seleziona tutti injectisomes visibili in questo modo. Ciò memorizza le coordinate in un file di testo che definiscono l&#39;asse longitudinale della struttura così come stima due dei tre angoli di Eulero che descrive l&#39;orientamento della struttura. </li><li> Estratto computazionalmente 400 3 cubetti di voxel del tomogramma centrato nel punto centrale dell&#39;asse lungo definito eseguendo il comando: clip di ridimensionamento -cx &lt;x&gt; -cy &lt;y&gt; -cz &lt;z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;filename&gt; .rec &lt;filename&gt; _001.mrc dove &lt;x&gt;, &lt;y&gt;, &lt;z&gt; sono le coordinate del punto medio della struttura e &lt;filename&gt; è come in 4.2.2. La dimensione del cubo estratto dovrebbe variare la struttura e l&#39;ingrandimento utilizzato, e dovrebbe essere sufficientemente grande da includere adeguatamente la struttura di interesse, che per questo esempio è di 400 3 voxel. </li><li> Down-campione (bin) il sub-tomogramma di un fattore di quattro per ridurre il tempo di calcolo per allineamento iniziale eseguendo il comando: binvol -b 4 &lt;filename&gt; _001.mrc &lt;filename&gt; _001.bin4.mrc dove &lt;nome file&gt; è come in 5.2. </li><li> Applicare la determinata angoli di Eulero a sub-tomogrammi e calcolare la media globale per produrre il modello iniziale per eseguire il comando. I3totsum.sh </li><li> Allineare e classificare down-campione sotto-tomogrammi utilizzando una maschera classificazione binaria dell&#39;area citoplasmatica. Eseguire sub-tomogramma media nello spazio di Fourier per ridurre al minimo i mancanti manufatti cuneo caratteristici della tomografia. Per binning 4 dati, si prega di utilizzare SAMPFACT = &quot;4 4 4&quot;. i3mramsacls.sh </li><li> Ripetere il punto 5.5 con sub-tomogrammi down-campionati di un fattore di due (SAMPFACT = &amp;# 34; 2 2 2 &quot;) e ancora una volta con i dati originali (SAMPFACT =&quot; 1 1 1 &quot;). i3mramsacls.sh </li></ol>

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<li>Rouhou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomo3D+2.0+%E2%80%93+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+%28AVX%29+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li>
<li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li>
<li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li>
<li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W%3A+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il metodo di alto-rendimento descritto qui ci ha permesso di elaborare 1.917 crio tilt-serie e produrre oltre 4.500 sub-tomogrammi del intatto S. flexneri injectisome 19. I dati raccolti hanno portato alla caratterizzazione dettagliata di in situ injectisome, tra cui il citoplasmatica di ordinamento complesso. Il metodo è stato utilizzato anche per visualizzare varie cellule mutanti con specifico delezione di componenti proteiche putativi, che ha contribuito a chiarire la composizi...

III sistemi di secrezione di tipo (T3SS) sono fattori di virulenza essenziali per molti patogeni Gram-negativi. Il injectisome, noto anche come il complesso dell&#39;ago, è la macchina centrale T3SS richiesto per traslocazione diretta di proteine ​​effettrici del batterio in cellule ospiti eucariotiche 1, 2. Il injectisome comprende un ago extracellulare, un corpo basale, e un complesso citoplasmatico anche noto come il complesso di smistamento 3. Precedenti studi hanno chiarito le strutture 3-D di injectisomes purificati da Salmonella e Shigella, insieme con le strutture atomiche delle principali proteine ​​del corpo basale 4, 5. Recente in strutture in situ di injectisomes da Salmonella, Shigella, e Yersinia sono stati rivelati da crio-ET 6 , 7. Tuttavia, il complesso citoplasmatico, essenziale per la selezione effettrici e gruppo aghi, non è stata visualizzata in quelle strutture. Cryo-ET è il MOSt tecnica adatta per l&#39;imaging macchinario molecolare presso risoluzione nanometrica all&#39;interno del suo contesto cellulare nativo (in situ). Tuttavia, la risoluzione ottenibile da crio-ET è limitata dalla spessore del provino. Per superare l&#39;inconveniente, abbiamo ripreso injectisomes intatti in una virulenta Shigella flexneri ceppo che è stato geneticamente modificato per produrre minicells abbastanza sottili per crio-ET. Un altro limite di crio-ET è la sensibilità del campione alla radiazione indotta dal fascio di elettroni, che distrugge rapidamente le informazioni ad alta risoluzione nel campione. Come risultato, estremamente basse dosi sono utilizzati per le singole tilt-immagini in modo che una dose adatta può essere distribuito tra l&#39;inclinazione completa serie. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore (SNR) nella ricostruzione finale, il che rende difficile distinguere le caratteristiche strutturali del soggetto dalla grande quantità di rumore nel tomogramma e limita la risoluzione che può essere ottenuta da cryo- ET. Conventielaborazione delle immagini onal quali Fourier e filtri dello spazio reale e giù campionamento può essere utilizzato per aumentare il contrasto, ma a scapito di filtrare gran parte delle informazioni ad alta risoluzione. Recentemente, sub-tomogram media ha consentito di aumentare notevolmente il SNR e successivamente la risoluzione finale in alcuni casi a livelli sub-nanometri 8, 9. Un&#39;analisi più dettagliata dei complessi è reso possibile da computazionalmente estraendo migliaia di sub-tomogrammi contenenti le aree di interesse dalle tomografie originale e quindi allineando e media i sub-tomografie per determinare in strutture complesse in situ con maggiore SNR e una risoluzione più alta. Questi metodi possono essere integrati con approcci genetici per fornire ancora maggiori intuizioni in assemblee macromolecolari e le loro conformazioni dinamici nel contesto cellulare nativo. In generale, decine o centinaia di migliaia di sub-tomogrammi devono essere mediati per determinare altostrutture -Risoluzione in situ. L&#39;acquisizione di un numero sufficiente di tilt serie necessaria per produrre questo grande numero di sotto-tomografie diventa rapidamente un collo di bottiglia. Il conseguente inclinazione della serie sono spesso risente spostamento fascio indotta, fase contraccolpo, e ingrandimento, rotazione e inclinazione difetti, che deve essere risolto per portare l&#39;inclinazione serie in allineamento prima ricostruzione. La serie inclinazione è tipicamente allineato tracciando marker fiduciali oro, che sono tradizionalmente selezionabili manualmente attraverso l&#39;ispezione del tilt-serie, causando ancora un altro collo di bottiglia. Molti pacchetti software sono stati sviluppati per automatiche di acquisizione tilt-serie attraverso microscopi elettronici controllati da computer 10, 11, 12, allineamento tilt-serie e la ricostruzione 13, 14 e sub-tomogramma media 15-18. Poiché questi pacchetti gestiscono operazioni discreti nel flusso di crio-ET, diventa desiderabile costruire un livello più elevato di astrazione nel processo per systemacamente snellire l&#39;intero schema in una singola pipeline. Pertanto, abbiamo sviluppato una libreria wrapper software &quot;tomoauto&quot; progettato per organizzare una serie di questi pacchetti in una singola unità semi-automatico, consentendo funzionamento semplice utente, pur mantenendo la configurazione completa di ciascun componente in modo centralizzato. La biblioteca è open-source, ben documentato, continuamente sviluppato e liberamente disponibili per l&#39;uso, lo sviluppo su misura o una maggiore integrazione per mezzo di un codice sorgente remota repository online (http://github.com/DustinMorado/tomoauto). Questo high-throughput crio-ET gasdotto è stato utilizzato per visualizzare injectisomes intatti a S. minicells flexneri. Un totale di 1.917 tomografie sono stati generati utilizzando questo metodo, rivelando una ad alta risoluzione nella struttura situ della macchina intatta tra cui la piattaforma di smistamento citoplasmatica determinato dal sub-tomogramma media 19. Insieme alla modellistica molecolare di wild-type e mmacchine utant, la nostra pipeline high-throughput fornisce una nuova strada per comprendere la struttura e la funzione del injectisome intatto nel contesto cellulare nativo.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Tyrptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Apparatus</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Cuvette</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Cryogenic Tube</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>Glow Discharge Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&amp;nbsp;</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device</td></tr><tr><td>High-Frequency Generator</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-10A</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device.&amp;nbsp; CAUTION: This device generates high voltages.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>72705-D</td><td>Style 5 Anti-magnetic</td></tr><tr><td>Colliodal Gold</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Ethane&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>Plunger Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Cryogenic Grid Storage Box</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30&lt;br/&gt; (300 KeV)</td></tr><tr><td>Direct Detection Device Camera</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram Acquisiton Software</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td></tr><tr><td>Beam-induced Motion Correction Software</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires &gt;2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>Tilt-Series Alignment Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>Automatic Fiducial Marker Modelling Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>CTF Determination Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>Tilt-Series Reconstruction Software</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo</td></tr><tr><td>Tilt-Series Automated Processing Software</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>Particle Picking Software</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD</td></tr><tr><td>Subvolume Averaging Software</td><td>i3</td><td></td><td>Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Campioni di minicells S. flexneri stati raccolti e trattati come indicato in figura 1 utilizzando tomoauto schema seguente pipeline descritto nella figura 2. Tilt-series sono stati raccolti utilizzando SerialEM 10, che permette di high-throughput acquisizione tilt serie nei punti designati da parte dell&#39;utente su mappe montaggio a basso ingrandimento (Figura 3). Micrografie sono...

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Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all&#39;utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K Views.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche. 

Video: Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine ​​dell&#39;HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Bioingegneria

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Biochimica

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologia

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for the high-resolution structure determination of biological macromolecules. Despite the remarkable advances in cryo-EM, there is still scope for improvement in various aspects of the single-particle analysis workflow. Single-particle analysis demands a suitable software package for high-throughput automatic data acquisition. Several automatic data acquisition software packages were developed for automatic imaging for single-particle cryo-EM in the last eight years. This paper presents an application of a fully automated image acquisition pipeline for vitrified biomolecules under low-dose conditions. 
It demonstrates a software package, which can collect cryo-EM data fully, automatically, and precisely. Additionally, various microscopic parameters are easily controlled by this software package. This protocol demonstrates the potential of this software package in automated imaging of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein with a 200 keV cryo-electron microscope equipped with a direct electron detector (DED). Around 3,000 cryo-EM movie images were acquired in a single session (48 h) of data collection, yielding an atomic-resolution structure of the spike protein of SARS-CoV-2. Furthermore, this structural study indicates that the spike protein adopts two major conformations, 1-RBD (receptor-binding domain) up open and all RBD down closed conformations.

Single-particle cryo-electron microscopy demands a suitable software package and user-friendly pipeline for high-throughput automatic data acquisition. Here, we present the application of a fully automated image acquisition software package, Latitude-S, and a practical pipeline for data collection of vitrified biomolecules under low-dose conditions.

Software di acquisizione dati intuitivo, ad alta produttività e completamente automatizzato per microscopia crioelettronica a particella singola

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Tomografia crioelettronica Raccolta dati remota e media dei sottotomogrammi

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Riepilogo

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Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Microscopia correlativa per l'analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

Software di acquisizione dati intuitivo, ad alta produttività e completamente automatizzato per microscopia crioelettronica a particella singola

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

Tomografia crioelettronica Raccolta dati remota e media dei sottotomogrammi

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

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