Agradecemos ao Dr. William Margolin para comentários. Somos gratos pelo apoio em SerialEM dos Drs. David Mastronarde e Chen Xu. DM, BH e JL foram apoiados por Grant R01AI087946 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, concessões R01GM110243 e R01GM107629 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS), e Grant AU-1714 da Fundação Welch. O detector eletrônica direta foi financiado pelo National Institutes of Award Saúde S10OD016279.

1. Preparação Minicell <ol><li> Para fazer com que S. minicï¿½ulas flexneri, transformar 1 ml de plasmídeo pBS58, o que expressa constitutivamente genes divisão celular Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ a partir de um baixo-cópia espectinomicina resistente plasmídeo em 5 jul electrocompetentes Estreptomicina resistente 5a sorotipo (M90T-Sm) células por eletroporação a 2,5 kV para 5 ms em cuvetes de 1 mm. </li><li> Armazenar minicï¿½ula amostras a -80 ° C em glicerol a 15% em 1,5 ml de um microtubo criogénico. Quando pronto para uso, raspar aproximadamente 5 jul de células a partir do microtubo unthawed utilizando uma ponta de pipeta e suspender as células em 4 ml de caldo de soja tríptico com espectinomicina adicionado a 100 ug / ml de concentração. Cresça O / N a 37 ° C. </li><li> Pipetar 2 ml da cultura de caldo de soja 1.2 em 200 ml tríptico com espectinomicina novamente adicionados a concentrações de 100 ug / ml. Crescer a 37 ° C até à fase log tardia. </li><li> Para enriquecer minicï¿½ulas, centrífuga200 ml da cultura a partir de 1,3 a 1000 xg durante 5 min. Verter cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de centrífuga e centrifuga-se a 20.000 xg durante 10 min. Verter cuidadosamente e descartar a fracção de sobrenadante, e agitar suavemente o sedimento com o líquido remanescente utilizando uma ponta de pipeta e transferir cerca de 100 uL da mistura de sedimento para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li></ol> 2. EM grade Preparação <ol><li> Coloque um lado filme de carbono de 200 mesh malha de cobre de carbono R2 / 2 holey-se em uma lâmina de vidro. NOTA: A / 2 grade de malha 200 R2 é seleccionado para maximizar o número de inclinação da série que pode ser configurado para adquirir num quadrado de grade, enquanto ainda apoiar o espécime e colocando o bordo do filme de carbono no campo da câmara com a ampliação desejada. Redes de malha mais fina e mais pequenos filmes de carbono, tais como furados R1.2 / 1.3 400 de malha podem ser usados ​​para amostras fotografado de maior ampliação; maiores filmes de carbono holey como R3.5 / 1 200-mesh podem ser utilizadosd para amostras fotografada com menor ampliação ou se a micrografia não deve conter a borda de carbono e filmes furados de carbono com um espaçamento maior, tal como R 1/4 de malha 200 pode ser utilizada para auxiliar no alinhamento do palco para a área de interesse e proteger as áreas de sobre-exposição em foco e monitoramento rotinas. </li><li> Coloque o slide na plataforma em um dispositivo de descarga luminescente. NOTA: Usamos um dispositivo interno no qual um ânodo e plataforma foi maquinada num exsicador de vácuo e é alimentado por um gerador de alta frequência. Depois de criar um vácuo, anexar a sonda gerador de alta frequência para o ânodo e ligue a sonda de 1 min a brilhar descarregar a grade. O tempo necessário para a descarga luminescente da grelha pode variar de alguns segundos a um minuto. Variando o tempo de descarga luminescente pode ser utilizado para diagnosticar problemas com a concentração de amostra e grades que aparecem com gelo seco vítreo. </li><li> Retire a grelha com um conjunto de pinças, e travar as pinças fechado com um elástico be. </li><li> Adicionar 100 ul de 10 nm solução coloidal de ouro para o tubo de microcentrífuga com as minicï¿½ulas preparadas em 1.4 e misture suavemente flicking o tubo com um dedo. Com um novo lugar pipeta 4 ul da mistura da grelha preparado em 2.2. NOTA: O ouro coloidal está disponível numa variedade de tamanhos e deve ser tomado cuidado de que o tamanho do ouro é maior do que 5 pixels determinado o tamanho do pixel de as micrografias a serem processados ​​com a ampliação adquirida, apesar de não ser demasiado grande para características obscuras de interesse. </li><li> Prepara-se o aparelho de êmbolo mergulhador de congelamento; encher o recipiente de congelamento exterior com nitrogênio líquido e, em seguida, encher a câmara interna com etano líquido. Fixar a pinça com a rede à haste de êmbolo e bloquear a haste do êmbolo para a posição elevada. NOTA: Ver lancu et al 20 para um protocolo descrevendo o uso de um aparelho de imersão por congelação comerciais.. </li><li> Blot a grade cuidadosamente tocando numa peça de papel de filtro para tele gota de amostra até o menisco entre a grade e de papel de filtro se separa e a absorção no papel de filtro pára, em seguida, libertar imediatamente a haste de êmbolo, o congelamento da grade. Cuidadosamente remover a pinça a partir da haste do êmbolo e colocar a grelha para um suporte de grelha. </li><li> Prepare a estação de transferência de crio-EM, enchendo o recipiente bomba área de carga e absorção com nitrogênio líquido. Uma vez que a área de carga é a temperatura do azoto líquido lugar o suporte da grelha e um cartucho de espécime microscópio na zona de carga. </li><li> Retire cuidadosamente o anel de bloqueio, isto é, um pequeno anel de fecho roscado em microscópios Polara anteriores ou um anel de clip-estilo C em modelos posteriores; coloque a grelha EM dentro do cartucho usando uma pinça e volte suavemente o anel de trava de volta para o cartucho de garantir a grade. </li><li> Remova o suporte de amostra múltipla do microscópio e anexá-lo para a estação de transferência. Coloque o cartucho de amostra no suporte usando uma pinça de cartucho de umd retrair o suporte da área de carga e transferir o suporte de amostra múltipla de volta para o microscópio. NOTA: Ver Chen et al 21 para um protocolo visuais detalhando 2,1-2,9.. </li></ol> 3. alta taxa de transferência Collection-série Tilt automatizada <ol><li> Coleção de baixa ampliação Mapas <ol><li> Abra uma nova janela Navigator, clicando em &#39;Abrir&#39; no menu &#39;Navigator&#39; de SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM) </li><li> Encontre quadrículas que contêm as condições de obtenção de imagens aceitáveis ​​(isto é, gelo fino, sem contaminação, assunto de interesse) utilizando a tela fluorescente em baixa ampliação (~ 2,300X para o espécime minicï¿½ula). NOTA: [Opcional:. Este passo pode ser automatizado com SerialEM por montaging toda a grade, no entanto, pode ser mais rápido do que simplesmente selecionar algumas áreas manualmente] </li><li> Ajuste o estágio de altura eucentric inclinando o suporte da amostra a 50 ° e ajustez-altura até que a tradução xy do palco é mínima entre os pontos de vista inclinados e não inclinado. </li><li> Mover-se para o centro da praça grade e clique no botão &quot;Adicionar Stage Pos &#39;na janela Navegador para armazenar a posição atual estágio. </li><li> Continue passos 3.1.1-4 acima até todas as posições de estágio quadrículas aceitáveis ​​foram salvas. </li><li> Abra um novo arquivo de montagem MRC, clicando em &#39;New montage&#39; no menu &#39;File&#39;. No Setup Montagem de diálogo que se abre, selecione um número de peças em X e Y que irá adquirir a totalidade do quadrado da grade (por exemplo, 10 x 10 para uma grade de malha 200 standard). Use uma alta binning como 8 e selecione a opção &#39;Mover Stage Em vez de deslocamento da imagem&#39; e &#39;Ir correlações utilizadas para alinhar peças&#39; botões de rádio. </li><li> Na janela Navegador, clique na primeira posição palco e configurá-lo para ser adquirido por verificando a caixa de seleção &#39;Acquire&#39;. Repita esse procedimento para cada posição estágio na janela Navegador. </li><li> Abra o Navegador Adquirir diálogo clicando em &quot;Adquirir em Pontos&quot; no menu &#39;Navigator&#39;. Verifique a &quot;imagem mapa Acquire &#39;e caixa de seleção&quot; eucentricity áspero&#39; e certifique-se que todas as outras caixas de seleção estão desmarcadas. Clique em &#39;Continuar&#39; para coletar uma montagem em cada posição palco. </li></ol></li><li> Tilt-série Acquisition <ol><li> Na janela Navegador, selecione um dos mapas adquiridos e clique no botão &#39;Load mapa&#39;. </li><li> Na janela Navegador, clique em &quot;Adicionar Points &#39;botão e selecionar pontos no mapa em que adquirir uma série de inclinação. Em seguida, clique no botão &quot;Parar de adicionar Points &#39;botão. Repita o procedimento para cada mapa recolhidos. </li><li> No menu Câmara selecionar &#39;Parâmetros&#39; e definir os parâmetros para os modos de foco, experimentação, e Record. [Opcional:. Dose-fracionada dados podem ser especificados em parâmetros para o modo Record] </li><li> Selecione um ponto na janela Navigator e verifique o &quot;Tilt-Series9; caixa de seleção. Na janela de diálogo Setup Tilt-Series que se abre, selecione os parâmetros desejados para a recolha tilt-série. Repita o procedimento para o resto dos pontos selecionados na janela do navegador, mas não selecionar os mapas. </li><li> No menu Navigator novamente selecione a opção &quot;Adquirir nos Pontos &#39;. No Navigator Adquirir diálogo escolher &quot;realinhar o item &#39;, focagem automática&#39; e &#39;eucentricity áspera&quot;, como tarefas preliminares, e selecione&#39; Adquirir série tilt &#39;como a principal tarefa, e selecione&#39; Feche as válvulas de colunas no final &#39;para fechar a coluna, quando tudo dos pontos foram recolhidos. Após proceder uma série de inclinação serão coletados em cada ponto em cada mapa. </li></ol></li></ol> 4. alta taxa de transferência da série Tilt automatizadas de processamento e Reconstrução Usando Tomoauto <ol><li> Correcção de Movimento induzida-Beam em dados de dose-fracionada [opcional] NOTA: Tomoauto usa MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) para remover o movimento induzido por feixe de micrografias fraccionou-dose. NOTIONCORR 16 deve ser instalado no sistema. <ol><li> Com a série de inclinação original, o registro de saída do SerialEM 10 e as imagens individuais de doses fraccionadas todos no diretório de trabalho atual, em um terminal execute o comando: dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt; &lt;Filename.st&gt; é o nome da série de inclinação para processar. </li></ol></li><li> Alinhamento e Reconstrução de Tilt-série NOTA: Tomoauto por padrão usa IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) para lidar com tilt-série automatizado de geração do modelo fiducial, o alinhamento, a determinação da função de transferência de contraste (CTF), CTF-correção 23, e reconstrução. Alternativamente os usuários têm a opção de usar em tomoauto RAPTOR 24 (incluído no IMOD) para a geração de modelo fiducial automatizado, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) para determinar o CTF, e tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) para a reconstrução ou em qualquer combinação de pacotes de software por configuração. Esta configuração, bem como os parâmetros disponíveis em cada pacote é tratado por um arquivo de configuração global que pode ser editado para se adequar os valores mais comumente utilizados em um laboratório enquanto os arquivos de configuração locais também podem ser criados para parâmetros detalhe usado para uma amostra específica, coleção definir ou tilt-série individual. Todos os pacotes que deseja utilizar deve ser instalado no sistema. <ol><li> Com a série de inclinação no diretório de trabalho atual, em um terminal de executar o comando tomoauto --CTF --mode = align &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;Filename.st&gt; é a série de inclinação para ser processado e &lt;fid_diam&gt; é o Diameter um dos marcadores de referência no nanômetros. Este comando irá alinhar e estimar o CTF da série tilt automaticamente. É possível ignorar o processamento CTF removendo a opção --CTF do comando. </li><li> Inspecione a série de inclinação alinhado visualmente por quaisquer erros gritantes no processamento de alinhamento e fiscalizar a CTF estimado por executar os comandos: 3dmod &lt;filename&gt; .ali submfg &lt;filename&gt; _ctfplotter.com respectivamente, onde &lt;filename&gt; é o nome da série tilt sem sufixo. Também verificar a saída do comando tomoauto ver o erro residual significativo gerado pelo alinhamento, que é uma estatística quantitativa da qualidade do alinhamento. </li><li> Dado um alinhamento aceitável proceder processamento executando o comando: tomoaupara --CTF --mode = reconstruir &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; com as mesmas substituições de usuário como em 4.2.1. Este comando irá corrigir o CTF, apagar os marcadores fiduciais da série tilt e calcular a reconstrução. Novamente processamento CTF pode ser ignorada como em 4.2.1. </li><li> [opcional] Para pular a etapa de inspeção visual e automatizar completamente o processamento e reconstrução executar o comando tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [opcional] Para usar uma configuração local específico, consulte a documentação tomoauto sobre como gerar um arquivo de configuração local, e em seguida, executar o comando tomoauto [opções] -L &lt;local_config&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; onde &lt;local_config&gt; é o nome do local, configuration arquivo. </li></ol></li></ol> 5. Sub-tomogram Média NOTA: Nós usamos o pacote i3 15 (http://www.electrontomography.org/) para processar experiências de média sub-tomogram, no entanto, o protocolo descrito aplica-se geralmente a maioria disponível sub-tomogram experimentos processo packages16to software da média sub-tomogram de média, no entanto, o protocolo descrito aplica-se geralmente a maioria disponível sub-tomogram pacotes de software de média 16-18. <ol><li> Com o tomogram reconstruída no diretório de trabalho atual abrir o tomogram por partículas picking executando o comando: tomopick &lt;filename&gt; .rec onde &lt;filename&gt; é como em 4.2.2. Na janela que se abre usar o botão esquerdo do mouse para clicar sobre o primeiro corpo basal e, em seguida, a ponta da agulha para selecionar um injectisome e usar a seta teclas para cima e para baixo para riff através das fatias do tomogram. Selecione todas as injectisomes visíveis dessa maneira. Este armazena as coordenadas de um ficheiro de texto que definem o eixo do comprimento da estrutura, bem como a estimativa de dois dos três ângulos de Euler que descreve a orientação da estrutura. </li><li> Extracto computacionalmente 400 3 cubos de voxel da tomografia centrado no ponto médio do eixo longitudinal definido pela execução do comando: grampo redimensionamento Cx &lt;x&gt;-Cy &lt;y&gt; -CZ &lt;z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;filename&gt; .rec &lt;filename&gt; _001.mrc onde &lt;x&gt;, &lt;y&gt;, &lt;z&gt; as coordenadas do ponto médio da estrutura e &lt;filename&gt; é como em 4.2.2. O tamanho do cubo extraído deve variar de acordo com a estrutura e a ampliação usada, e deve ser suficientemente grande para envolver adequadamente a estrutura de interesse, que para este exemplo é de 400 3 voxels. </li><li> Baixo-amostra (compartimento) do sub-tomograma por um factor de quatro para reduzir o tempo de computação para o alinhamento inicial, executando o comando: binvol -b 4 &lt;filename&gt; _001.mrc &lt;filename&gt; _001.bin4.mrc onde &lt;filename&gt; é como em 5.2. </li><li> Aplique a determinados ângulos de Euler de sub-tomograms e calcular a média global para produzir o modelo inicial executando o comando. I3totsum.sh </li><li> Alinhe e classificar-se-amostradas sub-tomograms usando uma máscara binária classificação da área citoplasmática. Executar sub-tomogram média no espaço Fourier para minimizar os artefatos desaparecidos cunha característicos da tomografia. Para binning 4 de dados, utilize o SAMPFACT = &quot;4 4 4&quot;. i3mramsacls.sh </li><li> Repita o passo 5,5 utilizando sub-amostradas tomograms-down por um fator de dois (SAMPFACT = &amp;# 34; 2 2 2 &quot;) e mais uma vez com os dados originais (SAMPFACT =&quot; 1 1 1 &quot;). i3mramsacls.sh </li></ol>

<ol><li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+III+secretion+injectisome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The type III secretion injectisome.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).</li>
<li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li>
<li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li>
<li>Schraidt, O., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Salmonella%27s+needle+complex+at+subnanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution.</a> Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).</li>
<li>Hodgkinson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+Shigella+T3SS+transmembrane+regions+reveals+12-fold+symmetry+and+novel+features+throughout%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).</li>
<li>Kudryashev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structural+analysis+of+the+Yersinia+enterocolitica+injectisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome.</a> eLife. 2, e00792(2013).</li>
<li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+distinct+structural+features+of+Salmonella+injectisome+and+flagellar+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body.</a> Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).</li>
<li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ-the+potential+of+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+structure+at+8.5%C3%85+resolution+using+cryo-electron+tomography+and+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging.</a> J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+tomography%3A+an+integrated+software+suite+for+real-time+electron+microscopic+tomographic+data+collection%2C+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt-series+in+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).</li>
<li>Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+subvolume+alignment+and+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).</li>
<li>Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Architecture+of+Axonemes+Revealed+by+Cryoelectron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+type+III+secretion+sorting+platform+of+Shigella+flexneri%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).</li>
<li>Iancu, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Cryoelectrontomography+of+Bacterial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTF+determination+and+correction+for+low+dose+tomographic+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series.</a> J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).</li>
<li>Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).</li>
<li>Rouhou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomo3D+2.0+%E2%80%93+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+%28AVX%29+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li>
<li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li>
<li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li>
<li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W%3A+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método de alto rendimento descrito aqui nos permitiu processar 1.917 crio tilt-série e produzir mais de 4.500 sub-tomograms do S. intacta flexneri injectisome 19. Os dados recolhidos conduziu à caracterização detalhada de injectisome em situ, incluindo o complexo citoplasmático triagem. O método também foi utilizado para visualizar várias células mutantes com deleção específica de componentes de proteína putativos, o que ajudou a elucidar a composição da p...

Tipo III sistemas de secreção (T3SS) são determinantes de virulência essenciais para muitos patógenos gram-negativas. O injectisome, também conhecido como o complexo de agulha, é a máquina central de T3SS necessária para a translocação directa de proteínas efectoras a partir da bactéria em células hospedeiras eucarióticas 1, 2. A injectisome compreende uma agulha extracelular, uma basal do corpo, e um complexo citoplasmático também conhecida como o complexo de triagem 3. Estudos anteriores elucidado estruturas 3-D de injectisomes purificadas de Salmonella e Shigella, juntamente com as estruturas atômicas de grandes proteínas do corpo basais 4, 5. Recentes em estruturas in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, e Yersinia foram revelados por crio-ET 6 , 7. No entanto, o complexo citoplasmático, essencial para a selecção efectora e conjunto de agulha, não foi visualizado nessas estruturas. Cryo-ET é o most técnica adequada para a imagiologia maquinaria molecular na resolução nanometros no seu contexto celular natural (in situ). No entanto, a resolução alcançável por crio-ET é limitado pela espessura da amostra. Para superar o problema, nós fotografada injectisomes intactas em um Shigella flexneri estirpe virulenta que foi geneticamente modificada para produzir minicï¿½ulas finas o suficiente para crio-ET. Outra limitação de crio-ET representa a sensibilidade da amostra para a radiação induzida pelo feixe de electrões, que destrói muito rapidamente a informação de alta resolução na amostra. Como resultado, doses extremamente baixas são utilizados para a inclinação-imagens individuais de modo a que uma dose adequada pode ser distribuído entre a série completa de inclinação. Isto reduz grandemente a proporção de sinal-para-ruído (SNR) na reconstrução final, o que o torna difícil de diferenciar as características estruturais de objecto a partir da grande quantidade de ruído na tomografia e que limita a resolução pode ser conseguida por cryo- ET. Conventional de processamento de imagem tais como Fourier e filtros no espaço real, bem como para baixo de amostragem pode ser utilizado para aumentar o contraste, mas à custa de filtrar a maior parte da informação de alta-resolução. Recentemente, sub-Tomogram média tornou possível aumentar grandemente o SNR e, subsequentemente, a solução final em alguns casos, para níveis sub-nanômetros 8, 9. Uma análise mais detalhada de complexos é possível graças computacionalmente extrair milhares de sub-tomogramas contendo as áreas de interesse dos tomograms originais e, em seguida, alinhando e em média os sub-tomograms para determinar em estruturas complexas in situ com maior SNR e maior resolução. Estes métodos podem ser integrados com abordagens genéticas para fornecer ainda maiores insights sobre montagens macromoleculares e suas conformações dinâmicas no contexto celular nativa. Em geral, dezenas ou mesmo centenas de milhar de sub-tomogramas precisa ser calculada a média, a fim de determinar alta-Resolução estruturas in situ. A aquisição de um número suficiente de inclinação-série necessária para produzir este grande número de sub-tomogramas rapidamente se torna um gargalo. A série de inclinação resultante são frequentemente afectados pela mudança induzida por feixe, fase folga, bem como ampliação, rotação e defeitos de inclinação, o que deve ser resolvido para trazer a inclinação-alinhamento em série antes da reconstrução. A série de inclinação é tipicamente alinhados por rastreamento marcadores fiduciais de ouro, que tradicionalmente são selecionados manualmente através de inspeção da série tilt, causando ainda um outro gargalo. Muitos pacotes de software têm sido desenvolvidos para aquisição tilt-série automatizada através controlados por computador microscópios eletrônicos de 10, 11, 12, alinhamento tilt-série e reconstrução 13, 14 e sub-tomogram média de 15-18. Como lidar com estes pacotes operações discretas no fluxo de trabalho de crio-ET, torna-se desejável para construir um nível maior de abstração no processo para systematicamente agilizar todo o esquema em um único pipeline. Por isso, desenvolvemos uma biblioteca wrapper software &quot;tomoauto&quot; projetado para organizar um número destes pacotes em uma única unidade semi-automatizado, permitindo a operação de usuário simples, mantendo a configuração completa de cada componente de forma centralizada. A biblioteca é open-source, bem documentado, continuamente desenvolvido e disponível gratuitamente para uso, desenvolvimento adaptado ou uma maior integração por meio de uma linha fonte remota de código repositório (http://github.com/DustinMorado/tomoauto). Este high-throughput crio-ET oleoduto tem sido utilizada para visualizar injectisomes intactos Em S. minicï¿½ulas flexneri. Um total de 1,917 tomogramas foram gerados utilizando este método, revelando uma alta resolução em estrutura situ da máquina intacto, incluindo a plataforma de triagem citoplasmática determinado pelo sub-Tomogram média de 19. Juntamente com modelação molecular de tipo selvagem e mutant máquinas, a tubagem de alto rendimento fornece um novo caminho para compreender a estrutura e função da injectisome intacta no contexto celular nativo.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Tyrptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Apparatus</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Cuvette</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Cryogenic Tube</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>Glow Discharge Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&amp;nbsp;</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device</td></tr><tr><td>High-Frequency Generator</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-10A</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device.&amp;nbsp; CAUTION: This device generates high voltages.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>72705-D</td><td>Style 5 Anti-magnetic</td></tr><tr><td>Colliodal Gold</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Ethane&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>Plunger Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Cryogenic Grid Storage Box</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30&lt;br/&gt; (300 KeV)</td></tr><tr><td>Direct Detection Device Camera</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram Acquisiton Software</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td></tr><tr><td>Beam-induced Motion Correction Software</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires &gt;2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>Tilt-Series Alignment Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>Automatic Fiducial Marker Modelling Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>CTF Determination Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>Tilt-Series Reconstruction Software</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo</td></tr><tr><td>Tilt-Series Automated Processing Software</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>Particle Picking Software</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD</td></tr><tr><td>Subvolume Averaging Software</td><td>i3</td><td></td><td>Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Amostras de S. minicï¿½ulas flexneri foram coletadas e processadas conforme mostrado na Figura 1 esquema usando tomoauto seguindo o gasoduto detalhado na Figura 2. Tilt-série foram coletados por meio SerialEM 10, que permite a aquisição de alto rendimento tilt-série em pontos designados pelo utilizador em mapas de montagem de baixa ampliação (Figura 3). As microgra...

Watch this Scientific Journal Video about Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography at JoVE.com

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K visualizações.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes. 

Vídeo: Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imunologia e Infecção

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Bioengenharia

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Bioquímica

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography de células bacterianas

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologia

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for the high-resolution structure determination of biological macromolecules. Despite the remarkable advances in cryo-EM, there is still scope for improvement in various aspects of the single-particle analysis workflow. Single-particle analysis demands a suitable software package for high-throughput automatic data acquisition. Several automatic data acquisition software packages were developed for automatic imaging for single-particle cryo-EM in the last eight years. This paper presents an application of a fully automated image acquisition pipeline for vitrified biomolecules under low-dose conditions. 
It demonstrates a software package, which can collect cryo-EM data fully, automatically, and precisely. Additionally, various microscopic parameters are easily controlled by this software package. This protocol demonstrates the potential of this software package in automated imaging of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein with a 200 keV cryo-electron microscope equipped with a direct electron detector (DED). Around 3,000 cryo-EM movie images were acquired in a single session (48 h) of data collection, yielding an atomic-resolution structure of the spike protein of SARS-CoV-2. Furthermore, this structural study indicates that the spike protein adopts two major conformations, 1-RBD (receptor-binding domain) up open and all RBD down closed conformations.

Single-particle cryo-electron microscopy demands a suitable software package and user-friendly pipeline for high-throughput automatic data acquisition. Here, we present the application of a fully automated image acquisition software package, Latitude-S, and a practical pipeline for data collection of vitrified biomolecules under low-dose conditions.

Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...