私たちは、組織学的手順で共焦点イメージングとゲイルマッケとマイクMuntiferingとマットKofronの支援を認めます。この作品は、部分的に健康NHLBI（DSへK01HL115447）の国立研究所によってサポートされていました。

動物を無菌条件下で飼育しました。マウスはCCHMC施設内動物管理使用委員会（オハイオ州シンシナティUSA）によって承認されたプロトコルに従って取り扱われました。これらの研究を通して利用したマウスは混合バックグラウンドで維持しました。 1.ホールマウントX-ガラクトシダーゼ染色<ol><li> CO 2吸入によって、E14.5にE11.5で妊娠中の女性を安楽死させます。 、CO 2室で動物を置き、CO 2でチャンバーを充電。 5分間の最低室で動物を維持します。頚椎脱臼により安楽死の二次方法を実行します。 </li><li>エタノール（エタノール）70％と、単一の腹部正中切開で開腹術を行うときれいな腹部領域。手術用ハサミと標準パターン（ストレート鋸歯状）鉗子を利用します。 </li><li>鉗子と細かいハサミを使用して子宮角を分離し、直ちに冷却したPBS溶液を含むペトリ皿に組織を配置します。先に進むまで氷上で組織を維持胚を単離します。 </li><li>子宮角から胚を分離します。解剖顕微鏡を使用して、胚気管肺組織を分析。胚を放出子宮組織とconceptiを保持し、穿刺する先端の細いピンセットやハサミを使用しています。 <ol><li>残りの胚膜を削除します。針刃の支援を受けて胚および横隔膜下の下半身部分の頭をカット。ランドマークとして、肝臓の位置を確認します。 </li><li>胚の胸部の単離後、針の刃を使用して、体壁、脊椎、心臓の側面を除去するために進んでください。気管組織を傷つける避けるために心を除去しながら注意してください。最後に、慎重に、針の刃の支援を受けて食道を引いて、気管から食道を分離します。氷上のPBS溶液中で組織を維持します。 </li></ol></li><li> 4ミリリットル中に組織を置き、ガラスを使用して、キャップバイアルまたは転送ピペットをねじ込みます。 30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で気管肺組織を修正しました。固定後、PBSで組織をすすぎます。すすぎながら、X-gal染色溶液（5mMのK 3のFe（CNを追加）6を、（100μlの0.5 Mストック）5 mMのK 4のFe（CN）6（100μlの0.5 Mストック）2のMgCl 2、（準備20μlの1 Mストック）0.01％NaDOC（50μlの2％ストック）、0.02％NP 4 O（100μlの2％ストック）、1mg / mlのX-galを（20 mg / mlでストック500μlの）および9.13ミリリットル10mlの最終容量）をもたらすために蒸留水。 </li><li>残りのPBSを削除し、ガラスバイアルにX-gal染色溶液の2ミリリットルを追加します。シェーカー上トレイにバイアルを置きます。 X-gal染色溶液で染色組織1~2時間。さらに処理および埋め込みのために4時間のX-gal溶液中で組織をインキュベートします。 </li><li> 3％のジメチルスルホキシド-PBSで組織を洗浄することによって反応を停止させます。 5分間、PBS中の70％エタノール中で各洗浄や店舗を3回すすいでください。 </li><li> 1％アガロース/ PBS溶液でペトリ皿を埋めます。アガロース固化することを可能にします。ガラス転移ピペットを用いて、アガロース共同で組織を配置PBS溶液で満たされたatedプレート。解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。明のための適切なフィルタを選択します。 </li><li>優れたパラフィン包埋し、切片用のX-gal染色処理サンプルのサイトを区別するために。細かい画面カセットでサンプルを置きます。 <ol><li>自動化されたプロセッサを使用するパラフィン包埋のためにサンプルを処理し、次のように短い周期を設定するには：アルコールの6変更：5分最初の変更及び残りの各変化当たり3分。キシレンの三つの変化：5分最初の変更と3分次の二つの変更。前の手順は、30℃で実施されています。 25分、8分および5分：最後に、62℃におけるパラフィンの3変更を行います。 </li></ol></li><li>ボートを埋め込むの底に平らに横たわっている組織で埋め込むための東洋サンプル。慎重に埋め込むボートを埋めるためにパラフィンを追加します。パラフィンが凝固するまで駅を埋め込むのコールドプレートにすぐに冷却します。ボートを埋め込むからブロックを削除してください。ミクロトームを用いて、6ミクロンのを生成ections。スライド上の前処理し、スライドやドライスライド上のマウント部1時間42℃で暖かいセット。 </li><li>焼く56ºCのオーブンで一晩スライドします。ラックにスライドを置きます。脱パラフィンは、100％キシレンの3変化、10分ごとにスライドします。キシレンの200ミリリットルで満たされた皿を染色に使用します。 </li><li> 10〜30秒間核ファーストレッドで対比染色する前にPBSに段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％及び30％、工程ごとに1分間）を用いてスライドを再水和します。水道水で5分間の核ファストレッドの過剰を削除するたびに3回スライドを洗浄します。 </li><li>キシレンベースの取り付けメディアで滑る3キシレンの変化（20ディップそれぞれ変化する）と、カバー中で洗浄する前に段階的エタノールシリーズ（50％、70％および100％エタノール）でスライドを脱水。 </li></ol> 2.レクチン染色<ol><li>ステップ1.4から1.1に記載されているようにE13.5とE14.5の気管肺組織を解剖。ガラス転送ピペットを使用すると、スクリューキャップバイアルに組織を配置します。 2mlで気管肺組織を修正しました。4℃で2％PFA溶液を一晩。固定後、PBSで10分間ずつ洗浄するための三回の試料をすすぎます。 </li><li>緩衝溶液の10mlを、通常、最終容積を遮断準備します。 8mlのPBSにBSA（1％）の0.1グラムを追加します。 BSAが溶解することを可能にします。ヤギ血清（2％）トリトンX-100（0.3％）の0.03ミリリットルの0.2ミリリットルを追加します。 PBSで10ミリリットルに最終容量を持参。室温でブロッキング緩衝液の0.5ミリリットルで1時間ブロックサンプル。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、ブロッキング緩衝液を除去し、レクチンのを50μg/μlの、10％ヤギ血清およびPBSで構成されるレクチン溶液と交換してください。サンプルあたりのレクチン溶液の250μlのを使用してください。 4℃で一晩インキュベートします。アルミホイルで組織を含有するガラスバイアルをカバーすることを確認します。レクチン溶液とインキュベートした後、10分間、PBS中で3回のサンプルをリンス。 </li><li>サンプルをカバーするのに十分なPBSを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に入れ植。蛍光解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。 appropを選択riateフィルタは、蛍光を検出します。レクチンPNAは通常、GFPに結合されています。 </li></ol> 3.ホールマウント免疫染色および共焦点顕微鏡<ol><li> 4ミリリットルガラススクリューキャップバイアルに移し、4％PFAで一晩固定し、気管肺組織を分離します。 E11.5組織を2％PFAで固定することができます。メタノール中の100％を保管してください。サンプルは-20℃で数ヶ月まで保存することができます。 </li><li>トランスファーピペットを用いてメタノールを除去し、2時間デントのブリーチ（4部メタノール、1部のDMSOと1部の30％H 2 O 2）を用いて試料を透過。次のようにPBSで希釈したメタノールの段階的シリーズの水和物組織：100％メタノール、75％メタノール、50％メタノール、25％メタノール、100％PBS。水和の各ステップ中、室温で10分間インキュベートします。 </li><li> PBSで希釈した0.5％ブロッキング試薬でブロック組織攪拌しながら室温で2時間（詳細は材料を参照されたいです）。 </li><li>ブロッキング、一次抗体を希釈溶液（Sox9を1：100、Nkx2.1 1：200、αSMA1：250）と4℃で一晩サンプルをインキュベートします。室温でPBSでサンプルを5回洗浄。 1時間ごとの洗浄を行います。 </li><li> 0.5％のブロッキング溶液中で1：500希釈で二次抗体を適用します。二次抗体の間で結合を防止するために二次抗体を慎重に選択します。暗い部屋で4℃で一晩インキュベートします。洗浄サンプルを室温で20分間3回洗浄しました。 25％メタノール、50％メタノール75％メタノール、100％メタノール、10分で各工程を以下のようにPBSで希釈したメタノールの段階的な系列でサンプルを脱水します。 注：サンプルはアルミホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えるたままであることを確認してください。撮影されるまで、組織は現在、数週間4℃で保存することができます。 </li><li>カスタムメイドへの転送サンプルステージプレートは、マレーの透明な溶液19,20（2部安息香酸ベンジル、1部ベンジルアルコール）、直ちにBEFの約200μlのメタノールとクリアを削除します鉱石イメージング。共焦点顕微鏡を用いて写真。プロセスおよびイメージングソフトウェアを用いて画像を解析します。 </li></ol> 4.細胞増殖<ol><li>体重を100μgのBrdU / gの濃度でのBrdUの溶液で腹腔内E11.5妊娠マウスに注入します。 E12.5またはE13.5で胚を、プロトコルのセクション1で説明し、単離のように女性を生け贄に捧げます。ナイフの刃、消費税ヘッドや胸腔下の下半身を使用。 </li><li> 4ミリリットルキャップバイアルをねじで胸部組織を置き、一晩4％PFAの1ミリリットルで固定します。 5分間のPBSで2回洗浄サンプルを、以下のように70％エタノールを蒸留水までで希釈したエタノールの一連のサンプルを脱水：30％、50％および70％エタノールを、5分間、各ステップは。 <ol><li>ミディアムサイズの画面カセットに入れサンプル。プロセッサを使用し、自動化されたパラフィン包埋のためのプロセスの組織。 8分間、アルコールの6変化、6分間、キシレンの3変化、3つのCを次のように周期を設定します25分、9分と8分間のパラフィンのhanges、。 </li></ol></li><li>スライド上のセクション1.セクションで説明したように6ミクロンの横方向または縦方向のセクションを生成し、組織が1時間42℃でスライドウォーマーセットにスライドするように付着することを可能にする所望の位置に組織を配向パラフィンに埋め込みます。 </li><li>一晩56℃のオーブンでその両側にスライドし、焼きます。プラスチック製のラックにスライドを置きます。 100％キシレンの3変化、変化当たり10分に浸漬することによって脱パラフィンを塗るスライド。完全にスライドを沈めるためにキシレンの200ミリリットルを使用してください。 PBS（5分）まで段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％および30％、攪拌しながらステップごとに5分）を用いてスライドを再水和します。 </li><li> 0.1 Mクエン酸の18ミリリットルは、一水和物、クエン酸緩衝液混合物の100ミリリットルと0.1 Mクエン酸ナトリウムの82ミリリットルを調製するために、10mMのにクエン酸緩衝液、pHが6を用いて、抗原回復を実行します。 <ol><li>高電力で6.5分間、抗原回収溶液とマイクロ波で満たされたプラスチック製のコプリンジャーに入れサンプル。 DISを追加6分間40％のパワーで蒸発させ、クエン酸緩衝液と再加熱を補償するために、コプリンジャーに水を耕作。 </li><li>水でトップ、そして6分間、40％のパワーで再び再加熱するコプリンジャーを記入してください。マイクロ波の時間は、使用されるマイクロ波に基づいて異なる場合があります。 </li><li>スライドを5分間PBSに続いて、1分間蒸留水でスライドを洗浄する前に室温で20分間冷却してください。 PBS後TBS（トリス塩基の2.425 gの蒸留水1Lに希釈したNaClを8.765 g）を10％ロバ血清および1％BSAを含有するブロッキング溶液中で、2時間ブロックスライドを洗います。 </li></ol></li><li>溶液（10％ロバ血清および1％BSAを含むTBS）をブロックに希釈した一次抗体を加えます。 BrdU（有糸分裂マーカー）、Nkx2.1（気道上皮）、Sox9を（軟骨に上昇を与える細胞）およびαSMA（平滑筋細胞）。 4℃で、一晩スライドをインキュベートします。抗体を節約するために、オーバーレイメソッドを使用します。ガスケットへの抗体の180μLを適用した後、カバースリップかのようにスライドを取り付けpingを実行。 </li><li>蒸留水にスライドを浸漬することによりガスケットを外します。ガスケットを除去した後、0.1％のTween-20を含むTBSで6 5分間の洗浄を行うことにより、未結合一次抗体を洗浄します。 <ol><li>室温で1時間、200：1の希釈でブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を用いてスライドをインキュベートします。それらの間の望ましくない結合を防ぐために慎重に二次抗体を選択します。 0.1％のTweenを含むTBSで3 5分間洗浄を行うことにより、未結合の二次抗体を除去します。 </li><li> 5分間二回、0.1Mトリス塩基でスライドを洗浄し、5分間二回、その後0.05 M Tris塩基。またはDAPI（1.5 / mlの）せずに取り付けメディアを使用してcoverslipingながらスライドを0.05 Mトリス塩基のままになることがあります。 4℃でスライドフォルダに保管スライドとアルミホイルでフォルダを覆うことにより、光から保護します。 </li></ol></li><li>自動化された蛍光顕微鏡を用いて染色し、写真を視覚化します。標識細胞とで撮影フィールドあたりの全細胞を数えます20Xと40Xは、全細胞に増殖細胞の割合を決定します。 </li></ol>

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&quot;著者らは、開示することは何もありません。」

気道の形態形成の基礎となるイベントは、完全に、誘導気道のパターニングのために必要な、特にプロセスを理解されていません。以前の研究では、現像外植片が気液相間での培養またはマトリゲル21,22内に埋め込まれている、請求エキソビボ技術を利用しています。これらの研究は、成長因子は現像気管のパターニングおよび気管軟骨の形成にどのように影響するかを示して...

気道の開発は腹側内胚葉の前腸1,2におけるNkx2.1陽性細胞の出現と日胚9（E9）により開始されます。管は別個のエンティティとして区別することができるときに食道・気管チューブ分離は、E11.5によって間葉組織3で囲まれたを解決します。 Wntシグナル伝達は、肺の発育不全4,5になります内胚葉気道上皮からの内臓間葉とβカテニンの欠失によって表現さWNT2とWnt2bの削除など気道の仕様に重要な役割を果たしています。我々の以前の研究では、肺の発育不全における内胚葉気道結果から、肺血管の開発および気管間葉6,7の誤パターニングの欠陥をWLSの削除、すべてのWntリガンドの分泌を媒介する貨物の受容体を決定しました。これらのデータは、上皮間葉CROの重要性をサポートそれはまた、他の研究8,9に示されているように、SSは、細胞分化および仕様で話します。 肺の開発の初期段階の研究では、私たちはより良い呼吸アイデンティティ10-16を駆動する機構を理解することができましたvitroおよびex vivoの技術では、遺伝的に依存しています。空気液体間期における全肺外植片培養物を広く形態形成10,17,18に分岐肺の初期段階での成長因子の効果を研究するために利用されています。この方法は、形態素など分枝形態形成などの変更、および遺伝子発現調節の読み出しとして使用されているが、それは文化そのものが血管系17の開発をサポートしていないとして、発達過程の初期段階の研究に限定されています。気管軟骨の発達は、この培養技術と互換性がないとすることができる、より長いインキュベーション時間を必要とします。 アナライザーへ電子気道形成中のWntシグナル伝達の役割は、私たちは、胚の研究のニーズを満たすために、標準的な技術を適応しています。我々は、気管・肺組織の清算のためのパラフィン包埋し、タイミングのためにボリューム、染色倍、処理サイクルを変更しました。本研究に記載された技術の最適化の主な目的は、E14.5までE11から行わマウスにおける気管開発の初期段階を分析することでした。レポーターマウスラインAxin2LacZ開発気管間充織におけるWnt /βカテニン活性を、我々正確に決定部位を使用して。また、全体のマウント気管組織のためのレクチン染色法を適応しています。したがって、我々は、間葉系縮合を視覚化し、軟骨形成が行われる部位を予測することができました。高度な顕微鏡技術と相まって、全体のマウントとWlsShhCreのマウスから得られた胚組織の切片の染色は、私たちはTRAによって生成されたWntリガンドの役割を明らかにするために許可されました気管パターニングでCHEAL上皮。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>1:400 , rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-20095</td>
			<td>1:50, rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5228</td>
			<td>1:2k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:100, guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:400, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB1893</td>
			<td>1:200, sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-32323</td>
			<td>1:4k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 7381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Alexa fluor Molecular probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaDOC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>89905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP4O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher brand super-frost plus</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11K413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Component of TSA kit #2&#160;&#160;&#160; ( T20932)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrDu</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C-0250-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy cassettes</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>BC0109</td>
			<td>Available in different colors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red&#160; Kernechtrot 0.1%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4641-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>399000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro knives</td>
			<td>FST</td>
			<td>10318-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 ceramic coated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5CO</td>
			<td>FST</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon i90</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Wide field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonA1Rsi</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MS 16 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaging processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Wnt /βカテニン活動ホールマウントラック-Z染色は記者Axin2 ラック -Zマウス 11から分離された胚の気管・肺組織で検出されました。染色のサイトは、Wnt /βカテニンの活性を示しています。全マウント染色のセクションの分析は、Wnt /βカテニン活性は気管の間充織における途上の肺の周辺領域...

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。

誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K ビュー.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. 全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。 

ビデオ: Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

発生生物学

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...