Riconosciamo l&#39;assistenza di Mike Muntifering e Matt Kofron con confocale e Gail Macke con procedure istologiche. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 per DS).

Gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni. I topi sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla CCHMC Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Cincinnati, OH USA). I topi utilizzati nel corso di questi studi sono stati mantenuti in uno sfondo misto. 1. monte intero X-galattosidasi colorazione <ol><li> Euthanize femmina incinta a E11.5 a E14.5, da CO 2 inalazione. Mettere gli animali nella camera di CO 2, caricare la camera con CO 2. Mantenere gli animali in camera per un minimo di 5 min. Eseguire il metodo secondario di eutanasia da dislocazione cervicale. </li><li> Pulire zona addominale con etanolo (EtOH) 70% ed eseguire laparotomia con un&#39;unica incisione mediana addominale. Utilizzare forbici chirurgiche e modello standard (seghettate dritto) pinza. </li><li> Isolare corna uterine con pinze e forbici sottili e collocare immediatamente il tessuto in capsula di Petri contenente raffreddato soluzione PBS. Mantenere il tessuto in ghiaccio fino procedereall&#39;isolamento di embrioni. </li><li> Isolare embrioni da corna uterine. Sezionare il tessuto polmonare tracheale embrionali utilizzando microscopio da dissezione. Utilizzare pinze punta fine e forbici per tenere e forare il tessuto uterino e del concepimento rilasciando gli embrioni. <ol><li> Rimuovere restante membrane embrionali. Con l&#39;aiuto di lame ago tagliare la testa di embrioni e la parte inferiore del corpo sotto il diaframma. Individuare fegato come un punto di riferimento. </li><li> Dopo isolamento della regione toracica dell&#39;embrione, procedere a rimuovere i lati laterali della parete del corpo, della colonna vertebrale e cuore con lame aghi. Fare attenzione durante la rimozione del cuore per evitare lesioni del tessuto tracheale. Infine, attenzione, separare l&#39;esofago dalla trachea tirando l&#39;esofago con l&#39;assistenza di lame aghi. Mantenere il tessuto in soluzione PBS in ghiaccio. </li></ol></li><li> Posizionare il tessuto in 4 ml di vite fiale cappuccio con pipette di vetro o di trasferimento. Fissare tessuto polmonare tracheale in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 30 min. Dopo la fissazione,lavare tessuti con PBS. Mentre il risciacquo, preparare la soluzione X-gal colorazione (aggiungere 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 ml 0,5 m stock) 5 mm K 4 Fe (CN) 6 (100 l 0,5 m stock) 2 mM MgCl 2, ( 20 l 1 m stock) 0,01% NaDOC (50 ml 2% stock), 0,02% NP 4 O (100 ml 2% stock), 1 mg / ml di X-gal (500 ml di 20 mg / ml di magazzino) e 9.13 ml di acqua distillata per portare a volume finale di 10 ml). </li><li> Rimuovere ogni residuo PBS e aggiungere 2 ml di soluzione di colorazione X-gal per la fiala di vetro. Mettere in fiale vassoio agitatore. tessuti Stain 1 a 2 ore nella soluzione colorante X-gal. Incubare il tessuto in soluzione X-gal per 4 ore per l&#39;ulteriore elaborazione e incorporamento. </li><li> Bloccare la reazione dei tessuti di lavaggio a 3% dimetilsolfossido-PBS. Sciacquare in PBS, 3 volte per 5 minuti ogni lavaggio e conservare in etanolo al 70%. </li><li> Riempire Petri con una soluzione all&#39;1% di agarosio / PBS. Lasciare agarosio solidificare. Usando pipette di vetro, posizionare il tessuto sulla cooperazione agarosiopiastre ATED riempite con soluzione PBS. Fotografare supporti interi usando un microscopio da dissezione. Selezionare il filtro appropriato per campo chiaro. </li><li> Per distinguere meglio i siti di campioni processo di colorazione X-gal per paraffina e sezionamento. I campioni in cassette a maglia fine. <ol><li> Per elaborare i campioni per paraffina utilizzano un processore automatizzato e impostare un breve ciclo come segue: sei cambi di alcol: 5 min prima modifica e 3 minuti per ogni variazione residua. Tre variazioni di xilene: 5 min prima modifica e 3 min prossime due modifiche. I passi precedenti vengono eseguiti a 30 ° C. Infine, eseguire tre cambi di paraffina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min. </li></ol></li><li> campioni Orient per l&#39;integrazione con il tessuto disteso sul fondo di incorporare barca. Aggiungere con cautela paraffina a riempire la barca embedding. Raffreddare immediatamente sul piatto freddo di incorporare stazione fino solidifica paraffina. Rimuovere blocco da incorporare barca. Utilizzando un microtomo, generare 6 micron sriflessioni. sezioni Mount su pretrattati-diapositive e diapositive a secco su vetrino più caldo insieme a 42 ° C per 1 ora. </li><li> Cuocere scorre durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack. Deparaffinare vetrini con tre cambi di 100% xilene, 10 minuti ciascuno. Utilizzare colorazione piatti riempito con 200 ml di xilene. </li><li> Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min per punti) in PBS prima controcolorazione con rosso nucleare da 10 a 30 sec. Sciacquare i vetrini con acqua di rubinetto tre volte per 5 minuti ogni volta per eliminare l&#39;eccesso di Nuclear Fast Red. </li><li> Disidratare i vetrini in una serie graduata di EtOH (50%, 70% e 100% EtOH) prima del lavaggio in tre cambi di xilene (20 buchi ogni cambio) e coprire scivolare con mezzo di montaggio a base di xilene. </li></ol> 2. lectina colorazione <ol><li> Sezionare E13.5 e E14.5 tracheale tessuto polmonare come descritto nei punti da 1.1 a 1.4. Usando pipette di vetro posto tessuto in flaconcini con tappo a vite. Fissare tessuto polmonare tracheale con 2 ml di2% soluzione PFA notte a 4 ° C. Dopo la fissazione, lavare i campioni in PBS per tre volte per 10 minuti ogni lavaggio. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio, solitamente un volume finale di 10 ml di soluzione. Aggiungere 0,1 g di BSA (1%) a 8 ml di PBS. Lasciare BSA per sciogliere. Aggiungere 0,2 ml di siero di capra (2%) 0.03ml di Triton X-100 (0,3%). Portare il volume finale a 10 ml con PBS. campioni del blocco per 1 h in 0,5 ml di tampone di bloccaggio a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere tampone bloccante con una pipetta di trasferimento e sostituirlo con una soluzione lectina composto da 50 mg / mL di lectina, 10% siero di capra e PBS. Utilizzare 250 ml di soluzione di lectina per campione. Incubare per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di coprire la fiala di vetro contenente il tessuto con un foglio di alluminio. Dopo incubazione con soluzione lectina, risciacquare campioni in PBS per tre volte per 10 min. </li><li> Luogo espianti in rivestito agarosio capsule di Petri contenenti abbastanza PBS per coprire i campioni. Fotografare monta interi utilizzando un microscopio a fluorescenza-dissezione. Selezionare il appropFiltro riate per rilevare la fluorescenza. Lectina PNA ben si abbina alla GFP. </li></ol> 3. monte intero Immunofluorescenza e microscopia confocale <ol><li> Isolare tessuto polmonare tracheale, trasferimento a 4 ml vite vetro fiale tappo e fissare durante la notte nel 4% PFA. tessuto E11.5 può essere fissato in 2% PFA. Conservare in metanolo 100%. I campioni possono essere conservati fino a diversi mesi a -20 ° C. </li><li> Rimuovere il metanolo con una pipetta di trasferimento e permeabilize campioni utilizzando Bleach di Dent (4 parti Metanolo, 1 parte di DMSO e 1 parte il 30% di H 2 O 2) per 2 ore. tessuto Hydrate in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 100% metanolo, 75% metanolo, 50% metanolo, 25% metanolo, 100% PBS. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente durante ogni fase di idratazione. </li><li> Tessuto Block in 0.5% reagente bloccante diluito in PBS (vedi Materiali particolari) per due ore a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Diluire anticorpo primario nel bloccaresoluzione (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubare campioni notte a 4 ° C. Lavare i campioni con PBS cinque volte a temperatura ambiente. Eseguire ogni lavaggio per 1 ora. </li><li> Applicare anticorpo secondario ad una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante 0,5%. selezionare con attenzione anticorpi secondari per evitare legame tra anticorpi secondari. Incubare per una notte a 4 ° C in camera oscura. Lavare i campioni tre volte per 20 minuti a temperatura ambiente. Disidratare campioni in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 25% metanolo, 50% metanolo 75% di metanolo, 100% metanolo, 10 min ogni passo. Nota: Assicurarsi che i campioni rimangono coperte con un foglio di alluminio e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. Tissue può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane fino fotografato. </li><li> Campioni di trasferimento a su ordine piastre di scena, rimuovere il metanolo e chiaro con circa 200 ml di soluzione chiara di Murray 19,20 (2 parti benzilico benzoato, 1 parte di alcool benzilico) immediatamente BEFl&#39;imaging minerale. Fotografia usando un microscopio confocale. Elaborare e analizzare immagine utilizzando il software di imaging. </li></ol> 4. proliferazione cellulare <ol><li> Iniettare E11.5 topi incinta intra-peritoneally con una soluzione di BrdU ad una concentrazione di 100 ug BrdU / g di peso corporeo. Sacrificio femminile come descritto nella sezione 1 del protocollo e isolare embrioni a E12.5 e E13.5. Usando lame di coltello, teste di consumo e la parte inferiore del corpo al di sotto della cavità toracica. </li><li> Mettere il tessuto toracico in 4 ml di vite fiale tappo e fissare in 1 ml di PFA 4% durante la notte. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 min e disidratano campioni attraverso una serie di etanolo diluito in acqua distillata fino al 70% di etanolo come segue: 30%, 50% e 70% di etanolo, per 5 minuti ogni passo. <ol><li> I campioni di medie dimensioni dello schermo cassette. tessuti Processo per incorporamento di paraffina utilizzo e il processore automatizzato. Impostare un ciclo come segue: sei cambi di alcol per 8 minuti ciascuno, tre cambi di xilene per 6 minuti ciascuno, tre cHANGES di paraffina, per 25 minuti, 9 min e 8 min. </li></ol></li><li> Incorpora in paraffina orientare il tessuto nella posizione desiderata per generare 6 trasversali micron o sezioni longitudinali, come descritto nella sezione 1. Posizionare sezioni su vetrini e consentire il tessuto di aderire a scivolare sulla slitta insieme più calda a 42 ° C per 1 ora. </li><li> scivoli cuocere, su un fianco, durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack di plastica. scivoli Sparaffinare per immersione in tre cambi di 100% xilene, 10 min a cambio. Utilizzare 200 ml di xilene per sommergere completamente diapositive. Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 min per passo con agitazione) di PBS (5 min). </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene utilizzando 10 mM tampone citrato, pH 6. Per preparare 100 ml di miscela di tampone citrato 18 ml di 0,1 M di acido citrico monoidrato e 82 ml di 0,1 M citrato di sodio. <ol><li> I campioni in vasi Coplin di plastica pieni di soluzione di antigene recupero e forno a microonde per 6,5 minuti ad alta potenza. Aggiungere disacqua distillata a vaschetta Coplin per compensare evaporata-citrato buffer e riscaldare alla potenza del 40% per 6 min. </li><li> Riempire vaschetta Coplin verso l&#39;alto con l&#39;acqua, e riscaldare di nuovo al potere il 40% per 6 min. volte a microonde possono variare in base a microonde utilizzata. </li><li> Lasciare vetrini raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente prima vetrini lavaggio in acqua distillata per 1 min, seguito da PBS per 5 min. Dopo il PBS lavare, vetrini blocco per 2 ore in una soluzione bloccante contenente TBS (2.425 g di Tris base e 8,765 g di NaCl diluito in 1 L di acqua distillata) 10% di siero asino e 1% BSA. </li></ol></li><li> Aggiungere anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante (TBS contenente 10% di siero Ciuchino e 1% BSA). BrdU (marcatore mitosi), Nkx2.1 (epitelio delle vie respiratorie), Sox9 (cellule che daranno luogo alla cartilagine) e αSMA (cellule muscolari lisce). Incubare i vetrini durante la notte, a 4 ° C. Utilizzare il metodo di sovrapposizione per conservare gli anticorpi. Applicare 180 ml di anticorpi di una guarnizione e quindi collegare slitta come se la copertura antiscivoloping. </li><li> Staccare la guarnizione immergendo i vetrini in acqua distillata. Dopo la rimozione della guarnizione, lavare anticorpo primario non legato eseguendo sei 5 min lavaggi con TBS contenente 0,1% Tween-20. <ol><li> Incubare i vetrini con anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante alla diluizione di 1: 200, per 1 ora a temperatura ambiente. Selezionare accuratamente anticorpi secondari per evitare indesiderate legame tra di loro. Rimuovere l&#39;anticorpo secondario non legato eseguendo tre a cinque lavaggi minuti con TBS contenente 0,1% di Tween. </li><li> Lavare i vetrini in 0,1 M di base Tris due volte per 5 minuti e poi 0,05 di base M Tris due volte per 5 min. I vetrini possono essere lasciato in 0,05 di base M Tris mentre coversliping utilizzo dei supporti di montaggio con o senza DAPI (1,5 mg / ml). Conservare i vetrini nella cartella di diapositive a 4 ° C e al riparo dalla luce coprendo cartella con un foglio di alluminio. </li></ol></li><li> Visualizza colorazione e fotografia utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato. Contare etichettati cellule e cellule totali per campo fotografato al20X e 40X per determinare i rapporti di cellule proliferanti di cellule totali. </li></ol>

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</ol>

&quot;Gli autori non hanno nulla da rivelare.&quot;

Eventi sottostanti morfogenesi del tratto respiratorio sono state comprese, in particolare i processi necessari per il patterning delle vie aeree di conduzione. Studi precedenti hanno utilizzato ex vivo le tecniche di cui espianti in via di sviluppo sono coltivate all&#39;interfase aria-liquido o incorporato in matrigel 21,22. Questi studi hanno dimostrato come fattori di crescita influenzano il patterning della trachea sviluppo e la formazione di tracheale cartilagine. Una limitazione a questi studi...

Lo sviluppo delle vie respiratorie è avviata da embrionali giorno 9 (E9) con la comparsa di cellule positive Nkx2.1 nel endodermico ventrale foregut 1,2. Esofago-tracheale separazione tubo si risolverà da E11.5 quando i tubi possono essere distinte come entità distinte, ognuna circondata dal tessuto mesenchimale 3. Wnt svolge un ruolo chiave nella specifica delle vie respiratorie come l&#39;eliminazione di Wnt2 e Wnt2b, espressa dal mesenchima splancnico e la cancellazione di β-catenina dal epitelio respiratorio endodermico si tradurrà in agenesia del polmone 4,5. I nostri studi precedenti hanno stabilito che la cancellazione di WLS, un recettore carico mediazione secrezione di tutti i ligandi Wnt, dai risultati del tratto respiratorio endodermico a ipoplasia polmonare, difetti di sviluppo vascolare polmonare e mis-patterning del tracheale mesenchima 6,7. Questi dati supportano l&#39;importanza del cro epitelio-mesenchimaless parlare nel differenziamento cellulare e specifica, come è stato mostrato anche in altri studi 8,9. Lo studio delle prime fasi di sviluppo del polmone si basa su genetica, in vitro ed ex vivo tecniche che hanno permesso di comprendere meglio i meccanismi di guida identità respiratoria 10-16. Intere culture espianto polmone all&#39;interfase liquido dell&#39;aria sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di fattori di crescita nelle prime fasi di polmonare branching morfogenesi 10,17,18. Mentre questo metodo è usato come lettura dei cambiamenti morfologici, come morfogenesi di ramificazione, e la modulazione dell&#39;espressione genica, è limitato allo studio delle prime fasi del processo di sviluppo, la cultura stessa non supporta lo sviluppo di vascolarizzazione 17. Sviluppo di tracheale cartilagine richiede tempi di incubazione più lunghi che possono essere non compatibili con questa tecnica di coltura. per Analyze il ruolo di segnalazione Wnt durante la formazione del tratto respiratorio, abbiamo adattato le tecniche standard per soddisfare le esigenze dei nostri studi embrionali. Abbiamo modificato i volumi, i tempi di colorazione, trattamento ciclismo per paraffina e la tempistica per la compensazione del tessuto tracheale-polmonare. L&#39;obiettivo principale di ottimizzare le tecniche descritte nel presente studio è stato quello di analizzare le prime fasi di sviluppo tracheale nei topi che si svolgono da E11 a E14.5. Utilizzando il topo giornalista linea Axin2LacZ noi siti precisamente determinati di attività / β-catenina Wnt in via di sviluppo mesenchima tracheale. Abbiamo anche adattato procedura di colorazione lectina per tutto il tessuto tracheale monte. Così, siamo stati in grado di visualizzare condensazioni mesenchimali e prevedere siti dove chondrogenesis avrà luogo. La colorazione di tutto il monte e sezioni di tessuto embrionale ottenuti da topi WlsShhCre, insieme con tecniche di microscopia avanzate, ci ha permesso di svelare il ruolo di ligandi Wnt prodotte dal TRAepitelio endotracheale nella trachea patterning.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , rabbit</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, rabbit</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, mouse</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, guinea pig</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, mouse</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, sheep</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mouse</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Alexa fluor Molecular probes</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher brand super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Component of TSA kit #2&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy cassettes</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Available in different colors</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&amp;nbsp; Kernechtrot 0.1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Micro knives</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ceramic coated</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wide field microscope</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescence Dissecting microscope</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Automated fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Leica Application suite</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica imaging software</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon imaging software</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaging processing software</td></tr></tbody></table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

attività / β-catenina Wnt Tutta la colorazione monte Lac-Z è stato rilevato nel tessuto tracheale-polmonare di embrioni isolati da giornalista Axin2 Lac Z topi 11. Siti di colorazione indicano l&#39;attività / β-catenina Wnt. Analisi di sezioni di montare tutto colorazione determinato che Wnt attività / β-catenina era presente nel mesenchima della trachea e mesenchima delle regi...

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

L&#39;uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l&#39;analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all&#39;analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale.

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K Views.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  L'uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l'analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all'analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Biologia

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt signaling operates via a dosage-driven mechanism, motivating the need to study and measure Wnt signaling in various cell types. Although several reporter models have been proposed to represent physiological Wnt expression, either the genetic context or the reporter protein highly influenced the validity, accuracy, and flexibility of these tools. This paper describes methods for acquiring and analyzing data obtained with the Axin2-mTurquoise2 mouse Wnt reporter model, which contains a mutated Axin2em1Fstl allele. This model facilitates the study of endogenous canonical Wnt signaling in individual cells over a wide range of Wnt activity.
This protocol describes how to fully appreciate Axin2-mTurquoise2 reporter activity using cell population analysis of the hematopoietic system, combined with cell surface markers or &#946;-catenin intracellular staining. These procedures serve as a base for implementation and reproduction in other tissues or cells of interest. By combining fluorescence-activated cell sorting and confocal imaging, distinct canonical Wnt expression levels can be visualized. The recommended measurement and analysis strategies provide quantitative data on the fluorescent expression levels for precise assessment of canonical Wnt signaling. These methods will be useful for researchers who want to use the Axin2-mTurquise2 model for canonical Wnt expression patterns.

<meta charset="utf8"></head><body>Citometria a flusso e analisi dell'imaging confocale della bassa espressione di Wnt nei timociti reporter Axin2-mTurquoise2

Signaling levels are known to regulate cell fate, indicating that regulation of Wnt signaling constitutes an interesting therapeutic target. Here, we describe flow cytometry and confocal microscopy analysis methods for a robust murine canonical Wnt signaling reporter model that measures distinct Wnt signaling levels.

Citometria a flusso e analisi dell'imaging confocale della bassa espressione di Wnt nei timociti reporter Axin2-mTurquoise2

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be differentiated stepwise into 3D multicellular lung organoids, made of both epithelial and mesenchymal cell populations. We recapitulate embryonic developmental cues by temporally introducing a variety of growth factors and small molecules to efficiently generate definitive endoderm, anterior foregut endoderm, and subsequently lung progenitor cells. These cells are then embedded in growth factor reduced (GFR)-basement membrane matrix medium, allowing them to spontaneously develop into 3D lung organoids in response to external growth factors. These whole lung organoids (WLO) undergo early lung developmental stages including branching morphogenesis and maturation after exposure to dexamethasone, cyclic AMP and isobutylxanthine. WLOs possess airway epithelial cells expressing the markers KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) and MUC5AC (goblet) as well as alveolar epithelial cells expressing HOPX (alveolar type I) and SP-C (alveolar type II). Mesenchymal cells are also present, including smooth muscle actin (SMA), and platelet-derived growth factor receptor A (PDGFR&#945;). iPSC derived WLOs can be maintained in 3D culture conditions for many months and can be sorted for surface markers to purify a specific cell population. iPSC derived WLOs can also be utilized to study human lung development, including signaling between the lung epithelium and mesenchyme, to model genetic mutations on human lung cell function and development, and to determine the cytotoxicity of infective agents.

The article describes step wise directed differentiation of induced pluripotent stem cells to three-dimensional whole lung organoids containing both proximal and distal epithelial lung cells along with mesenchyme.

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This process requires complex and coordinated paracrine interactions between signal-sending and signal-receiving cells. Given that these interactions can occur between various types of cells from different lineages, in vivo evaluation of cell-specific defects can be challenging. The present study describes a highly reproducible method to evaluate paracrine noncanonical Wnt signaling in vitro. This protocol was designed with the ability to (1) conduct functional and molecular assessments of noncanonical Wnt signaling between any two cell types of interest; (2) dissect the role of signal-sending versus signal-receiving molecules in the noncanonical Wnt signaling pathway; and (3) perform phenotypic rescue experiments with standard molecular or pharmacologic approaches.
This protocol was used to evaluate neural crest cell (NCC)-mediated noncanonical Wnt signaling in myoblasts. The presence of NCCs is associated with an increased number of phalloidin-positive cytoplasmic filopodia and lamellipodia in myoblasts and improved myoblast migration in a wound-healing assay. The Wnt5a-ROR2 axis was identified as a crucial noncanonical Wnt signaling pathway between NCC and second heart field (SHF) cardiomyoblast progenitors. In conclusion, this is a highly tractable protocol to study paracrine noncanonical Wnt signaling mechanisms in vitro.

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

The present study outlines a highly reproducible and tractable method to study paracrine noncanonical Wnt signaling events in vitro. This protocol was applied to evaluate the impact of paracrine Wnt5a signaling in murine neural crest cells and myoblasts.

Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioingegneria

Una revisione completa dei protocolli di coltura di espianti di pelle embrionale aviaria

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Autore in primo piano: Approfondimento sulle attuali metodologie sperimentali di espianti di pelle aviaria

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

Riepilogo

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Citometria a flusso e analisi dell'imaging confocale della bassa espressione di Wnt nei timociti reporter Axin2-mTurquoise2

Citometria a flusso e analisi dell'imaging confocale della bassa espressione di Wnt nei timociti reporter Axin2-mTurquoise2

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti