Riconosciamo l&#39;assistenza di Mike Muntifering e Matt Kofron con confocale e Gail Macke con procedure istologiche. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 per DS).

Gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni. I topi sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla CCHMC Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Cincinnati, OH USA). I topi utilizzati nel corso di questi studi sono stati mantenuti in uno sfondo misto. 1. monte intero X-galattosidasi colorazione <ol><li> Euthanize femmina incinta a E11.5 a E14.5, da CO 2 inalazione. Mettere gli animali nella camera di CO 2, caricare la camera con CO 2. Mantenere gli animali in camera per un minimo di 5 min. Eseguire il metodo secondario di eutanasia da dislocazione cervicale. </li><li> Pulire zona addominale con etanolo (EtOH) 70% ed eseguire laparotomia con un&#39;unica incisione mediana addominale. Utilizzare forbici chirurgiche e modello standard (seghettate dritto) pinza. </li><li> Isolare corna uterine con pinze e forbici sottili e collocare immediatamente il tessuto in capsula di Petri contenente raffreddato soluzione PBS. Mantenere il tessuto in ghiaccio fino procedereall&#39;isolamento di embrioni. </li><li> Isolare embrioni da corna uterine. Sezionare il tessuto polmonare tracheale embrionali utilizzando microscopio da dissezione. Utilizzare pinze punta fine e forbici per tenere e forare il tessuto uterino e del concepimento rilasciando gli embrioni. <ol><li> Rimuovere restante membrane embrionali. Con l&#39;aiuto di lame ago tagliare la testa di embrioni e la parte inferiore del corpo sotto il diaframma. Individuare fegato come un punto di riferimento. </li><li> Dopo isolamento della regione toracica dell&#39;embrione, procedere a rimuovere i lati laterali della parete del corpo, della colonna vertebrale e cuore con lame aghi. Fare attenzione durante la rimozione del cuore per evitare lesioni del tessuto tracheale. Infine, attenzione, separare l&#39;esofago dalla trachea tirando l&#39;esofago con l&#39;assistenza di lame aghi. Mantenere il tessuto in soluzione PBS in ghiaccio. </li></ol></li><li> Posizionare il tessuto in 4 ml di vite fiale cappuccio con pipette di vetro o di trasferimento. Fissare tessuto polmonare tracheale in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 30 min. Dopo la fissazione,lavare tessuti con PBS. Mentre il risciacquo, preparare la soluzione X-gal colorazione (aggiungere 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 ml 0,5 m stock) 5 mm K 4 Fe (CN) 6 (100 l 0,5 m stock) 2 mM MgCl 2, ( 20 l 1 m stock) 0,01% NaDOC (50 ml 2% stock), 0,02% NP 4 O (100 ml 2% stock), 1 mg / ml di X-gal (500 ml di 20 mg / ml di magazzino) e 9.13 ml di acqua distillata per portare a volume finale di 10 ml). </li><li> Rimuovere ogni residuo PBS e aggiungere 2 ml di soluzione di colorazione X-gal per la fiala di vetro. Mettere in fiale vassoio agitatore. tessuti Stain 1 a 2 ore nella soluzione colorante X-gal. Incubare il tessuto in soluzione X-gal per 4 ore per l&#39;ulteriore elaborazione e incorporamento. </li><li> Bloccare la reazione dei tessuti di lavaggio a 3% dimetilsolfossido-PBS. Sciacquare in PBS, 3 volte per 5 minuti ogni lavaggio e conservare in etanolo al 70%. </li><li> Riempire Petri con una soluzione all&#39;1% di agarosio / PBS. Lasciare agarosio solidificare. Usando pipette di vetro, posizionare il tessuto sulla cooperazione agarosiopiastre ATED riempite con soluzione PBS. Fotografare supporti interi usando un microscopio da dissezione. Selezionare il filtro appropriato per campo chiaro. </li><li> Per distinguere meglio i siti di campioni processo di colorazione X-gal per paraffina e sezionamento. I campioni in cassette a maglia fine. <ol><li> Per elaborare i campioni per paraffina utilizzano un processore automatizzato e impostare un breve ciclo come segue: sei cambi di alcol: 5 min prima modifica e 3 minuti per ogni variazione residua. Tre variazioni di xilene: 5 min prima modifica e 3 min prossime due modifiche. I passi precedenti vengono eseguiti a 30 ° C. Infine, eseguire tre cambi di paraffina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min. </li></ol></li><li> campioni Orient per l&#39;integrazione con il tessuto disteso sul fondo di incorporare barca. Aggiungere con cautela paraffina a riempire la barca embedding. Raffreddare immediatamente sul piatto freddo di incorporare stazione fino solidifica paraffina. Rimuovere blocco da incorporare barca. Utilizzando un microtomo, generare 6 micron sriflessioni. sezioni Mount su pretrattati-diapositive e diapositive a secco su vetrino più caldo insieme a 42 ° C per 1 ora. </li><li> Cuocere scorre durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack. Deparaffinare vetrini con tre cambi di 100% xilene, 10 minuti ciascuno. Utilizzare colorazione piatti riempito con 200 ml di xilene. </li><li> Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min per punti) in PBS prima controcolorazione con rosso nucleare da 10 a 30 sec. Sciacquare i vetrini con acqua di rubinetto tre volte per 5 minuti ogni volta per eliminare l&#39;eccesso di Nuclear Fast Red. </li><li> Disidratare i vetrini in una serie graduata di EtOH (50%, 70% e 100% EtOH) prima del lavaggio in tre cambi di xilene (20 buchi ogni cambio) e coprire scivolare con mezzo di montaggio a base di xilene. </li></ol> 2. lectina colorazione <ol><li> Sezionare E13.5 e E14.5 tracheale tessuto polmonare come descritto nei punti da 1.1 a 1.4. Usando pipette di vetro posto tessuto in flaconcini con tappo a vite. Fissare tessuto polmonare tracheale con 2 ml di2% soluzione PFA notte a 4 ° C. Dopo la fissazione, lavare i campioni in PBS per tre volte per 10 minuti ogni lavaggio. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio, solitamente un volume finale di 10 ml di soluzione. Aggiungere 0,1 g di BSA (1%) a 8 ml di PBS. Lasciare BSA per sciogliere. Aggiungere 0,2 ml di siero di capra (2%) 0.03ml di Triton X-100 (0,3%). Portare il volume finale a 10 ml con PBS. campioni del blocco per 1 h in 0,5 ml di tampone di bloccaggio a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere tampone bloccante con una pipetta di trasferimento e sostituirlo con una soluzione lectina composto da 50 mg / mL di lectina, 10% siero di capra e PBS. Utilizzare 250 ml di soluzione di lectina per campione. Incubare per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di coprire la fiala di vetro contenente il tessuto con un foglio di alluminio. Dopo incubazione con soluzione lectina, risciacquare campioni in PBS per tre volte per 10 min. </li><li> Luogo espianti in rivestito agarosio capsule di Petri contenenti abbastanza PBS per coprire i campioni. Fotografare monta interi utilizzando un microscopio a fluorescenza-dissezione. Selezionare il appropFiltro riate per rilevare la fluorescenza. Lectina PNA ben si abbina alla GFP. </li></ol> 3. monte intero Immunofluorescenza e microscopia confocale <ol><li> Isolare tessuto polmonare tracheale, trasferimento a 4 ml vite vetro fiale tappo e fissare durante la notte nel 4% PFA. tessuto E11.5 può essere fissato in 2% PFA. Conservare in metanolo 100%. I campioni possono essere conservati fino a diversi mesi a -20 ° C. </li><li> Rimuovere il metanolo con una pipetta di trasferimento e permeabilize campioni utilizzando Bleach di Dent (4 parti Metanolo, 1 parte di DMSO e 1 parte il 30% di H 2 O 2) per 2 ore. tessuto Hydrate in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 100% metanolo, 75% metanolo, 50% metanolo, 25% metanolo, 100% PBS. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente durante ogni fase di idratazione. </li><li> Tessuto Block in 0.5% reagente bloccante diluito in PBS (vedi Materiali particolari) per due ore a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Diluire anticorpo primario nel bloccaresoluzione (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubare campioni notte a 4 ° C. Lavare i campioni con PBS cinque volte a temperatura ambiente. Eseguire ogni lavaggio per 1 ora. </li><li> Applicare anticorpo secondario ad una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante 0,5%. selezionare con attenzione anticorpi secondari per evitare legame tra anticorpi secondari. Incubare per una notte a 4 ° C in camera oscura. Lavare i campioni tre volte per 20 minuti a temperatura ambiente. Disidratare campioni in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 25% metanolo, 50% metanolo 75% di metanolo, 100% metanolo, 10 min ogni passo. Nota: Assicurarsi che i campioni rimangono coperte con un foglio di alluminio e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. Tissue può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane fino fotografato. </li><li> Campioni di trasferimento a su ordine piastre di scena, rimuovere il metanolo e chiaro con circa 200 ml di soluzione chiara di Murray 19,20 (2 parti benzilico benzoato, 1 parte di alcool benzilico) immediatamente BEFl&#39;imaging minerale. Fotografia usando un microscopio confocale. Elaborare e analizzare immagine utilizzando il software di imaging. </li></ol> 4. proliferazione cellulare <ol><li> Iniettare E11.5 topi incinta intra-peritoneally con una soluzione di BrdU ad una concentrazione di 100 ug BrdU / g di peso corporeo. Sacrificio femminile come descritto nella sezione 1 del protocollo e isolare embrioni a E12.5 e E13.5. Usando lame di coltello, teste di consumo e la parte inferiore del corpo al di sotto della cavità toracica. </li><li> Mettere il tessuto toracico in 4 ml di vite fiale tappo e fissare in 1 ml di PFA 4% durante la notte. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 min e disidratano campioni attraverso una serie di etanolo diluito in acqua distillata fino al 70% di etanolo come segue: 30%, 50% e 70% di etanolo, per 5 minuti ogni passo. <ol><li> I campioni di medie dimensioni dello schermo cassette. tessuti Processo per incorporamento di paraffina utilizzo e il processore automatizzato. Impostare un ciclo come segue: sei cambi di alcol per 8 minuti ciascuno, tre cambi di xilene per 6 minuti ciascuno, tre cHANGES di paraffina, per 25 minuti, 9 min e 8 min. </li></ol></li><li> Incorpora in paraffina orientare il tessuto nella posizione desiderata per generare 6 trasversali micron o sezioni longitudinali, come descritto nella sezione 1. Posizionare sezioni su vetrini e consentire il tessuto di aderire a scivolare sulla slitta insieme più calda a 42 ° C per 1 ora. </li><li> scivoli cuocere, su un fianco, durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack di plastica. scivoli Sparaffinare per immersione in tre cambi di 100% xilene, 10 min a cambio. Utilizzare 200 ml di xilene per sommergere completamente diapositive. Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 min per passo con agitazione) di PBS (5 min). </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene utilizzando 10 mM tampone citrato, pH 6. Per preparare 100 ml di miscela di tampone citrato 18 ml di 0,1 M di acido citrico monoidrato e 82 ml di 0,1 M citrato di sodio. <ol><li> I campioni in vasi Coplin di plastica pieni di soluzione di antigene recupero e forno a microonde per 6,5 minuti ad alta potenza. Aggiungere disacqua distillata a vaschetta Coplin per compensare evaporata-citrato buffer e riscaldare alla potenza del 40% per 6 min. </li><li> Riempire vaschetta Coplin verso l&#39;alto con l&#39;acqua, e riscaldare di nuovo al potere il 40% per 6 min. volte a microonde possono variare in base a microonde utilizzata. </li><li> Lasciare vetrini raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente prima vetrini lavaggio in acqua distillata per 1 min, seguito da PBS per 5 min. Dopo il PBS lavare, vetrini blocco per 2 ore in una soluzione bloccante contenente TBS (2.425 g di Tris base e 8,765 g di NaCl diluito in 1 L di acqua distillata) 10% di siero asino e 1% BSA. </li></ol></li><li> Aggiungere anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante (TBS contenente 10% di siero Ciuchino e 1% BSA). BrdU (marcatore mitosi), Nkx2.1 (epitelio delle vie respiratorie), Sox9 (cellule che daranno luogo alla cartilagine) e αSMA (cellule muscolari lisce). Incubare i vetrini durante la notte, a 4 ° C. Utilizzare il metodo di sovrapposizione per conservare gli anticorpi. Applicare 180 ml di anticorpi di una guarnizione e quindi collegare slitta come se la copertura antiscivoloping. </li><li> Staccare la guarnizione immergendo i vetrini in acqua distillata. Dopo la rimozione della guarnizione, lavare anticorpo primario non legato eseguendo sei 5 min lavaggi con TBS contenente 0,1% Tween-20. <ol><li> Incubare i vetrini con anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante alla diluizione di 1: 200, per 1 ora a temperatura ambiente. Selezionare accuratamente anticorpi secondari per evitare indesiderate legame tra di loro. Rimuovere l&#39;anticorpo secondario non legato eseguendo tre a cinque lavaggi minuti con TBS contenente 0,1% di Tween. </li><li> Lavare i vetrini in 0,1 M di base Tris due volte per 5 minuti e poi 0,05 di base M Tris due volte per 5 min. I vetrini possono essere lasciato in 0,05 di base M Tris mentre coversliping utilizzo dei supporti di montaggio con o senza DAPI (1,5 mg / ml). Conservare i vetrini nella cartella di diapositive a 4 ° C e al riparo dalla luce coprendo cartella con un foglio di alluminio. </li></ol></li><li> Visualizza colorazione e fotografia utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato. Contare etichettati cellule e cellule totali per campo fotografato al20X e 40X per determinare i rapporti di cellule proliferanti di cellule totali. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C/PDGFR+pathway.">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li><li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis.">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li></ol>

&quot;Gli autori non hanno nulla da rivelare.&quot;

Eventi sottostanti morfogenesi del tratto respiratorio sono state comprese, in particolare i processi necessari per il patterning delle vie aeree di conduzione. Studi precedenti hanno utilizzato ex vivo le tecniche di cui espianti in via di sviluppo sono coltivate all&#39;interfase aria-liquido o incorporato in matrigel 21,22. Questi studi hanno dimostrato come fattori di crescita influenzano il patterning della trachea sviluppo e la formazione di tracheale cartilagine. Una limitazione a questi studi...

Lo sviluppo delle vie respiratorie è avviata da embrionali giorno 9 (E9) con la comparsa di cellule positive Nkx2.1 nel endodermico ventrale foregut 1,2. Esofago-tracheale separazione tubo si risolverà da E11.5 quando i tubi possono essere distinte come entità distinte, ognuna circondata dal tessuto mesenchimale 3. Wnt svolge un ruolo chiave nella specifica delle vie respiratorie come l&#39;eliminazione di Wnt2 e Wnt2b, espressa dal mesenchima splancnico e la cancellazione di β-catenina dal epitelio respiratorio endodermico si tradurrà in agenesia del polmone 4,5. I nostri studi precedenti hanno stabilito che la cancellazione di WLS, un recettore carico mediazione secrezione di tutti i ligandi Wnt, dai risultati del tratto respiratorio endodermico a ipoplasia polmonare, difetti di sviluppo vascolare polmonare e mis-patterning del tracheale mesenchima 6,7. Questi dati supportano l&#39;importanza del cro epitelio-mesenchimaless parlare nel differenziamento cellulare e specifica, come è stato mostrato anche in altri studi 8,9. Lo studio delle prime fasi di sviluppo del polmone si basa su genetica, in vitro ed ex vivo tecniche che hanno permesso di comprendere meglio i meccanismi di guida identità respiratoria 10-16. Intere culture espianto polmone all&#39;interfase liquido dell&#39;aria sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di fattori di crescita nelle prime fasi di polmonare branching morfogenesi 10,17,18. Mentre questo metodo è usato come lettura dei cambiamenti morfologici, come morfogenesi di ramificazione, e la modulazione dell&#39;espressione genica, è limitato allo studio delle prime fasi del processo di sviluppo, la cultura stessa non supporta lo sviluppo di vascolarizzazione 17. Sviluppo di tracheale cartilagine richiede tempi di incubazione più lunghi che possono essere non compatibili con questa tecnica di coltura. per Analyze il ruolo di segnalazione Wnt durante la formazione del tratto respiratorio, abbiamo adattato le tecniche standard per soddisfare le esigenze dei nostri studi embrionali. Abbiamo modificato i volumi, i tempi di colorazione, trattamento ciclismo per paraffina e la tempistica per la compensazione del tessuto tracheale-polmonare. L&#39;obiettivo principale di ottimizzare le tecniche descritte nel presente studio è stato quello di analizzare le prime fasi di sviluppo tracheale nei topi che si svolgono da E11 a E14.5. Utilizzando il topo giornalista linea Axin2LacZ noi siti precisamente determinati di attività / β-catenina Wnt in via di sviluppo mesenchima tracheale. Abbiamo anche adattato procedura di colorazione lectina per tutto il tessuto tracheale monte. Così, siamo stati in grado di visualizzare condensazioni mesenchimali e prevedere siti dove chondrogenesis avrà luogo. La colorazione di tutto il monte e sezioni di tessuto embrionale ottenuti da topi WlsShhCre, insieme con tecniche di microscopia avanzate, ci ha permesso di svelare il ruolo di ligandi Wnt prodotte dal TRAepitelio endotracheale nella trachea patterning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>1:400 , rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-20095</td>
			<td>1:50, rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5228</td>
			<td>1:2k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:100, guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:400, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB1893</td>
			<td>1:200, sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-32323</td>
			<td>1:4k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 7381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Alexa fluor Molecular probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaDOC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>89905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP4O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher brand super-frost plus</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11K413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Component of TSA kit #2&#160;&#160;&#160; ( T20932)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrDu</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C-0250-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy cassettes</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>BC0109</td>
			<td>Available in different colors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red&#160; Kernechtrot 0.1%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4641-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>399000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro knives</td>
			<td>FST</td>
			<td>10318-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 ceramic coated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5CO</td>
			<td>FST</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon i90</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Wide field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonA1Rsi</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MS 16 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaging processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

attività / β-catenina Wnt Tutta la colorazione monte Lac-Z è stato rilevato nel tessuto tracheale-polmonare di embrioni isolati da giornalista Axin2 Lac Z topi 11. Siti di colorazione indicano l&#39;attività / β-catenina Wnt. Analisi di sezioni di montare tutto colorazione determinato che Wnt attività / β-catenina era presente nel mesenchima della trachea e mesenchima delle regi...

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

L&#39;uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l&#39;analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all&#39;analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale.

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K Views.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  L'uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l'analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all'analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale. 

Video: Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

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Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso