このプロトコルは、関心のある任意の細胞集団におけるパラクリン非標準的なWntシグナル伝達を機能的および分子的に評価するための再現性の高い方法を概説しています。機能評価および分子評価は同じ細胞集団で行われ、Wnt/PCP経路の任意の成分の研究に適用できます。まず、以前にペレット化したC2C12細胞を10ミリリットルのC2C12培地に再懸濁します。
細胞を1:20の比率で希釈するには、9.5ミリリットルの新鮮なC2C12培地を含む15ミリリットルのチューブに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を加え、P1000ピペットを使用して血清学的ピペットと穏やかに混合し、1ミリリットルの希釈細胞懸濁液を新しい4チャンバーウェルの各ウェルに加え、インキュベーターに入れます。O9-1細胞インサートをプレーティングするには、O9-1細胞ペレットを10ミリリットルのO9-1増殖培地に再懸濁します。また、C2C12細胞希釈と同様に、O9-1細胞を1:20の比率で希釈します。
次に、1ミリリットルのO9-1増殖培地で満たされた新しい4つのチャンバーウェルの各ウェル内に単一の透過性インサートを配置します。300マイクロリットルの希釈したO9-1細胞懸濁液を各インサートに加え、インサートが完全に水没していることを確認します。それから摂氏37度で井戸をインキュベートします。
O9-1細胞でsiRNAノックダウンを行うには、siRNAとトランスフェクション試薬を還元血清培地でメーカーの推奨に従って所望の濃度に希釈します。希釈したsiRNAとトランスフェクション試薬を穏やかに混合し、室温で7分間インキュベートします。18〜24時間の細胞プレーティング後、siRNA脂質複合体をO9-1細胞インサートに追加し、約34〜48時間インキュベートします。
細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、C2C12チャンバーから培地をよく取り出し、PBSで細胞を1回洗浄します。PBSを除去した後、滅菌P10ピペットチップを一方向にしっかりと通過させて、細胞単層の全長または幅にまたがることにより、細胞を引っ掻き始めます。細胞に傷がついたら、すぐに1ミリリットルのPBSを加えます。
次に、コンピューターと顕微鏡の電源を入れます。チャンバースライドをステージに置き、対物レンズダイヤルを5倍の倍率に回転させます。イメージングソフトウェアを開きます。
カメラタブをクリックし、ライブボタンをクリックして、AxioCam ICタブのセルを視覚化します。光フィルターが完全に引き出されていることを確認して、光がカメラとコンピューター画面を通過できるようにし、チャンバースライドを手動で移動または回転させて、AxioCam ICタブのライブ画像の中央に創傷領域を配置します。画像を撮影するには、[スナップ]をクリックして、画像を含むAxioCam ICタブの横に新しいタブを開きます。
この静止画を保存するには、ファイルをクリックして[名前を付けて保存]を選択し、左側のバーで[デスクトップ]を選択してファイルをデスクトップに保存し、ファイル名ボックスにファイル名を入力して、図をcziファイル形式で保存します。画像を tiff として保存するには、[ファイル] をクリックし、[名前を付けて保存] を選択して、[ファイル名] ボックスにファイル名を入力します。[ファイルの種類]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューからtiffを選択します。
チャンバースライドを手動で再配置して、同じウェル内の創傷の他のポイントでさらに2〜3枚の画像を撮影します。イメージング後、各ウェルからPBSを取り出し、1ミリリットルのC2C12培地を加えます。O9-1細胞を含むインサートをチャンバーウェルの各ウェルに手動で配置して、ウェルインサート共培養システムを組み立てます。
インサートの底部が下にあるC2C12セルのすぐ上になるように、インサートをウェルにゆっくりと押し下げます。ウェルインサートコンストラクトをインキュベーターに戻し、細胞を合計9〜12時間遊走させます。最適な移動時間を決定するには、創傷作成後6時間で細胞をチェックし、その後2〜3時間ごとに細胞を確認します。
対照条件の細胞が創傷を完全に覆ったら実験を終了する。遊走アッセイの終了を開始し、遊走期間の9〜12時間後にO9-1細胞インサートを取り外してウェルインサートシステムの解体を開始します。C2C12培地を注意深く吸引します。
チャンバーウェルに0.5ミリリットルのPBSを加え、遊走後の細胞の最終画像を撮影します。培地と混合したすべてのPBSを注意深く吸引し、キットの指示に従ってチャンバーウェルからプラスチックチャンバーを取り外します。C2C12 セルを含む下にあるスライドを残します。
免疫染色の場合は、直ちにスライドを4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間インキュベートします。次に、パラホルムアルデヒドを除去し、スライドをPBSTを含む0.1%Triton X-100で室温で15分間洗浄します。15分後、PBSTを注ぎ、スライドをPBSでそれぞれ10分間2回洗浄します。
次に、スライドの周りに疎水性ペンで疎水性境界を作成し、スライドから溶液がこぼれるのを防ぎ、接着細胞の破壊を防ぎます。次に、疎水性境界内のスライドに約0.5ミリリットルの1%BSAブロッキング溶液を加え、加湿したスライドチャンバー内で室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、ブロッキング溶液を除去し、疎水性境界内のこのスライドにファロイジン抗体を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、光にさらされないように保護されたスライドホルダーにスライドを置きます。細胞をPBSで室温でそれぞれ10分間3回洗浄する。DAPI含有封入剤を追加し、スライドをガラスカバースリップでマウントし、標準の蛍光顕微鏡を使用して細胞をキャプチャします。
本研究では、組換えWnt5aを共培養ウェルに添加すると、筋芽細胞遊走が加速し、一部の領域が完全に9時間回復しました。3つの条件すべてにおいて、遊走筋芽細胞は、整形式および突出した糸状突起およびラメリポディアおよびアクチン細胞骨格突起の非対称分極を含む正常な遊走細胞形態を示した。NCC由来のWnt5aの筋芽細胞遊走に対するパラクリン効果を研究した。
Wnt5aに対する50ナノモルsiRNAによる処理は、陰性対照と比較してWnt5a遺伝子発現を64%減少させた。NCCのWnt5aノックダウン後に有意に減少したC2C12マイルブラストの移動と外因性組換えWnt5aの追加により、これらの筋芽細胞におけるこの移動性欠損と形態学的欠陥が救済されました。パラクリンモデルにおけるシグナル受信細胞メカニズムをよりよく理解するために、ROR2受容体がノックダウンされ、遺伝子発現が54%減少しました筋芽細胞におけるROR2のノックダウンは、NCCの存在にもかかわらず、それらの遊走能力を低下させます。
外因性組換えWnt5aは、ROR2ノックダウン後の筋芽細胞遊走を救出できず、ROR2の枯渇が筋芽細胞がWnt5aシグナルを受信する能力を破壊することを示唆しています。P10チップで引っ掻いて適切な密度に細胞を一度だけ培養し、下にある細胞を破壊することなく注意して組み立てられていない共培養システム。この手法は、神経堤細胞および第二心野生物学に関連する複雑なWnt / PCP経路内の特定の分子シグナル伝達軸を研究するための概念実証として使用されました。
