私たちは親切に、それぞれ、抗Sox3および抗MYT1抗体を提供するためにコロラド大学ボールダー校教授マイケルKlymkowskyとマンチェスター大学で教授ナンシーPapalopuluに感謝します。私たちは、このプロトコルを開発する上で彼らの洞察に満ちた提案をPapalopuluラボのメンバーに感謝します。この作品は、SZとJLには、2つのヒーリング財団Studentships、そ​​れぞれヒーリング財団からSZ / EAおよびJL / EAへの2つのプロジェクト助成金、EAへのウェルカムトラストから一つのプログラムの助成金（WT082450MA）、および1制度の戦略的支援の助成金によってサポートされていましたウェルカム・トラスト[097820 / Z / 11 / Z]から。

<ol>
	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain.">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise.">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus.">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li><li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4.">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li><li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsoventral+patterning+in+Xenopus:+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4.">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li><li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4.">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li><li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages.">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li><li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives.">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li><li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/VegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation.">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li><li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis.">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li><li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors.">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li><li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop.">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt/beta-catenin+signalling+during+forebrain+development.">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469 (2013).</li><li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+(FISH)+on+whole+mounts+and+sections.">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li><li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+in+living+embryos.">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo.">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、 アフリカツメガエル胚における一次神経新生を可視化するための便利で効率的な方法を示しています。この方法は、細胞型特異的マーカーを用いて、神経幹細胞および分化した初代ニューロンを含む神経細胞の異なる種類の評価を可能にします。 プロトコルは、再現性の非常に高いレベルで一般的に堅牢です。前孵化段階にある胚（ すなわち 、最大28のステージに）、これは胚が完全に固定する前に、真っすぐになることができますように、我々は手動で固定前に卵黄膜を除去することをお勧めします。 （孵化する前に）比較的早い段階で胚を収集する際に曲がった胚が装着室内部に所望の向きに配置することが極めて困難であるため、これは特に重要です。 MEMFAまたはPFA固定、したがって、追加の抗原回復ステップは、このプロトコルには必要ありません後に我々は、免疫原性の損失を経験していません。また、この免疫染色の手順は、in situハイブリダイゼーション発色/蛍光からのサンプルで実施することができます。このようなシナリオでは、in situハイブリダイゼーションプロトコルの間にプロテアーゼK処理工程を省略することをお勧めします。蛍光/発色基質反応の後、試料を、TBSで洗浄することができ、MEMFA / PFA固定したサンプルと同様に魚ゼラチン溶液に包埋しました。蛍光in situハイブリダイゼーションは、後免疫蛍光染色と一緒に画像化される場合、サンプルバイアルをアルミホイルでバイアルを包むことによって光から保護することができます。 いくつかのケースでは、胚は、ゼラチン浸透後過度に収縮することができます。これは、おそらくどちらかが不十分な固定または不十分なTBS-トリトン抽出によって引き起こされます。胚は4℃で少なくとも2〜3時間、好ましくは一晩PFA / MEMFAで修正されていることを確認してください。問題が解決しない場合は、1時間、3にTBS-トリトンの洗浄時間を増加させます。 クライオ切断面の間に魚ゼラチンの異なるバッチは、異なる特性を有するように寧、サンプルブロックの剛性が変化してもよいです。この問題は、部分的にミクロトームの温度を調整することによって補償することができます。より低い温度は、サンプルブロックがセクションにくっきりと困難になるしかし、過度の低温下で「硬い」のサンプルブロックになります。各切片の前に（胚なしモックサンプルブロックを使用して）いくつかの微調整や練習は、特に貴重なサンプルを上の使用前に有益であり得ます。 切片中に一般的に遭遇する問題は、時々厚のガラス板上に固執するのではなくスチールステージ上に平らに滞在する傾向が薄い部分です。これは、常に連続的な切削プロセスを中断するので、特に破壊することができます。セクション室と（特に）厚のガラス板が機械およびoに十分な寒さ、または過度の静電気されていない。このような例は、通常、二つの理由のいずれかによって引き起こされます特に乾燥した天候でperator、。前者はセクション室の温度を下げ、余分な時間（おそらく一晩）内のガラス板を残すことによって解決することができます。かつ適切クライオスタットを接地することにより、後者。金属タップまたは金属製の同様の水配管システムにクライオスタットの金属面に接続すると、静電気を放出するための代替方法することができます。各使用後、厚いガラス板は、（そのような食器用洗剤など）、非腐食性の洗剤でよく洗浄しなければならない超純水によりリンスし、純粋なエタノールを噴霧し、損傷から表面及びエッジを保護するためにタオル紙に包まれました。 プロトコルに記載された抗体は、一般的に特異的であり、我々はほとんど非特異的吸着または高いバックグラウンドシグナルが発生しません。すべき（血清中のふわふわ沈殿の形成により可視化）、ブロッキング剤としての過度の熱不活性化を熱不活性化ヤギ/子羊血清を使用している場合、ことに留意すべきですこの沈殿剤は、二次抗体に非常に魅力的であり、高いバックグラウンドのソースに貢献するかもしれないとして避けるこ​​と。 ことが可能であり、時には同時に神経細胞の異なる集団を可視化するために二重染色を行うために、所望します。このような二重染色が可能であり、一般的に以下の組み合わせで満足のいく結果が得られます。Sox3 / N-浴槽またはMYT1 / N-浴槽。しかし、Sox3およびMYT1の二重染色は、2つの抗体がウサギの起源からの両方であるという事実によって複雑になります。私たちは、おそらく二次抗体からの信号増幅の不足のために、しかし、満足な結果が観察されなかったいくつかの抗体の直接標識キットを、（低信号対雑音レベル）を試験しています。この問題を回避する1つの可能なアプローチは、以下に説明するように、 アフリカツメガエルにおけるトランスジェニック系統を上げることです。 このプロトコルの主な制限の一つは、このプロトコルは十分にディできるが、ということです神経細胞のstinguish二つの主なプールは、すなわち、Sox3を発現する神経幹細胞プール及びMYT1発現する分化した神経細胞は、分化した神経細胞の異なる亜集団を明らかにする能力を欠きます。含む、しかし、一次運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンに限定されるものではなく、そのようなサブ集団は、通常、それらの差次的に発現マーカー遺伝子28-30によって特徴付けられます。上記のように、 アフリカツメガエル胚における抗体ベースの免疫蛍光検出方法と組み合わせてin situハイブリダイゼーション多色の開発における最近の進歩は、潜在的な調査31分化したニューロンのこれらのサブ集団を明らかにするためにギャップを埋めることができます。あるいは、マウスモデルで実証されているように、また、アフリカツメガエルにおいて、異なる細胞集団を区別するために細胞型特異的抗体のより包括的なセットを高めることが望ましいであろう。 それはこのメソッドへの追加として、そのような多光子顕微鏡、3D再構成、およびセグメンテーションなどの光学イメージングおよび画像解析の最近の進歩は、また、 アフリカツメガエル卵母細胞のより包括的な観測を実現するだけでなく、ために初期評価の後に適用することができる、ことを言及も価値があります特に32,33を設定するライブ下の初期胚、。したがって、増殖、分化、および生きた動物における神経細胞の移動を追跡するためには、初期のアフリカツメガエルにおけるこのような細胞集団の生の観察を可能にするために細胞型特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を保有一つ以上のトランスジェニック系統を確立することが望まれるであろう胚。 X.の確立tauGFPとそのアプリケーションを駆動する神経特異的βチューブリンプロモーターとツメガエルのラインが良い例23,34を提供してきました。脊椎動物35-37を特徴sox3とMYT1の両方の完全なプロモーター配列と、それはshのですアフリカツメガエルのコミュニティと一次神経形成研究のより一般的なフィールドの両方に広く貢献すべきであるアフリカツメガエルにおける追加のトランスジェニック系統を確立することは比較的容易であることウルド。

脊椎動物では、中枢神経系の開発は、いくつかの独特まだ連続した段階を含みます。最初のステップは、ナイーブ外胚葉細胞は、神経運命ではなく、表皮の運命に向かって指定されている神経誘導、です。いくつかの相互接続さ調節機構は、 アフリカツメガエルおよび他のモデル系1,2のこの段階の間に関与しています。このプロセスは、主に、コーディン、ノギンおよびフォリスタチン3-7として基本となる中胚葉によって産生される分泌因子によって調整されています。神経誘導した後、神経前駆細胞のサブセットは、細胞周期を終了し、一次神経新生と呼ばれるプロセスで分化し始めます。すべての神経前駆体は、この時点では区別されません。残りの神経前駆細胞は、それによって開発を通して、および成人期に中枢神経系の継続的な成長のために必要な幹細胞のプールを維持し、増殖し続けます。 これらの広報神経前駆細胞をoliferatingはSRY（性決定領域Y）-box 3（sox3）遺伝子8-11の発現によって特徴付けられます。細胞の他の集団、出口細胞周期および分化した運命にコミットするには、分化の遺伝子マーカー、 チューブリン、ベータ2BクラスのIIb（tubb2b、N- 浴槽 ）とミエリン転写因子1（MYT1）の発現により同定されます12-14。このような分化した神経細胞は、最終的には神経管15-17内の異なる領域に位置し、モーター、間、および感覚ニューロンを含むがこれらに限定され、ではないが、ニューロンの異なるカテゴリを生じます。 かなりの努力が前方神経外胚葉でイベントを決定するパターニングと運命を支配する調節機構を解明することに専念してきたが、あまり注目は、以下の発生神経性のイベントを調査してなされたものです初期のパターニング段階。実際に、シグナル伝達、転写の規制だけでなく、翻訳後修飾は、すべての神経新生18-20中の両方のタイミングおよび系統仕様を制御し、この後の段階に関与しています。これらのメカニズムへのさらなる調査が簡単に視覚化し、神経細胞の異なる集団を区別するために信頼性の高い方法を必要とします。 、Sox3、MYT1、及びN-タブを含む上記神経マーカーは、従って、神経分化21-23の基礎となるメカニズムを明らかにするために必要な基礎を提供し、これらの異なる細胞集団を同定するための手段を提供することができます。 神経細胞集団の特異的標識は、他のモデル生物で実証されているが、比較的少数の研究は、この点において最大限にアフリカツメガエル系を利用しています。これは主に、確実に、様々なneurを識別互換性のある抗体の不足に起因しています神経管でonal細胞集団。ここでは、 アフリカツメガエルにおける一次神経発生を調査するための堅牢かつ便利な手法を提供する免疫染色を介して初期のアフリカツメガエル胚で神経分化を可視化する方法について説明します。このプロトコルは、ステージ26とステージ45との間にアフリカツメガエルの中枢神経系の早期開発に興味を持って研究者のための十分な指針を与える必要があります。

<table><tbody><tr><td>gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium (OCT)</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;85-90 &amp;deg;C Heat block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Acetone, analytical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staining jar with slide racks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-acetylated tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;488 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;555 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 Phalloidin</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

代表的な結果は、異なる抗体（ 図4）で染色し、異なるレベル、すなわち前脳、中脳、後脳、脊髄、でステージ30 アフリカツメガエル胚の断面を示しています。前述したように、分化した初代神経細胞が外側に移動して、神経管の限界層（基底層）の近くに見つけMYT1標識ながら、神経前駆細胞集団は、神経管の内腔の近くに位置しSox3標識。抗アセチル - チューブリンは、全体の神経管の中に観察することができる分化したニューロンにおける軸索を、ラベルを付けます。 側特異的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現は、特定の遺伝子の発現を調節する神経細胞の成長および分化を妨害するかどうかを評価するための神経生物学で広く使用される方法です。このような場合には、モルホリノ（MOS）またはDNA構築物（単数または複数）のいずれかのプロ搬送します<html> moter駆動型遺伝子は、2細胞期23における2つの割球の中に注入されます。あるいは、それらは、ノックダウンまたは過剰発現所望の遺伝子（単数または複数）27の結果となる電気穿孔に続く脳室に注入することができます。どちらの場合も、効果は、未処理の内部コントロールとして、胚の反対側を作り、胚の片側に制限さ​​れます。 固定、切片、および免疫染色した後、遺伝子ノックダウン/過剰発現の影響をカウントし、胚の両側に異なる集団の細胞数を比較することによって定量化されます。いくつかの胚からこれらのデータを蓄積し、統計分析を行うことができます。当社の代表的な結果では、何の摂動は、胚では行いませんでした。遺伝子摂動と異なる神経細胞集団に対する効果の例は、参考文献20,23に記載されています。 トン &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> 図1：セクションの金型における胚の配置及び向き （A）取り付けアセンブリを示す漫画の描写は、トレイは、日付、ステージ、および胚の向きで標識されています注意してください。 （B）取り付けアセンブリの自然な外観を示すイメージ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> 図2：サンプルの保持ディスク上のゼラチンブロックの向きや位置 （A）節ブロックアセンブリを示す漫画の描写、胚は「ヘッドアップ」位置とゼラチンブロックがしっかりと固定されているOであることに注意してください。ベースで組織凍結培地による試料保持ディスクNTO（図2B参照）。 （B）節ブロックアセンブリの自然な外観を示す画像は、ゼラチンブロックと試料保持ディスクとの間の組織凍結培地の蓄積に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> 図3：セクション室の連続切片 （A）のモデル。サンプル保持ディスクは、胚側が上を向いている位置に回転し、固定してください。数（6-10）のセクションの後、連続するセクションのタイルの長いストリップを穏やかに細かいブラシを使用してブレード（青）から分離され、その後、保持板上に90°回転しました。その後、室内温度正に帯電したスライドですしっかりと下に向けセクションストリップに押し付け、すぐに集め、完成ストリップまで上昇。 （b）に示すように、通常は、各スライドは、ストリップの2本の平行線を収容することができます。鉛筆を使用して、スライドラベルに詳細な記録を作成することを忘れないでください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> 図4：ステージ30 X のクロスセクション 神経組織、20Xにオタマジャクシと染色を ツメガエル 。 アフリカツメガエルのオタマジャクシのセクション平面の相対的な位置（前脳、中脳、後脳、脊髄）を示す（A）回路図。 （B）抗Sox3（赤）で染色した断面を対応する、抗アセチル化チューブリン（グリーn）とDAPI（青）、相対的な神経幹細胞プールの位置ならびに神経管内ニューロフィラメントを示します。神経管中で分化した初代ニューロンの相対的な位置を示す抗MYT1（赤）およびDAPI（青）で染色した断面を、対応する（C）。スケールバー=20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K ビュー.  University of Manchester. この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。 

ビデオ: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

神経科学

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

発生生物学

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The immunodetection of thymidine analogs (such as 5-Bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU)) is a standard technique used for visualizing these newly generated cells. Therefore, BrdU is usually injected in small animals intraperitoneally, so the thymidine analog gets incorporated into dividing cells during DNA synthesis. Detection is performed by immunohistochemical analysis of brain slices. Every research group that has been using this technique can appreciate that it requires special attention to minute details to achieve a successful stain. For instance, an important step is DNA denaturation with HCl, which allows it to reach the cell nucleus to stain it. However, the existing scientific reports describe very few of such steps in detail. Therefore, standardizing the technique is challenging for new laboratories as it can take several months to yield positive and successful outcomes. The purpose of this work is to describe and elaborate the steps to obtain positive and successful outcomes of the immunostaining technique in detail when working with the thymidine analog BrdU. The protocol includes the reagent preparation and setup, administration of thymidine analog in a rodent, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, use of avidin-biotin complex, immunofluorescence, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

This paper presents four of the most common techniques for visualizing BrdU positive cells to measure adult neurogenesis in rats. This work includes instructions for reagent preparation, thymidine analog administration, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, immunofluorescence, signal amplification, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

チミジン類似体BrdUを用いたラットの細胞増殖と神経新生を解析するための免疫組織化学技術

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

生物学

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

	...

でプライマリ神経発生を評価します

要約

さらに動画を探す

この動画の章