우리는 친절 각각 반 Sox3 및 안티 Myt1 항체를 제공하기 위해 맨체스터 대학에서 볼더의 콜로라도 대학에서 교수 마이클 Klymkowsky 교수 낸시 Papalopulu 감사합니다. 우리는이 프로토콜을 개발하는 그들의 통찰력 제안에 대한 Papalopulu 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 SZ 및 JL 두 가지 치유 재단 Studentships에 의해 지원되었으며, SZ / EA 각각 JL / EA, EA의 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) (WT082450MA)에서 하나의 프로그램 보조금을 치유 재단, 한 기관의 전략적 지원 보조금에서이 프로젝트 보​​조금 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) [097820 / Z / 11 / Z]에서.

모든 동물 실험은 맨체스터 동물 복지 센터의 대학에서 승인하고 영국 홈 오피스 프로젝트 라이센스에 포함되었다. 1. 수집 및 고정 Xenopus의 배아의 <ol><li> 실험 시약 및 재료를 준비합니다. <ol><li> 최종 농도를 달성하기 위하여 10 배 마크의 변형 링거 (MMR), 1 M 황산, 1 M CaCl2를, 1 M HEPES pH가 7.4를 약 800 mL의 초순수에 염화나트륨 56.5 g을 용해시키고, 1 M의 KCl 스톡 용액을 첨가하여 준비 하는 20 mM의 KCl, 10 mM의 황산, 20 mM의 CaCl2를 50 mM의 HEPES 중. 10 M의 NaOH로 pH 7.4까지를 조정하고 1 L.로 최종 볼륨을 조절 </li><li> 액체 사이클 20 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균하여 10 배 MMR 솔루션을 소독. 사용시, 0.1X 최종 농도 DDH 2 O 희석 및 미생물의 성장을 억제하기 위해 20 ㎎ / ℓ의 겐타 마이신을 추가합니다. </li><li> 24g 트리스 -HCl, 5.6 g 트리스 B를 혼합하여 10 배 TBS 용액을ASE, 88g의 NaCl 및 약 900 ml의 초순수에 용해. 최종 용액은 약 7.6의 pH 값을 가질 것이다. 1 L.에 7.6의 최종 pH 및 최종 부피를 달성하기 위해 10 M 수산화 나트륨 또는 진한 염산 중 하나와 조정 </li><li> 사용시에, 초순수의 9 배 부품 TBS 용액 1 부를 희석 1X TBS를 만든다. </li><li> 20 mM의 EGTA, 10mM의 황산의 최종 농도를 달성하기 위해 0.5 M EGTA 및 1M 황산의 스톡 용액을 대략 800 mL의 초순수 209.2 g의 MOPS을 용해시키고 추가로 10 배 MEM 소금 있도록. 10 M의 NaOH로 pH 7.4까지를 조정하고 1 L.로 최종 볼륨을 조절 </li><li> 이 멸균 한 후, 용액을 실온에서 저장 수개월에 의해 황변이나 수 (액체 사이클에서 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이 빙하여 MEM 염 용액 살균하지만 색상의 변화는 그 사용에 영향을주지 않는다 ). 그러나, 장기간 보관 (6 개월 이상) 후 솔루션을 사용하지 마십시오. </li><li> 1 배 MEM 확인MEM 소금 1 부, (적어도 1-2주 4 ° C에서 안정의 v / V) 초순수의 8 부와 37 %의 포름 알데히드의 한 부분을 희석하여 FA 솔루션입니다. </li><li> 60 ° C에 1 배 TBS 솔루션 열 100 ml의 용액에 파라 포름 알데히드 분말 4g을 용해하여 (팔로이 딘을 포함하는 후속 염색) TBS에서 4 % 파라 포름 알데히드를 준비하고 용해 지원하기 위해 10 M NaOH를 몇 방울을 추가합니다. -20 ° C에서 5 ~ 10 ml의 볼륨과 동결에 나누어지는. 다시 동결하지 마십시오 한 번 해동. 주의 : 파라 포름 알데히드 분말을 자극하며, 따라서 계량 공정은 흄 후드에서 수행되어야하며, 흡입시 독성이다. </li><li> 컬렉션을 샘플링하기 전에 스크류 캡 많은 4 ml의 유리 병 레이블. </li><li> 50 mL의 원심 분리 튜브로 (50 ° C의 물 욕에서 예열) 40 % 어류 젤라틴 20 ㎖를 주입하여 15 % 젤라틴 / 15 % 수 크로즈를 준비한다. 자당의 8g을 추가하고 1 배의 TBS로 50 ㎖ 라인에 튜브를 입력합니다. </li><li> 회전 믹서 나 롤링 침대에 젤라틴 튜브를 배치밤새 실온에서 혼합한다. 이 젤라틴 용액 1 주일 동안 4 ° C에서 안정적입니다. 만료 된 솔루션을 사용하지 마십시오 동결 - 해동을하지 않습니다. </li></ol></li><li> 준비하고 X를 수정 laevis의 또는 X를 원하는 단계에 tropicalis 배아 배양. <ol><li> 기름지게 X. 문화 laevis의 또는 X를 tropicalis 원하는 단계까지 겐타 마이신과 0.1X의 MMR에서 배아. 참고 : 일반적으로, 단계 (40) 후 단계 (23)와 배아의 40 이후 수집 사이의 배아를 수집 척수에서 축삭의 성장을 관찰하지만, 추가 젤라틴 침투 시간이 요구 될 수 있음을 유의 특히, 수있다. 배아 야생형 유전자 돌연변이 일 수 있고, 처리 억제제, 모르 폴리 노 (MO)를 주사 하였을 또는 (23, 24)를 전기 천공. </li><li> 각 4 ㎖의 유리 병에 20-50 배아를 수집 가능한 한 많은 매체를 제거하고 MEMFA로 교체합니다. 참고 : 다음 염색 팔로이 딘을 포함하는 경우, 4 % 파라 포름 알데히드를 사용대신 MEMFA의 상용 공급 포름 알데히드 솔루션은 일반적으로 팔로이 딘 염색을 방해하는 안정제로 최대 10 % 메탄올을 포함입니다. </li><li> 실온에서 긴급에서 만약 회전 혼합기에서 2 시간 동안 4 ℃에서 밤새 또는 고정. 배아는 4 ° C에서 최소 1 주일 동안 고정 용액에서 안정 될 것입니다. </li><li> 정착 후, 0.05 % 트리톤 X-100, 1X TBS를 사용하여 20 분 동안 배아 3 회 세척 하였다. 최종 세척 후, 가능한 한 많은 TBS-트리톤을 제거하고 각각의 바이알에 15 % 젤라틴 / 15 % 수 크로스 용액 (3)을 추가한다. </li><li> 실온에서 밤새 침대 롤러에 튜브를 놓습니다. 단 40 세 이상 배아를 들어, 침투 시간이 최소 24 시간을 사용합니다. 침투 한 후, 다음 날 2.2 절에 바로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 설치 및 냉동 절편 Xenopus의 배아의 <ol><li> 실험 시약 및 재료를 준비합니다. <ol><li> 긍정적으로 charg 중 한 상자를 가지고에드는 이상적으로 개봉, 슬라이드. 참고 : 연 경우 (예 : 건조 박스 등) 마른 상태에서 슬라이드를 유지하고 슬라이드에 정전기가 유지되어 있는지 확인하려면 1 개월 이내에 사용한다. 샘플 면역 염색하는 동안 떨어질 때문에 만료 된 슬라이드를 사용하지 마십시오. </li><li> -30 ° C의 저온 유지 챔버를 사전 진정. 마이크로톰에 대한 -35 ° C와 12 μm의 단면 두께와 악기 매개 변수를 설정합니다. 무대에 두꺼운 커버 유리 판을 설치하고 섹션이 시작되기 전에 저온 유지 장치가 적어도 30 분 동안 평형 수 있습니다. </li><li> 섹션 스트립을 이동 페인트 브러시를 준비, 그라 이오 스탯 챔버 내부에 보관하십시오. </li><li> 슬라이드에 쓰기 위해 연필을 준비 실온에서 넣어. </li><li> 동결 절단 (Cryosections) 동안 장갑을 착용 할 것. 맨손을 사용하지 마십시오. </li></ol></li><li> Xenopus의 배아를 장착 <ol><li> 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 플라스틱이나 유리 피펫을 사용하여 유리 바이알 중 5 ~ 10 배아를 대기음. 에서 배아를 이동상기 챔버에 장착 입체경 하에서 관찰한다. 단면 블록의 강성을 보장하기 위해 젤라틴 용액 장착 챔버를 채운다. </li><li> 미세 팁 포셉 한 쌍을 사용하여 그림 1에 따라 배아를 정렬합니다. 극저온 호환 마커를 사용하여 상기 챔버의 테두리에 화살표를 그려서 헤드의 방향을 표시한다. 배아 여러 그룹뿐만 아니라 해당 챔버의 테두리에 각 그룹의 설명을 기록. </li><li> 조심스럽게 드라이 아이스와 반 가득 거품 상자에 가로 실을 배치하고 뚜껑을 닫습니다. 5 ~ 10 분에 장착 챔버 동결을 준수하십시오. 이 동결과 과밀되기 위해 드라이 아이스 상자를 방지하기 위해 각 챔버 충분한 시간을 떠날 것으로 (즉, 다음 단계로 진행하기 전에 드라이 아이스 위에 이전 실 배치) 직렬로 각 챔버를 처리합니다. 참고 : 냉동 장착 챔버가 수평으로 서 할 필요가 없습니다 및 상자 안에 쌓아 될 수있다. </li><li>필요한 경우, 면역 원성을 잃지 않고 적어도 1~2주을 위해 -80 ° C에서 냉동 샘플을 보관, 냉동 절편을 진행하거나. </li></ol></li><li> 마운트 Xenopus의 배아 동결 절단 (Cryosections) <ol><li> (예 연필) 무딘 막대기를 사용하여 상기 챔버의 바닥을 가압하여 챔버로부터 언 샘플 블록을 제거한다. </li><li> 샘플 유지 디스크에 조직 동결 매체의 몇 방울 (폴리에틸렌 글리콜, 폴리 비닐 알코올 함유 배지)를 추가하고 배아의 앞쪽 끝 샘플 블록을 탑재하는 것은 (그림 2)를 가리 킵니다. mounted- 블록은 약 1 분 동안 또는 조직 동결 매체가 불투명 될 때까지 저온 유지 챔버 내부에 서 있습니다. </li><li> 바로 위를 향 샘플 블록의 바닥면이 마이크로톰에 샘플 유지 디스크를 설치합니다. 샘플 블록은 여전히​​ 상대적으로 &quot;부드러운&quot;인 경우, 각 섹션의 길이를 줄이기 위해 블레이드를 사용하여 샘​​플 블록의 일부를 잘라내(경우 원하는). 온도가 평형에 도달 할 수 있도록 적어도 5 분 동안 마이크로톰에 샘플 유지 디스크를 남겨주세요. </li><li> 올챙이의 머리가 투명한 젤라틴을 통해 볼 수 있습니다 때까지 점차적으로 아래 샘플 블록을 잘라. 샘플 블록 샘플 유지 디스크에서 떨어질 수 있기 때문에 (예 : &quot;트림&quot;옵션을 사용하도록 설정 등)이 단계에서 섹션 두께 (예를 들어 20 ~ 25 μM)의 이상 (두꺼운) 설정을 적용, 속도를 트리밍 증가하지만 너무 두꺼운하려면 . 저온 유지 장치의 성능을 관찰 등이 단계에서 샤프니스 블레이드의 각도가 다음 섹션의 긴 스트립의 발생을 보장한다. </li><li> 올챙이 헤드가 볼 수있게되면, 페인트 브러시를 사용하여 다시 (예 : 10 ~ 12 μM) 정상 모두 마이크로톰 깨끗하고 무대에 저온 유지 장치의 설정을 조정합니다. 부드럽게 완성 된 조각이 캐릭터 라인을 형성 할 수 있는지 확인합니다 (모터 설정을 사용하지 않는) 핸드 휠 설정을 사용하여 시험으로 2 ~ 3 절을IPS는 중복 또는 블레​​이드에 집착하지. </li><li> 올챙이의 머리가 거의 노출 될 때까지 (이 경험하지만 달성을해야 할 수도 있습니다) 트리밍 계속합니다. 무대에서 어떤 남은 부분과 시작 샘플 섹션의 수집을 브러시. </li><li> 약 10 ~ 15 절을하고 긴 띠를 형성 할 수 있습니다. </li><li> 옆에 두꺼운 커버 유리 판을 뒤집어 부드럽게 잘 팁 페인트 브러시를 사용하여 블레이드에서 스트립을 제거하고 잎에 긴 축에 평행으로 무대를 준비. </li><li> 실온에서 한 양으로 하전 된 슬라이드를 선택 (이후의 염색 처리하는 동안 씻어되지 않습니다) 연필로 레이블을 눌러 그것을 빨리 단단히 라벨면을 아래로 향하게 스트립에와 저온 유지 챔버에서 슬라이드를 제거합니다. 제대로하면 스트립은 즉시 양으로 대전 된 슬라이드 (그림 3A)에 충실해야합니다. </li><li> 각 슬라이드에 20 ~ 30 조각을이 단계를 반복하여전자 및 병렬 (그림 3B)에 배치. 이것은 X. 전체 뇌 영역을 커버하기에 충분 tropicalis 배아와 X의 전뇌의 대부분 중뇌 지역 배아를 laevis의. </li><li> 10 분 동안 슬라이드를 공기 - 건조 바로 진행하거나, 면역 원성을 잃지 않고 적어도 3~6개월을 위해 -80 ° C에서 슬라이드 박스에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 단면 Xenopus의 배아 3. 면역 염색 <ol><li> 실험 시약 및 재료를 준비합니다. <ol><li> 0.05 %의 최종 농도를 달성하기 위해 1X TBS로 트리톤 X-100을 첨가하여 0.05 % TBS-트리톤 X-100을 준비한다. 이 솔루션 3 ~ 4 일 동안 실온에서 안정하다. 만료 된 솔루션을 사용하지 마십시오. </li><li> 버퍼를 차단으로 TBST 5 % 열 불 활성화 염소 혈청 또는 5 % BSA를 준비합니다. 첫째, 30 ~ 60 분 동안 65 ℃로 물을 욕조에 약 20 ~ 30 ㎖의 혈청을 배치하여 염소 / 양고기 혈청을 열 비활성화. 1.5 ml의 원심 분리기로 나누어지는튜브 및 -20 ° C에서 동결. 아니 다시 불 활성화는 사용에 필요하지 않습니다. </li><li> 사용 전에 5 %의 최종 농도를 달성하는 TBST에 열 불 활성화 된 혈청 또는 BSA 희석. </li><li> (500 항 Sox3 10.25 / 1 : 250 안티 Myt1 26 / 안티 - 아세틸 화 튜 불린 예 1) 버퍼를 차단에 희석에 따라 적절한 일차 항체를 준비합니다. 각 슬라이드에 항체 용액의 약 100 μl를 사용합니다. </li><li> 버퍼 (500 일반적으로 1)를 차단하는 적절한 형광 항체 (예, 항 - 마우스 / 토끼 적색 형광 염료 복합 항체)를 준비한다. </li><li> 액틴 네트워크를 나타 내기 위해 차 항체 믹스에 : (선택 사항) 적색 형광 염료 복합 Phalloidin의 (500 일)를 추가합니다. </li><li> (선택 사항) 핵 지역화를 시각화 차 항체 믹스에 DAPI (0.5 μg의 / ml의 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 냉장고에서 안티 - 페이드 장착 매체를 타고 상온의 물을 욕조에 녹여. </li></ol></li><li> 면역 염색 <ol><li> -80 ° C에서 냉동 슬라이드를 제거하고 적어도 1 시간은 다음과 85-90 ° C 열 블록에 건조 된 슬라이드를 구워, 어떤 응축 된 물방울을 제거하기위한 환기 후드 내부에 수건 종이에 배치 15 분 동안이 위를 향하도록 슬라이스 접착 메커니즘을 활성화합니다. 마지막으로, 슬라이드를 실온으로 (적어도 10 분)를 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 순수한 아세톤으로 염색 항아리 채우기와 생선 젤라틴을 제거하는 10 분 동안 아세톤 슬라이드를 품어. 여러 슬라이드가 처리 될 경우 염색 랙으로 배열. 환기 후드에서 15 분 동안 처리-슬라이드를 공기 - 건조. 하지 마십시오 아세톤을 다시 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 샘플을 건드리지 않고 PAP 펜을 사용하여 슬라이드에 샘플 주위에 반지를 그립니다. 그렇지 않으면 항체 솔루션 염색 중에 흘러, 반지 자기 밀폐 있는지 확인하십시오. 완전히 PAP 펜 링을 건조. </li><li> 트리톤 X-100없이 1 배 TBS와 다른 염색 항아리를 채우십시오. Inser염색 항아리에 건조-슬라이드를 T와 적어도 1 시간 동안 수분 보충을 할 수 있습니다. 한편, 0.05 % 트리톤 X-100, 1X TBS를 사용하여 5 %의 최종 농도에 열 불 활성화 된 산양 혈청 또는 BSA를 희석 한 블로킹 버퍼를 준비한다. </li><li> 클릭 잠금 음식 상자 안에 1 ~ 2 6 잘 플레이트를 배치하여 습식 상자를 확인하고 초순수로 중간 우물을 입력합니다. 염색 항아리에서 재수 슬라이드를 제거하고 (접시 뚜껑없이) 수평으로 6 웰 플레이트에 배치합니다. </li><li> 조심스럽게 PAP 링 내부 버퍼를 차단 300 ~ 600 μl를 추가합니다. 위치로 덮개를 고정하여 습윤 상자 밀봉 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 버퍼를 차단에서 적절한 일차 항체를 희석. 일반적으로, 슬라이드 당 100 ~ 150 μl를 희석 항체 솔루션을 사용합니다. 여러 슬라이드를 처리하는 경우 비례 적으로 볼륨을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 차단 한 후, 조심스럽게 흡인하여 슬라이드에서 차단 버퍼를 제거하고 신속하게 페이지를 추가드라이 아웃을 방지하기 rimary 항체 용액 후 습윤 상자를 밀봉하고, 밤새 4 ℃에서 배양한다. </li><li> 다음 날, 흡인하여 슬라이드에서 차 항체 솔루션을 제거합니다. 0.05 % 트리톤 X-100, 3 시간 15 분으로 각각 1X TBS 가득 염색 단지에 삽입하여 슬라이드를 세척한다. 한편, (또는 DAPI 또는 팔로이 딘없이) 버퍼를 차단하여 적절한 형광 차 항체를 희석. </li><li> 조심스럽게 슬라이드에 차 항체 용액 100 ~ 150 μl를 추가합니다. 습식 상자 안에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 밀봉. 실온에서 1-2 시간 동안 인큐베이션 슬라이드. </li><li> 0.05 % 트리톤 X-100, 3 회, 15 분 각각에 1 배 TBS 가득 염색 항아리에 슬라이드를 씻으십시오. -20 ° C에 저장된 경우, 최종 세척에서, 10 분 동안 50 ° C의 물을 용기에 안티 - 페이드 장착 매체 해동. 사용하기 전에 실온으로 장착 매체로 냉각. </li><li> 에 장착 매체의 약 20 μL (한 방울)를 추가슬라이드 및 샘플을 통해 큰 커버 슬립 (적어도 22mm X 64mm)를 적용합니다. 6 시간 포스트 장착 내에서 형광 공 초점 현미경을 이용하여 관찰한다. <ol><li> 이미지가 같은 날에 수행 할 수없는 경우, 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉하고 밤새 4 ° C에서 습식 상자 안에 배치합니다. 참고 : 안티 - 페이드 장착 매체가 점차적으로 몇 일 후에 산화 (그리고 갈색 설정) 때문에 가능한 빨리 이미지를 가지고하는 것이 좋습니다 얻을 것이다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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여기에서 우리는 Xenopus의 배아에서 차 신경을 시각화하는 편리하고 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 세포 형 특이 적 마커를 사용하여 신경 줄기 세포 및 분화 된 신경 세포를 포함한 차 신경 세포의 종류의 평가를 허용한다. 프로토콜은 재현성이 매우 높은 수준으로 일반적으로 강하다. 사전 부화 단계에있는 배아의 경우 (즉, 최대 28 단계로), 이것은 태아가 완전히 고정하기 전에 펴다 할 수 있도록 우리가 수동으로 이전의 고정에 난황 막을 제거하는 것이 좋습니다. 절곡 배아 실장 챔버 내부의 원하는 방향으로 배열하는 것이 매우 곤란하기 때문에, (부화 전에) 비교적 초기 단계 배아를 수집 할 때 특히 중요하다. 우리는 MEMFA 또는 PFA 고정 따라서 추가 항원 검색 단계 후 면역 원성의 손실을 경험하지이 프로토콜에 대한 필요가 없습니다했다. 또한, 본면역 염색 과정은 계내 혼성화에 발색 / 형광 샘플에서 수행 될 수있다. 이러한 시나리오에서, 원위치 혼성화 프로토콜 동안 프로테아제 K 처리 단계를 생략 할 것을 권장한다. 형광 / 발색 기질의 반응 후, 샘플을 TBS로 세척 할 수 있고, MEMFA / PFA 고정 샘플을 유사한 방식으로 어류 젤라틴 수용액에 매립. 샘플 튜브는 원위치 혼성화 형광 나중에 면역 염색과 함께 이미징 될 경우 알루미늄 호일에 튜브를 배치하여 빛으로부터 보호 할 수있다. 일부의 경우, 배아 젤라틴 침투 후 지나치게 수축된다. 이것은 가능성이 어느 부족 고정 또는 불충분 한 TBS-트리톤 추출로 인해 발생합니다. 배아는 적어도 2 ~ 3 시간 동안 PFA / MEMFA에 고정 바람직 밤새 4 ° C에서되었는지 확인합니다. 문제가 지속되면, 1 시간 동안 3 TBS-트리톤의 세탁 시간을 증가시킨다. 극저온 SECTIO 중닝는 샘플 블록의 강성은 생선 젤라틴 등 다양한 배치가 서로 다른 특성이 다를 수 있습니다. 이 문제는 부분적으로 마이크로톰의 온도를 조정함으로써 보상 될 수있다. 낮은 온도는 샘플 블록 섹션에 선명하고 어려워진다 그러나 과도한 저온 아래에 &quot;열심히&quot;샘플 블록에서 발생합니다. 각각의 단면 전 (배아없이 모의 샘플 블록을 사용하여) 일부 미세 조정 또는 관행은 특히 유용 샘플에 사용하기 전에 도움이 될 수 있습니다. 절편시 일반적으로 발생하는 문제는 얇은 섹션 때때로 두꺼운 유리 접시에 스틱이 아닌 스틸 무대에 평평하게 유지하는 경향이있다. 이것은 연속 절편 프로세스를 중단 때문에 특히 방해가 될 수있다. 섹션 챔버 (특히) 두꺼운 유리판 기계와 오에 충분한 감기, 또는 과도한 정전기없는 : 이러한 경우는 일반적으로 두 가지 이유 중 하나에 의해 발생특히 건조한 날씨에 perator. 전자는 부 챔버의 온도를 낮추는 여분 시간 (아마도 밤새) 미국 내 유리판을 남김으로써 해결 될 수있다; 제대로 저온 유지 장치를 접지하여 후자. 금속 탭 또는 금속제의 유사 물 튜브 시스템으로 저온 유지 장치의 금속 표면을 연결하면 정전기를 방출하는 다른 방법 일 수있다. 사용 후, 두꺼운 유리판을, 초순수에 의해 세정 (예 주방용 액체와 같은) 비 부식성 세제로 잘 세척한다 순수 에탄올을 분무하고, 손상 표면과 에지를 보호하기 위해 수건 종이에 싸서. 프로토콜에 열거 된 항체는 일반적으로 특정하고 우리는 거의 비특이적 흡착 또는 높은 배경 신호가 발생하지 않습니다. 그것은 주목해야한다해야 차단제 (혈청 무성한 침전물의 형성에 의해 가시화로) 과도한 열 불 활성화로 열 불 활성화 염소 / 양고기 혈청을 사용하는 경우, 그이 침전제로 피할 수 이차 항체에 매우 매력과 높은 배경의 소스에 기여할 수있다. 이 가능하고, 때때로 동시에 신경 세포의 개체군을 시각화 이중 염색을 수행하기 원하는. 이러한 이중 염색이 가능하며 일반적으로 다음과 같은 조합으로 만족스러운 결과를 제공합니다 Sox3 / N-욕조 또는 Myt1 / N-욕조. 그러나 Sox3 및 Myt1의 이중 염색은이 항체가 토끼 원점에서 둘 다 사실에 의해 복잡하다. 우리는 가능성으로 인해 이차 항체에서 신호 증폭의 부족으로 여러 항체 직접 라벨 키트, 그러나 더 만족스러운 결과를 (낮은 신호 대 잡음 레벨) 관찰되지 않았다을 테스트했습니다. 이 문제를 회피하기위한 하나의 가능한 방법은 후술하는 바와 같이, Xenopus의 형질 전환 라인을 마련하는 것이다. 이 프로토콜의 주요 제한 사항 중 하나는, 그 동안이 프로토콜 할 수 충분히 디입니다신경 세포의 두 가지 풀 stinguish, 즉 Sox3 발현하는 신경 줄기 세포의 풀과 Myt1 발현 분화 신경 세포는 분화 신경 세포는 다른 하위 집단을 표시하는 능력이 부족하다. 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 하위 집단, 일차 운동 뉴런의 interneurons 및 감각 뉴런은 보통 차등 발현 마커 유전자 (28-30)을 특징으로한다. 위에서 언급 한 바와 같이, Xenopus의 배아에서 항체 기반의 면역 검출 방법과 함께 현장 하이브리드에 여러 가지 빛깔의 개발에 최근의 발전 가능성 조사 (31)에 대한 차별화 된 신경 세포의 이러한 하위 집단을 나타 내기 위해 격차를 입력 할 수 있습니다. 다르게는, 생쥐 모델에서 입증 된 바와 같이, 또한 Xenopus의 그러한 다른 세포 집단을 구별하는 세포 유형 특이 적 항체의 더 포괄적 인 세트를 발생하는 것이 바람직 할 것이다. 그것은이다또한 가치가이 방법에 추가로, 그 언급, 이러한 광자 현미경, 3 차원 재구성 및 분할 등의 광학 이미징 및 이미지 분석 최근 발전은 또한 초기 평가는보다 포괄적 인 Xenopus의 난 모세포의 관찰뿐만 아니라 달성 한 후 적용 할 수 있습니다 특히 32, 33을 설정하는 라이브에서 초기 배아. 따라서, 증식, 분화, 살아있는 동물에서 신경 세포의 움직임을 추적하기 위해서는 초기 Xenopus의 이러한 세포 집단의 실시간 관찰을 허용하는 세포 유형 특이 적 프로모터에 의해 구동되는 형광 단백질 항구 하나 이상의 형질 전환 라인을 확립하는 것이 바람직 할 것이다 배아. X의 설립 tauGFP 및 응용 프로그램을 구동 신경 특정 β-tubulin의 프로모터와 laevis의 라인은 좋은 예 23,34를 제공하고 있습니다. sox3 및 척추 동물 35-37 특징 myt1 모두의 전체 프로모터 서열, 그것은 쉬입니다Xenopus의 커뮤니티와 주요 신경 연구의 일반적인 필드 모두에 광범위하게 기여해야 Xenopus의 추가적인 유전자 변형 라인을 설정하기가 비교적 쉬운 울드.

척추 동물에있어서, 중추 신경계의 발달은 여러 독특한 아직 연속 단계를 포함한다. 첫 번째 단계는 나이브 외배엽 세포는 신경 운명보다는 표피 운명 향해 지정되는 신경 유도된다. 여러 상호 규제 메커니즘 Xenopus의 다른 모델 시스템 1, 2에서이 단계에서 참여하고 있습니다. 이 과정은 주로 chordin, 소량 및 follistatin의 3-7로서 기본이되는 중배엽에 의해 생성 분비 요인에 의해 조정된다. 신경 유도 후, 신경 전구 세포의 서브 세트는 세포주기를 종료하고 주 신경 지칭되는 과정에서 구분하기 시작한다. 모든 신경 전구체이 시점에서 구별되지 않습니다. 나머지 신경 전구 세포를 개발함으로써 전역 성인기에 중추 신경계의 지속적인 성장에 필요한 줄기 세포의 풀을 유지하고 증식하는 것을 계속한다. 이러한 홍보신경 전구 세포를 oliferating하는 SRY (섹스 결정 지역 Y) -box 3 (sox3) 유전자 8-11의 발현을 특징으로한다. 차별화 된 운명에 투입 출구 세포주기 및 세포의 다른 인구는, 분화 유전자 마커, 튜 불린의 표현, 베타에 의해 식별됩니다 2B 클래스 IIB (tubb2b, N-욕조) 및 수초 전사 인자 1 (myt1) 12-14. 그러한 분화 된 신경 세포는 결국 포함 뉴런의 다양한 카테고리를 야기하지만, 모터에 한정되지 않고, 인터페이스와 신경관 15-17 내에 뚜렷한 영역에 위치하는 감각 뉴런. 상당한 노력이 앞쪽에 neuroectoderm 이벤트를 결정하는 패터닝과 운명을 지배하는 규제 메커니즘을 폭로에 전념되었지만, 적은주의는 다음 발생하는 신경 인성 사건을 조사에 이루어진 것으로,초기 패터닝 단계. 실제로, 신호 전달, 전사 규정뿐만 아니라, 번역 후 변형은 모든 신경 18-20 중 둘 타이밍 리니지 사양 제어,이 이후 단계에 포함된다. 이러한 메커니즘에 추가 조사를 쉽게 시각화하고 신경 세포의 다른 집단과 구별하기 위해 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다. Sox3, Myt1 포함한 신경 마커를, 상술의, 그리고 N-욕조, 따라서 신경 분화 21-23의 기본 메커니즘을 드러내는에 필요한 기반을 제공하고, 서로 다른 세포 집단을 식별하기위한 수단을 제공 할 수있다. 신경 세포 집단의 차동 라벨링 다른 유기체 모델에서 입증되었지만, 비교적 소수의 연구가 이러한 관점에서 최대한으로 Xenopus의 시스템을 이용했다. 이 확실 다양한 neur 식별 호환 항체 소수 주로 기인신경 튜브도 그러 세포 집단. 여기, 우리는 제노 푸스에서 차 신경을 조사하기위한 강력하고 편리한 방법을 제공 면역 염색을 통해 초기 Xenopus의 배아에서 신경 세포의 분화를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 단계 26 단계 (45) 사이에 Xenopus의 중추 신경 시스템의 초기 개발에 관심이있는 연구자에 대한 충분한 지침을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium (OCT)</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;85-90 &amp;deg;C Heat block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Acetone, analytical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staining jar with slide racks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-acetylated tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;488 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;555 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 Phalloidin</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

대표 결과는 다른 항체 (그림 4)로 염색 다른 수준, 즉 전뇌, 중뇌, 후뇌, 척수, 무대 30 Xenopus의 배아의 단면을 보여줍니다. 언급 한 바와 같이, 차별화 된 주 뉴런이 바깥쪽으로 마이그레이션 및 신경 튜브의 한계 계층 (기초 얇은 판) 근처에 위치 MyT1 표지 동안 신경 전구 세포 인구, 신경 튜브의 루멘의 근접에 위치 Sox3 표지. 안티 - 아세틸 - 튜 불린은 전체 신경 튜브 내에서 관찰 할 수있는 차별화 된 뉴런의 축색 돌기 레이블. 사이드 특정 유전자 녹다운 또는 과발현은 특정 유전자 (들)의 발현을 조절하는 것은 신경 세포의 성장과 분화를 방해 여부를 평가하는 신경 생물학에서 광범위하게 사용되는 방법이다. 이러한 경우, 어느 Morpholinos (MOS) 또는 DNA 구조체 (들)을 수행 프로<html> 프로모터 구동 유전자 (들)이 세포 단계에서 23 개의 할구 중 하나에 주입된다. 대안 적으로, 그들은 최저 또는 과발현 목적 유전자 (들) (27)의 전기 발생한다이어서 뇌 뇌실 내로 주입 될 수있다. 두 경우 모두, 치료 효과는 내부 대조군으로서 태아의 반대측을, 배아의 일측에 한정 될 것이다. 고정, 절편 및 면역 후 유전자 녹다운 / 과발현의 영향은 계산 배아의 양측에 서로 다른 집단의 세포 수를 비교하여 정량한다. 여러 배아로부터 이들 데이터를 축적하여 통계 분석이 수행 될 수있다. 우리의 대표적인 결과에서, 어떤 교란은 배아에서 만든되지 않았다. 유전자 섭동 상이한 신경 세포 집단에 미치는 영향의 예는 참조 20,23에서 찾을 수있다. t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> 그림 1 :. 섹션 금형 배아 배치 및 방향 (A) 장착 어셈블리를 보여주는 만화 묘사, 트레이는 날짜, 무대, 그리고 배아의 방향으로 표시되어 있습니다. (B) 장착 어셈블리의 자연 모습을 보여주는 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> 그림 2 :. 오리엔테이션 및 샘플 유지 디스크의 젤라틴 블록의 위치 (A) 섹션 블록 어셈블리를 보여주는 만화 묘사, 배아는 &quot;최대 머리&quot;위치에있는 젤라틴 블록이 제대로 O를 고정되어 있습니다기지에서 조직 동결 매체하여 샘플 유지 디스크 NTO (그림 2B 참조). (B) 섹션 블록 어셈블리의 자연 모습을 보여주는 이미지, 젤라틴 블록과 샘플 유지 디스크 사이의 조직 동결 매체의 축적을 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> 그림 3 :. 섹션 챔버의 연속 절편 (A) 모델입니다. 샘플 유지 디스크가 배아면이 위를 향하게되는 위치로 회전 및 고정되어야한다. 소수 (6-10) 섹션 후 연속 구역 타일의 긴 스트립 부드럽게 미세 브러시를 사용하여 블레이드 (청색)로부터 분리 된 후, 지지판에 90 °졌다. 그런 다음 방 온도는 긍정적으로 슬라이드가 충전단단히 아래로 향하게 섹션 스트립에 누르면 즉시 수집 완성 된 스트립에 올려. 도시 된 바와 같이, (B)는 일반적으로 각각의 슬라이드는, 스트립이 평행선을 수용 할 수있다. 연필을 사용하여 슬라이드 레이블에 대한 자세한 기록을 확인해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> 그림 4 : 단계 30 X의 단면 , 20 배. (A) 회로도는 Xenopus의 올챙이에 단면 평면의 상대 위치 (전뇌, 중뇌, 후뇌, 척수)를 나타내는 신경 조직에 올챙이와 염색을 laevis의. (B) 항 Sox3 (적색), 항 - 아세틸 - 튜 불린 (초 물들 대응 단면신경관 내에 신경 줄기 세포뿐만 아니라 풀 neurofilaments의 상대 위치를 나타내는 n) 및 DAPI (청색). 신경 튜브 내에서 차별화 된 주 뉴런의 상대적 위치를 보여주는 방지 MyT1 (빨강)과 DAPI (청색)로 염색 단면을, 대응 (C). 스케일 바 = 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K 조회수.  University of Manchester.  이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다. 

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

발생학

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The immunodetection of thymidine analogs (such as 5-Bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU)) is a standard technique used for visualizing these newly generated cells. Therefore, BrdU is usually injected in small animals intraperitoneally, so the thymidine analog gets incorporated into dividing cells during DNA synthesis. Detection is performed by immunohistochemical analysis of brain slices. Every research group that has been using this technique can appreciate that it requires special attention to minute details to achieve a successful stain. For instance, an important step is DNA denaturation with HCl, which allows it to reach the cell nucleus to stain it. However, the existing scientific reports describe very few of such steps in detail. Therefore, standardizing the technique is challenging for new laboratories as it can take several months to yield positive and successful outcomes. The purpose of this work is to describe and elaborate the steps to obtain positive and successful outcomes of the immunostaining technique in detail when working with the thymidine analog BrdU. The protocol includes the reagent preparation and setup, administration of thymidine analog in a rodent, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, use of avidin-biotin complex, immunofluorescence, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

This paper presents four of the most common techniques for visualizing BrdU positive cells to measure adult neurogenesis in rats. This work includes instructions for reagent preparation, thymidine analog administration, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, immunofluorescence, signal amplification, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

생물학

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

마우스 뇌 절편에서 증식된 신경 줄기세포를 시각화하기 위한 면역형광 염색

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

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에서 차 신경 발생 평가

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