Agradecemos Prof. Michael Klymkowsky na Universidade do Colorado em Boulder e Prof. Nancy Papalopulu na Universidade de Manchester para gentileza de anticorpos anti-SOX3 e anti-Myt1, respectivamente. Agradecemos aos membros do laboratório Papalopulu por suas sugestões perspicazes no desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado por dois fundação cura Studentships para SZ e JL, duas bolsas projecto da fundação cura para SZ / EA e JL / EA, respectivamente, a concessão de um programa a partir do Wellcome Trust para EA (WT082450MA), e um subsídio de Apoio Estratégico Institucional do Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Manchester Centro de Bem-Estar Animal e foram cobertos por uma licença UK Home Office Project. 1. Recolha e Fixação de Xenopus embriões <ol><li> Prepare Reagentes e materiais para experimentos. <ol><li> Prepare 10x de modificação de Ringer de Marc (MMR) por dissolução de 56,5 g de NaCl em aproximadamente 800 ml de água ultrapura e adição de soluções de 1 M de KCl, 1 M de MgSO4, 1 M de CaCl2, e 1 M de HEPES pH 7,4 para atingir uma concentração final de KCl 20 mM, 10 mM de MgSO 4, 20 mM de CaCl2, 50 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10 M e, em seguida, ajustar o volume final de 1 L. </li><li> Esterilizar a solução 10x MMR em autoclave a 121 ° C durante 20 minutos num ciclo de líquidos. Ao utilizar, dilui-se com ddH2O para 0,1 x concentração final e adiciona-se 20 mg / L de gentamicina para inibir o crescimento microbiano. </li><li> Adicione 10x solução de TBS através da mistura de 24 g de Tris-HCl, 5,6 g de Tris-base, 88 g de NaCl e dissolver em cerca de 900 ml de água ultrapura. A solução final terá um valor de pH cerca de 7,6. Ajustar quer com NaOH a 10 M ou HCl concentrado para atingir um pH final de 7,6 e um volume final de 1 L. </li><li> Ao utilizar, fazer TBS 1x diluindo 1 parte de 10x solução de TBS com 9 partes de água ultrapura. </li><li> Adicione 10x MEM de sal por dissolução de 209.2 g de MOPS em aproximadamente 800 ml de água ultrapura e adição de soluções de reserva de 0,5 M de EGTA e 1M MgSO4 para atingir uma concentração final de EGTA a 20 mM, MgSO4 10 mM. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10 M e, em seguida, ajustar o volume final de 1 L. </li><li> Esterilizar a solução de sal de MEM em autoclave a 121 ° C durante 20 minutos num ciclo de líquidos (a solução pode ficar amarelo por alguns meses de armazenagem à temperatura ambiente ou depois de ter sido esterilizado, mas esta mudança de cor não afecta o seu uso ). No entanto, não use a solução após armazenagem prolongada (mais de 6 meses). </li><li> Faça 1x MEMFA solução através da diluição de uma parte de MEM sais, 1 parte de 37% de formaldeído, com 8 partes de água ultrapura (v / v, estáveis ​​a 4 ° C durante, pelo menos, 1-2 semanas). </li><li> Prepare paraformaldeído a 4% em TBS (para posterior coloração envolvendo faloidina) por dissolução de 4 g de pó de paraformaldeído em 100 ml de solução de 1X TBS aquecer a solução a 60 ° C e adiciona-se algumas gotas de NaOH a 10 M para auxiliar a dissolução. Alíquota em 5-10 ml de volume e congelamento de -20 ° C. Não voltar a congelar uma vez descongelado. CUIDADO: O paraformaldeído em pó é um irritante e é tóxico por inalação, assim o passo de pesagem deve ser realizada numa hotte. </li><li> Rotular como muitos frascos de vidro de 4 ml com tampas de rosca antes da coleta da amostra. </li><li> Prepare a 15% de gelatina / sacarose a 15% vertendo 20 ml de 40% de gelatina de peixe (pré-aquecimento em um banho de água a 50 ° C) em um tubo de centrífuga de 50 ml. Adiciona-se 8 g de sacarose e encher o tubo para a linha de 50 ml com TBS 1x. </li><li> Coloque o tubo de gelatina num misturador rotativo ou cama de rolamentoa misturar durante a noite à temperatura ambiente. Esta solução de gelatina é estável a 4 ° C durante 1 semana. Não use solução expirado e não de congelamento e descongelamento. </li></ol></li><li> Preparar e corrigir X. laevis ou X. tropicalis embriões cultivados a Escalonamento desejado. <ol><li> Cultura do X. fertilizado laevis ou X. tropicalis embriões em MMR 0,1x com gentamicina até as fases desejadas. NOTA: Geralmente, recolher embriões entre os estágios 23 e 40. Mais tarde recolha de embriões após a etapa 40 é possível, especialmente quando se observa o crescimento axonal da medula espinhal, mas tenha em mente que o tempo de penetração de gelatina adicional pode ser necessária. Os embriões podem ser de tipo selvagem, transgénico, mutante, inibidor-tratada, morfolino (MO) -injected, ou a electroporação 23,24. </li><li> Recolha 20-50 embriões em cada frasco de vidro de 4 ml, remover o máximo médio possível e substituir com MEMFA. NOTA: Se posterior coloração envolve phalloidin, use paraformaldeído a 4%em vez de MEMFA vez que as soluções de formaldeído fornecido comerciais normalmente contêm até 10% de metanol como um estabilizador que irão interferir com a coloração com faloidina. </li><li> Fixar durante a noite a 4 ° C ou, em caso de urgência, à temperatura ambiente durante 2 horas num misturador rotativo. Os embriões será estável na solução de fixação durante pelo menos 1 semana a 4 ° C. </li><li> Após a fixação, lavar os embriões 3 vezes durante 20 min, utilizando 1x TBS com 0,05% de Triton X-100. Após a lavagem final, remover tanto TBS-Triton quanto possível e adicionar 3 ml de 15% de gelatina / sacarose a 15% em cada frasco. </li><li> Colocar os tubos em um rolo cama durante a noite à temperatura ambiente. Para os embriões com mais de estágio 40, utilizar pelo menos 24 horas de tempo de penetração. Após a penetração, proceder imediatamente à seção 2.2 no dia seguinte. </li></ol></li></ol> 2. Montagem e cryosectioning de Xenopus embriões <ol><li> Prepare Reagentes e materiais para experimentos. <ol><li> Pegue uma caixa de charg positivamenteed desliza, de preferência sem abrir. NOTA: Se aberta, manter as lâminas numa condição seca (tal como uma caixa de seco) e utilizar no prazo de um mês para assegurar a carga estática sobre as lâminas é mantida. Não use lâminas expirados desde amostras vão cair durante a imunocoloração. </li><li> Pré-refrigerar a câmara de criostato a -30 ° C. Defina os parâmetros do instrumento como -35 ° C para micrótomo e 12 de espessura mm seção. Instalar a placa de cobertura de vidro grosso para o palco e deixar o criostato equilibrar durante pelo menos 30 minutos antes da seção começa. </li><li> Prepare escovas de pintura para mover tiras de seção, mantenha dentro da câmara de criostato. </li><li> Prepare lápis para escrever sobre slides, colocá-los à temperatura ambiente. </li><li> Usar luvas durante criocorte. Não use as mãos desprotegidas. </li></ol></li><li> Montagem Xenopus embriões <ol><li> Aspirar cuidadosamente 5-10 embriões para fora do frasco de vidro usando um plástico ou pipeta de vidro, sem a introdução de bolhas de ar. Transferir os embriões empara a câmara de montagem e observe sob um estereoscópio. Encher-se a câmara de montagem com uma solução de gelatina a garantir a rigidez do bloco de secção. </li><li> Disponha os embriões conforme a Figura 1, usando um par de fórceps de ponta fina. Marque a orientação das cabeças desenhando uma seta na borda da câmara utilizando um marcador criogénico-compatível. Para vários grupos de embriões, anote a descrição de cada grupo na borda da câmara correspondente bem. </li><li> Com cuidado, coloque a câmara na horizontal em uma caixa de espuma de meio-cheio com gelo seco e feche a tampa. Observe o congelamento câmara de montagem em 5-10 min. Processar cada uma das câmaras em série (ou seja, colocar a câmara anterior em gelo seco antes de prosseguir para a próxima), como isso vai deixar tempo suficiente para cada câmara para congelar e impedir que a caixa de gelo seco para tornar-se superlotadas. NOTA: câmaras de montagem congelados não precisa ficar na horizontal e podem ser empilhadas até dentro da caixa. </li><li>Prosseguir com cryosectioning ou, se necessário, manter as amostras congeladas a -80 ° C durante pelo menos 1-2 semanas, sem perda de imunogenicidade. </li></ol></li><li> Criocorte de embriões de Xenopus montadas <ol><li> Remover um bloco de amostras congeladas a partir da câmara pressionando a parte inferior da câmara usando uma vara blunt (tal como um lápis). </li><li> Adicionar algumas gotas de meio de congelamento de tecidos, um álcool (meio contendo polietileno-glicol e polivinil) para o disco de retenção de amostra e montar o bloco de amostras com a extremidade anterior dos embriões aponta para cima (Figura 2). Permitir que o bloco mounted- ficar dentro da câmara de criostato durante aproximadamente 1 min ou até que o meio de congelamento do tecido torna-se opaca. </li><li> Imediatamente instalar o disco de retenção de amostra para o micrótomo com o lado de baixo do bloco de amostra virado para cima. Aparar uma porção do bloco de amostra utilizando uma lâmina quando o bloco de amostra é ainda relativamente &quot;macio&quot; para reduzir o comprimento de cada secção(se desejado). Deixar o disco de retenção da amostra do micrótomo para, pelo menos, 5 minutos para permitir que a sua temperatura atingisse o equilíbrio. </li><li> Aos poucos, cortar o bloco de amostra para baixo até que as cabeças dos girinos são visíveis através da gelatina translúcida. Para aumentar o corte de velocidade, aplicar uma configuração mais alta (mais grosso) de espessura de corte (por exemplo, 20-25 M) neste estágio (como habilitar a opção &quot;trim&quot;), mas não muito grosso porque o bloco de amostra pode cair a partir do disco de retenção de amostra . Observar o desempenho de criostato, tais como a nitidez e o ângulo da lâmina, nesta fase, para assegurar a geração de uma longa tira de secções subsequentes. </li><li> Uma vez que as cabeças de girinos se tornam visíveis, ajuste as configurações do criostato de volta ao normal (por exemplo, 10-12 M) e limpo tanto o micrótomo e palco usando um pincel. Delicadamente fazer 2-3 seções como um teste usando a configuração de roda de mão (não utilize a definição motorizado) para se certificar de que fatias acabados podem formar strips, não sobrepostas ou furar a lâmina. </li><li> Continue o corte até que as cabeças de girinos são quase exposto (pode precisar de alguma experiência, mas possível). Escove todas as seções remanescentes no palco e na constituição de seções de amostra começará. </li><li> Faça cerca de 10-15 secções e deixá-los formar uma longa faixa. </li><li> Vire a placa de cobertura de vidro grosso para o lado e remova cuidadosamente a fita da lâmina utilizando um pincel de ponta fina e organizá-lo no palco com longo eixo paralelo à lâmina. </li><li> Escolha um slide carregado positivamente à temperatura ambiente, rotulá-la com um lápis (que não vai ser lavado durante os tratamentos de coloração subsequentes), pressione-o rapidamente, mas com firmeza sobre a tira com a etiqueta virada para baixo e retirar a lâmina da câmara de criostato. Se feito corretamente, a tira deve ficar imediatamente para o slide carregado positivamente (Figura 3A). </li><li> Repita este passo para ter 20-30 fatias em cada deslizouE e dispostos em paralelo (Figura 3B). Isto é suficiente para cobrir toda a região do cérebro de X. embriões tropicalis e a maioria de cérebro anterior e do mesencéfalo regiões do X. laevis embriões. </li><li> Secar as lâminas durante 10 min, proceda de imediato, ou armazenar os slides em uma caixa de slides a -80 ° C durante pelo menos 3-6 meses sem perder a imunogenicidade. </li></ol></li></ol> 3. A imunocoloração de Sectioned Xenopus embriões <ol><li> Prepare Reagentes e materiais para experimentos. <ol><li> Prepare a 0,05% de TBS-Triton X-100 por adição de Triton X-100 em 1x TBS para se conseguir uma concentração final de 0,05%. Esta solução é estável à temperatura ambiente durante 3-4 dias. Não use solução expirada. </li><li> Prepare 5% de soro de cabra inactivado pelo calor ou 5% de BSA em TBST como tampão de bloqueio. Em primeiro lugar, o calor-inactivar o de soro de cabra / cordeiro, colocando cerca de 20-30 ml de soro em um banho de água a 65 ° C durante 30-60 min. Aliquota em 1,5 ml de centrífugatubos e congelamento de -20 ° C. Não re-inactivação é exigido no momento usando. </li><li> Diluir o soro inactivado pelo calor ou de BSA em TBST para atingir uma concentração final de 5% antes da utilização. </li><li> Preparar anticorpos primários apropriados de acordo com diluições em tampão de bloqueio (por exemplo, 1: 250 de anti-tubulina Myt1 26 / anti-acetilada: 500 de anti-SOX3 10,25 / 1). Use cerca de 100 ml de solução de anticorpo em cada slide. </li><li> Preparar anticorpos fluorescentes adequados (de coelho fluorescentes vermelho anticorpos por exemplo, anti-ratinho / conjugado com corante) em tampão (habitualmente 1: 500) de bloqueio. </li><li> (Opcional) Adicionar vermelho fluorescente conjugado com corante faloidina (1: 500) em combinação anticorpo secundário para revelar rede de actina. </li><li> (Opcional) Adicionar DAPI (0,5 ug / ml de concentração final) em combinação anticorpo secundário para visualizar a localização nuclear. </li><li> Leve o meio de montagem anti-fade fora do congelador e descongelar em banho de água à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> imunocoloração <ol><li> Retirar as lâminas congeladas entre -80 ° C e colocá-los em um pedaço de papel toalha dentro de um exaustor por pelo menos 1 hora para eliminar quaisquer gotas de água condensadas, então cozer as lâminas secas em um bloco de aquecimento C 85-90 ° com o fatias que enfrentam-se durante 15 min para ativar o mecanismo de adesão. Por fim, permitir que as lâminas de arrefecer até à temperatura ambiente (pelo menos 10 min). </li><li> Encha a tina de coloração com acetona pura e incubar as lâminas em acetona durante 10 min para remover gelatina de peixe. Se vários slides estão a ser tratados, organizá-los em um rack de coloração. Secar as lâminas-tratadas durante 15 min num exaustor de ventilação. Não re-utilizar a acetona. </li><li> Cuidadosamente desenhar um anel em torno das amostras no slide usando uma caneta PAP sem tocar nas amostras. Certifique-se de que o anel é fechado em si mesmo, caso contrário solução de anticorpo fluirá durante a coloração. Totalmente secar o anel PAP caneta. </li><li> Encha uma outra tina de coloração com TBS 1x sem Triton X-100. insert-as lâminas secas na tina de coloração e permitir re-hidratação durante pelo menos 1 h. No entanto, preparar o tampão de bloqueio por diluição de soro de cabra inactivado pelo calor ou de BSA até à concentração final de 5% utilizando 1x TBS com 0,05% de Triton X-100. </li><li> Faça uma caixa molhada, colocando 1-2 placas de 6 poços dentro de uma caixa de alimentos click-lock e encher os poços até a metade com água ultrapura. Retirar as lâminas re-hidratados do frasco de coloração e colocá-los horizontalmente sobre as placas de 6 poços (sem a tampa da placa). </li><li> Adicionar cuidadosamente 300-600 mL de tampão de bloqueio no interior do anel PAP. Selar a caixa molhada por bloqueio a tampa para a posição e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li><li> Dilui-se os anticorpos primários apropriadas em tampão de bloqueio. Geralmente, use 100-150 solução de anticorpo ul diluído por slide. Se vários slides são processados, ampliar o volume proporcionalmente. </li><li> Após o bloqueio, remova cuidadosamente o tampão de bloqueio de diapositivos por aspiração e adicionar rapidamente pA solução de anticorpo rimary para evitar seca-a, em seguida, selar a caixa húmida e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, remover a solução de anticorpo primário a partir das corrediças por aspiração. Lavar as lâminas através da inserção em frascos de coloração com 1x TBS com 0,05% de Triton X-100, 3 vezes, 15 min cada. Entretanto, dilui-se os anticorpos secundários fluorescentes apropriados com tampão de bloqueio (com ou sem DAPI ou faloidina). </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 100-150 ul de solução de anticorpo secundário sobre as lâminas. Colocar as lâminas dentro da caixa molhada e selar a tampa. Incubar as lâminas durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as lâminas em frascos de coloração com 1x TBS com 0,05% de Triton X-100, 3 vezes, 15 min cada. Na lavagem final, descongelar o meio de montagem anti-desbotamento em um banho de água a 50 ° C durante 10 minutos, se for armazenado a -20 ° C. Arrefecer o meio de montagem à temperatura ambiente antes do uso. </li><li> Adicionar cerca de 20 l (uma gota) de meio de montagem emo slide e aplicar uma grande lâmina de cobertura (pelo menos 22 mm x 64 mm) sobre as amostras. Observe usando fluorescente ou microscópio confocal dentro de 6 horas de montagem post. <ol><li> Se de imagem não pode ser feito no mesmo dia, selar lâminas usando unha polonês e colocá-los dentro da caixa molhada, a 4 ° C durante a noite. NOTA: O meio de montagem anti-fade vai gradualmente se oxidado depois de alguns dias (e transformá-acastanhado) por isso é recomendado que tome as imagens o mais rápido possível. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain.">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise.">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus.">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li><li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4.">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li><li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsoventral+patterning+in+Xenopus:+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4.">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li><li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4.">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li><li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages.">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li><li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives.">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li><li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/VegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation.">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li><li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis.">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li><li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors.">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li><li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop.">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt/beta-catenin+signalling+during+forebrain+development.">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469 (2013).</li><li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+(FISH)+on+whole+mounts+and+sections.">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li><li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+in+living+embryos.">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo.">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui demonstramos um método conveniente e eficiente para a visualização neurogénese primária em embriões de Xenopus. Este método permite a avaliação de diferentes tipos de células neurais, incluindo células estaminais neuronais e neurónios primárias diferenciadas utilizando marcadores específicos do tipo de célula. O protocolo geral é robusto com muito elevado nível de reprodutibilidade. Para os embriões que estão em fases pré-incubação (ou seja, até à fase 28), recomendamos remover manualmente a membrana vitelina antes da fixação, pois isso permite que embriões para desenrolar completamente antes de fixação. Isto é especialmente importante quando a recolha de embriões em fases relativamente iniciais (antes da eclosão), uma vez que embriões dobrados são extremamente difíceis de arranjar na orientação desejada no interior da câmara de montagem. Nós ainda não experimentou uma perda de imunogenicidade após MEMFA ou PFA fixação passo recuperação antigênica, portanto, adicional não é necessário para este protocolo. Além disso, esteimunocoloração procedimento pode ser realizado em amostras de cromogénico / hibridação in situ fluorescente. Em tal situação, é recomendado para ignorar a protease K durante o passo de tratamento in situ protocolo de hibridização. Após a reacção do substrato cromogénico / fluorescente, as amostras podem ser lavadas com TBS e embebidos em solução de gelatina de peixe de uma maneira semelhante à amostras fixadas MEMFA / PFA. frascos de amostra pode ser protegida da luz enrolando os frascos em folha de alumínio se hibridação in situ fluorescente vai ser trabalhada em conjunto com a coloração imunofluorescente mais tarde. Em alguns casos, os embriões podem diminuir excessivamente após a penetração de gelatina. Isto é provavelmente causado por uma fixação insuficiente ou insuficiente de extracção TBS-Triton. Certifique-se de que os embriões foram fixados em PFA / MEMFA para, pelo menos, 2-3 horas, ou de preferência durante a noite a 4 ° C. Se o problema persistir, aumentar o tempo de lavagem de Triton-TBS a 3 para 1 hr. Durante crio-sectioNing, a rigidez do bloco de amostra pode variar como diferentes lotes de gelatina de peixe possuem propriedades diferentes. Este problema pode ser parcialmente compensada através do ajuste da temperatura do micrótomo. A temperatura mais baixa resultará em um bloco &quot;mais difícil&quot; amostra no entanto sob a temperatura excessiva baixo o bloco de amostra torna-se nítida e difícil de seção. Algum ajuste fino ou prática (usando blocos de amostras simuladas sem embriões) antes de cada corte pode ser benéfica antes do uso em amostras particularmente valiosos. Um problema comum encontrado durante o corte é os cortes finos, por vezes, tendem a ficar sobre a placa de vidro grosso, em vez de ficar plana no palco de aço. Isto pode ser particularmente perturbadoras, uma vez que constantemente interromper o processo de corte contínuo. Tais casos são geralmente causadas por uma de duas razões: a câmara de secção e (especialmente) a placa de vidro grosso não sendo carga estática frio o suficiente, ou excessiva na máquina eo Sperator, especialmente em tempo seco. O primeiro pode ser resolvido, rodando abaixo da temperatura da câmara de secção e deixando a chapa de vidro para dentro de um tempo extra (possivelmente durante a noite); e este último por terra corretamente o criostato. Ligar a superfície metálica do criostato a uma torneira de metal ou de sistema de tubulação de água semelhante feita de metal pode ser uma maneira alternativa para liberar as cargas estáticas. Depois de cada utilização, a placa de vidro de espessura deve ser bem lavados com um detergente não-corrosivas (como o líquido de lavagem de loiça), lavado com água ultrapura, pulverizados com etanol puro, e embrulhada em papel toalha para proteger a superfície e os bordos da danificação. Os anticorpos listados no protocolo são geralmente específica e nós raramente encontram adsorção não específica ou de alto sinal de fundo. Deve notar-se que, se utilizando soro de cabra / cordeiro inactivado pelo calor como agente bloqueador, de calor-inactivação excessiva (tal como visualizado pela formação de precipitante macio no soro) deveser evitada, pois esta precipitante é muito atractiva para os anticorpos secundários e pode contribuir para uma fonte de elevado ruído de fundo. É possível, e por vezes necessário, para efectuar dupla coloração para visualizar diferentes populações de células neuronais em simultâneo. Essa dupla-coloração é possível e, geralmente, dá resultados satisfatórios com as seguintes combinações: SOX3 / N-banheira ou Myt1 / N-banheira. No entanto, a coloração de dupla-SOX3 e Myt1 é complicada pelo facto de que os dois anticorpos são tanto de origem de coelho. Testámos vários kits de marcação directa de anticorpos, no entanto, não há resultados satisfatórios foram observados (baixo nível de sinal-para-ruído), possivelmente devido à falta de amplificação de sinal a partir de anticorpos secundários. Uma abordagem possível para ultrapassar este problema seria o de aumentar linhas transgénicas em Xenopus, como discutido abaixo. Uma das principais restrições deste protocolo é que, embora este protocolo poderá suficientemente distinguish dois conjuntos principais de células neuronais, ou seja, o conjunto de células estaminais neuronais que expressam SOX3 e os neurónios diferenciados Myt1-expressam, ele não tem a capacidade para revelar diferentes sub-populações de neurónios diferenciados. Tais sub-populações, que incluindo, mas não se limitam a, os neurónios motores principais, e interneurónios, neurónios sensoriais, são usualmente caracterizados pelos seus genes marcadores expressos diferencialmente-28-30. Como mencionado acima, os avanços recentes no desenvolvimento de multicolor hibridação in situ combinado com o método de detecção de imunofluorescência com anticorpos em embriões de Xenopus pode preencher a abertura para revelar estas sub-populações de neurónios diferenciados para a pesquisa do potencial 31. Alternativamente, como já foi demonstrado no modelo de ratos, seria também desejável para elevar um conjunto mais completo de anticorpos específicos do tipo de célula para distinguir tais populações de células diferentes em Xenopus. Isto éTambém vale a pena mencionar que, como um complemento para este método, os recentes avanços na imagem óptica e análise de imagem, como a microscopia multiphoton, reconstrução 3D, e segmentação, pode também ser aplicado após as avaliações iniciais para alcançar observações mais abrangentes de oócitos de Xenopus, bem como embriões, em particular no âmbito de um ajuste 32,33 ao vivo. Portanto, para controlar a proliferação, diferenciação, e o movimento de células neuronais em animais vivos, que seria desejado por uma ou mais linhas transgénicas que abrigam proteínas fluorescentes conduzidos pelo promotor específico do tipo de célula para permitir a observação ao vivo de tais populações de células no início de Xenopus embriões. O estabelecimento de um X. linha laevis com o promotor β-tubulina neuro-específica condução tauGFP e suas aplicações têm proporcionado um bom exemplo 23,34. Com as sequências promotoras completas de ambos SOX3 e myt1 caracterizado por vertebrados 35-37, é SHould ser relativamente fácil estabelecer linhagens transgênicas adicionais em Xenopus que deverão contribuir extensivamente tanto para a comunidade Xenopus e um campo mais geral da pesquisa neurogênese primário.

Em vertebrados, o desenvolvimento do sistema nervoso central compreende várias fases distintas ainda consecutivos. O primeiro passo é a indução neural, quando as células ectodérmicas naive são especificados para um destino neuronal, em vez de um destino epidérmica. Vários mecanismos reguladores interligados estão envolvidos nesta fase em outros sistemas modelo 1,2 Xenopus e. Este processo é coordenado principalmente por factores segregados produzidos pela mesoderme subjacente, tais como chordin, noggin, e folistatina 3-7. Após a indução neural, um subconjunto de células progenitoras neurais sair do ciclo celular e começam a diferenciar num processo referido como neurogénese primária. Nem todos os precursores neuronais diferenciar neste momento. As células precursoras neurais restantes continuam a proliferar, mantendo assim o conjunto de células estaminais necessária para o crescimento continuado do sistema nervoso central durante o desenvolvimento e na vida adulta. estes proliferating células precursoras neurais são caracterizados pela sua expressão do gene 8-11 SRY (sex região determinante Y) -box 3 (SOX3). A outra população de células, que a saída do ciclo celular e comprometer-se a um destino diferenciado, são identificados pela expressão do genes marcadores de diferenciação, tubulina, beta 2B classe IIb (tubb2b, N-banheira) e fator de transcrição mielina 1 (myt1) 12-14. Tais células neuronais diferenciadas, eventualmente, dar origem a diferentes tipos de neurónios, incluindo, mas não limitado a, o motor, inter, e neurónios sensoriais posicionado em zonas distintas no interior do tubo neural 15-17. Enquanto esforços significativos foram dedicada a descobrir os mecanismos reguladores que regem a padronização eo destino determinação eventos na neuroectoderma anterior, menos atenção tem sido feito em investigar os eventos neurogênicas que ocorrem após afase de padronização inicial. Com efeito, a transdução de sinal, os regulamentos da transcrição, assim como as modificações pós-traducionais são todos envolvidos nesta fase posterior, controlando tanto a especificação de tempo e linhagem durante neurogénese 18-20. Outras investigações sobre estes mecanismos requerem um método fiável para visualizar e distinguir as diferentes populações de células neuronais facilmente. A N-banheira acima mencionados marcadores neurais, incluindo, SOX3, Myt1, e, pode proporcionar um meio para identificar estas populações de células diferentes, proporcionando assim as bases necessárias para revelar os mecanismos subjacentes da diferenciação neuronal 21-23. Embora a rotulagem diferencial de populações de células neuronais tem sido demonstrado em outros organismos modelo, relativamente poucos estudos têm explorado o sistema Xenopus para o seu máximo a este respeito. Isto é principalmente devido a uma escassez de anticorpos compatíveis que confiantemente identificar os vários neuronal populações de células no tubo neural. Aqui, descrevemos um método para visualizar a diferenciação neuronal em embriões precoces de Xenopus via imunocoloração, que fornece uma abordagem robusta e conveniente para investigar a neurogênese primária em Xenopus. Este protocolo deve dar orientação suficiente para os pesquisadores interessados ​​no desenvolvimento inicial do sistema nervoso central Xenopus entre etapa 26 e etapa 45.

<table><tbody><tr><td>gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium (OCT)</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;85-90 &amp;deg;C Heat block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Acetone, analytical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staining jar with slide racks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-acetylated tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;488 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;555 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 Phalloidin</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Os resultados representativos mostram secções transversais da fase 30 embriões de Xenopus em diferentes níveis, ou seja, o cérebro anterior, mesencéfalo, rombencéfalo, e da medula espinhal, corados com anticorpos diferentes (Figura 4). Como mencionado, SOX3-marcado da população de células progenitoras neuronais localiza na proximidade do lúmen do tubo neural, enquanto MyT1 marcado neurónios primárias diferenciadas migram para fora e localizar perto da camada marginal (lâmina basal) do tubo neural. Anti-acetil-tubulina etiquetas axónios em neurónios diferenciados, que podem ser observados dentro de todo o tubo neural. -Lado específico silenciamento de genes ou a sobre-expressão é um método amplamente utilizado em neurobiologia para avaliar se modular a expressão do gene específico (s) interrompe o crescimento e diferenciação de células neuronais. Em tais casos, ambos os Morpholinos (OMs) ou a construção (ões) de ADN transportando pro<html> gene (s) orientada para o moter são injectadas em uma das duas blastómeros no estádio de duas células 23. Alternativamente, eles podem ser injectado no ventrículo cerebral seguido por electroporação, o que irá resultar em knockdown ou sobre-expressão de gene (s) desejado 27. Em ambos os casos, os efeitos serão restritas a um lado do embrião, fazendo com que o lado oposto do embrião como controlo interno não tratada. Após a fixação, o seccionamento, e imunocoloração, os impactos de silenciamento de genes / sobre-expressão são quantificadas por contagem e comparando os números de células de populações diferentes em ambos os lados do embrião. Acumulando esses dados a partir de vários embriões, a análise estatística pode ser realizada. Em nossos resultados representativos, nenhuma perturbação foi feito nos embriões. Exemplos de perturbações do gene e os seus efeitos em diferentes populações de células neuronais pode ser encontrada nas referências 20,23. t &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> Figura 1:. Arranjo de embriões e orientação no molde seção (A) Uma descrição dos desenhos animados que mostra o conjunto de montagem, observe a bandeja foi marcada com a data, palco, e a orientação de embriões. (B) Uma imagem que mostra a aparência natural do conjunto de montagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> Figura 2:. A orientação ea posição do bloco de gelatina no disco realização da amostra (A) Uma descrição dos desenhos animados que mostra o conjunto do bloco seção, note que embriões estão em uma posição &quot;heads-up&quot; e do bloco de gelatina esteja firmemente o fixonpara o disco de retenção da amostra pelo meio de congelamento de tecidos na base (ver Figura 2B). (B) Uma imagem que mostra a aparência natural do conjunto do bloco de seção, observe o acúmulo do meio de congelamento do tecido entre o bloco de gelatina e o disco de retenção da amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> Figura 3:. Seccionamento Contínuo (A) Modelo de uma câmara de secção. O disco de retenção de amostra deve ser rodada e fixada para a posição de que o lado do embrião está virada para cima. Depois de alguns (6-10) seções, a longa faixa de azulejos secção contínua são cuidadosamente separados da lâmina (azul) usando um pincel fino, e depois virou 90 ° na chapa de fixação. Em seguida, uma sala de temperatura com carga positiva slide éfirmemente pressionado sobre a tira seção voltada para baixo e imediatamente levantado para tiras acabados recolhidos. (B) Normalmente, cada lâmina pode acomodar 2 linhas paralelas de tiras, como se mostra. Lembre-se de fazer registro detalhado no rótulo de slides usando lápis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> Figura 4: Secção transversal da fase de 30 X. laevis girinos e coloração no tecido neural, 20X. (A) Esquema indicando as posições relativas (prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo e espinal medula) de planos de corte em girinos de Xenopus. (B) secções transversais correspondentes coradas com anti-SOX3 (vermelho), anti-acetilado-tubulina (Green) e DAPI (azul), que mostra os locais relativos dos agrupamentos de células estaminais neuronais, bem como neurofilamentos dentro do tubo neural. (C) Correspondente cortes transversais corados com anti-MyT1 (vermelho) e DAPI (azul), mostrando as localizações relativas de neurônios primários diferenciadas dentro do tubo neural. Barra de escala = 20 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Este artigo apresenta um método conveniente e rápido para a visualização de diferentes populações de células neuronais no sistema nervoso central de embriões de Xenopus, utilizando coloração de imunofluorescência em secções.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K visualizações.  University of Manchester.  Este artigo apresenta um método conveniente e rápido para a visualização de diferentes populações de células neuronais no sistema nervoso central de embriões de Xenopus, utilizando coloração de imunofluorescência em secções. 

Vídeo: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The immunodetection of thymidine analogs (such as 5-Bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU)) is a standard technique used for visualizing these newly generated cells. Therefore, BrdU is usually injected in small animals intraperitoneally, so the thymidine analog gets incorporated into dividing cells during DNA synthesis. Detection is performed by immunohistochemical analysis of brain slices. Every research group that has been using this technique can appreciate that it requires special attention to minute details to achieve a successful stain. For instance, an important step is DNA denaturation with HCl, which allows it to reach the cell nucleus to stain it. However, the existing scientific reports describe very few of such steps in detail. Therefore, standardizing the technique is challenging for new laboratories as it can take several months to yield positive and successful outcomes. The purpose of this work is to describe and elaborate the steps to obtain positive and successful outcomes of the immunostaining technique in detail when working with the thymidine analog BrdU. The protocol includes the reagent preparation and setup, administration of thymidine analog in a rodent, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, use of avidin-biotin complex, immunofluorescence, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

This paper presents four of the most common techniques for visualizing BrdU positive cells to measure adult neurogenesis in rats. This work includes instructions for reagent preparation, thymidine analog administration, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, immunofluorescence, signal amplification, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

Técnicas de imuno-histoquímica para análise da proliferação celular e neurogênese em ratos utilizando o análogo da timidina BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Biologia

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

	...

Avaliando Neurogênese Primária em

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo