この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）（グラントMOP-119503）とカナダの自然科学・工学評議会（NSERC）のカナダの研究所によって資金を供給されました。 NSERCもYDする夏のstudentshipsをサポートし、AA YDは、4年間のフェローシップ賞とブリティッシュコロンビア大学（UBC）によってサポートされ、AAは、大学院生の修士賞（CGS-M）とCIHRでサポートされています。我々は、 図2の画像を生成するために使用される顕微鏡の支援のためにカルバンRoskelleyに感謝します。我々はまた、UBC動物とフローサイトメトリー施設からの支援を認めます。

マウスは、ブリティッシュコロンビア州の動物管理委員会の大学によって承認された手順によって、倫理的な動物実験のためのカナダ・カウンシル動物ケアに関するガイドラインに従って安楽死させました。 1.マウスの大腿骨および脛骨から単一細胞骨髄サスペンションを取得<ol><li>キャビネットの空気をパージし、空気の流れの安定化を可能にし、クリーン/ 70％エタノールでBSC表面を噴霧する手順を開始する前に生物学的安全キャビネットにスイッチ（BSC）15分。プロトコルの全体のために可能な限り無菌すべてを保管してください。非無菌条件下で骨を切断しないでください。 </li><li> 70％エタノールに浸漬することによって、解剖ツールを準備し、5％ウシ胎児血清（HBSS-FCS）、滅菌ペトリ皿（100ミリメートル×15 mm）で、1とハンクス液（解剖はさみ、鉗子の2ペアの1ペア） mlのシリンジ、26½ゲージ針、円錐形のコレクションチューブ（15ミリリットルまたは50ミリリットル）、およびBSCにおける紙タオル。 </li><li>使用してマウスを安楽死させます機関の動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコル。 、BSCに持参1または2ペーパータオルの上に置き、70％エタノールでマウスをスプレー。 </li><li>蓋に2ミリリットル - BSCでは、無菌的にアリコートベースにHBSS-FCSの10ミリリットルと1を滅菌ペトリ皿を開きます。 </li><li>上を向いて背中とのお腹の上でマウスを置き、非利き手の指で胸部セクションの周りの皮膚を持ち上げます。皮膚が持ち上げられる切開を作るためにハサミを使用してください。 </li><li>胃での切開会うの両端まで引っ張り続け、胃に戻ってから、マウスの周りの皮膚を引き離す慎重にカットの両端は、それぞれの手で一方の端にしがみつくと。 </li><li>上を向いて胃にマウスを裏返して、片手で足が露出するまで肌を引き戻す維持、ダウンレグに向けて皮膚の下半分を引っ張ります。 </li><li>マウスアップの足を持ち、足関節の上にアキレス腱を切断し、靭帯は、はさみで脛骨の下端に足に筋肉を接続します。これは、足の骨から足を緩めます。 </li><li>足で足を持ち上げながら、下肢から大腿部の筋肉を切断するために、大腿骨の下端に、すべての膝関節の周りにハサミで筋肉や靭帯を切りました。静かに腓骨及び大腿骨表面から緩め筋肉を引っ張るために鉗子を使用してください。大量出血を避けるために、大腿動脈を切断しないように注意してください。 </li><li> 1手が足につかまっでは、股関節における大腿骨の上端部で記者ダウンオープンはさみは、脚を回転させ、自由への最終的なカットを作るためにハサミを使用しながら股関節から大腿骨を分離するために慎重に引き抜い本体から脚。 </li><li>これ以降、唯一の滅菌鉗子で組織を保持します。一方の端部での足にしがみつくと、他の上で足をやってのけます。 注：接続靭帯がステップで切断されているように、これは、多くの力を必要とすべきではありません1.9。また、ちょうど骨が融合されている足首の上に脛骨を切りました。 </li><li> 1鉗子のセットと別と脛骨と腓骨の近位端部と大腿骨の遠位端部により脚を持ち、慎重に大腿骨と膝蓋骨からそれらを分離するために、膝関節の反対方向に脛骨と腓骨を曲げます。 </li><li>まだ下腿骨に付着した残りの靭帯や筋肉をプルダウンするために鉗子を使用してください。骨髄細胞のためにフラッシュするには小さすぎるようにここでは、鉗子で結合組織と一緒に腓骨を削除します。反転ペトリ皿の蓋の上に洗浄脛骨を置きます。 </li><li> 1鉗子のセットと別と膝蓋骨と大腿骨の下端を持ち、除去のための共同の反対方向に膝蓋骨と周囲の組織を曲げます。その後、大腿骨から結合組織を残りきれい。鉗子でそれらを引き離し、反転シャーレのふたの上に置きます。膝蓋骨を捨てます。 </li><li> 1.7を繰り返します- 他の脚と1.13必要に応じて。必要に応じて輸送のための1ミリリットルの無菌HBSS-FCSを含む1.6ミリリットルのマイクロチューブに骨を移します。 </li><li> HBSS-の10ミリリットルを含むペトリ皿の底に骨を移すその後、まだ脛骨および大腿骨に取り付けられた任意の残留組織をきれいにするために鉗子を使用し、HBSS-FCSの2ミリリットル - 1で、反転したペトリ皿の蓋の上に骨を置きますFCS。また、骨をきれいにし、70％エタノールに浸した組織を用いて、添付の筋肉組織を取り除きます。 </li><li>ハサミで半分に骨のそれぞれをカット。皿の中の骨の滞在を確実にするために切断しながら、部分的に無菌の蓋付きペトリ皿を遮蔽します。あるいは、次のステップでフラッシングを可能にするために、各骨の端部を切断します。 </li><li> 1mlシリンジへの26½G針を取り付け、ペトリ皿から1ミリリットルHBSS-FCSを描きます。骨片の端部に針の先端を挿入し、骨髄細胞（骨内部の柔らかい赤組織）を洗い流します。頭の中に針を挿入骨と開放端の、すべての赤色骨髄が除去されるまで。色は白と骨を観察します。 </li><li>単一細胞懸濁液を形成するために、数回の注射器を介して骨髄の目に見える塊を渡します。 </li><li>フラッシュ骨を捨てます。よく細胞懸濁液を混合し、コレクションチューブに転送するために10ミリリットルのピペットを使用してください。皿に残留する細胞を収集するためにHBSS-FCSの5ミリリットルで一回ペトリ皿をすすぎます。細胞を氷上に置きます。 注：2のために保存した場合の骨髄細胞懸濁液が依然として生存可能である- 4℃で3時間。 </li></ol>骨髄細胞の2めっきおよび培養（のBMC） <ol><li>以下の試薬および消耗品を準備します。 <ol><li> 2 mMトリスpH7.2の最終溶液を0.84％の塩化アンモニウムを行うことで、赤血球（RBC）溶解緩衝液を調製し、次いで0.2ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌します。 </li><li> 10％FCS、20mMのHEPES、1×非必須アミノ酸、55＃を追加することによって、BMC媒体を準備181; RPMI培地1640 M 2-メルカプトエタノール、50 U / mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、および2mM L-グルタミン。 </li><li>市販の組換えGM-CSFを入手するか、GM-CSF遺伝子20をトランスフェクトしAG8.653骨髄腫細胞からの上清を含むGM-CSFを使用します。 ELISAによる上清中のGM-CSFの濃度を決定し、BMCメディアに20 ng / mlでの同等のものを追加します。 </li></ol></li><li> 5分間、314×gで骨髄細胞をスピンダウン。ペレットは、赤血球による赤です。 BSCでは、その後、RBC溶解緩衝液10mlを追加し、タップしてペレットを緩め、真空吸引に取り付けられた滅菌ガラスパスツールピペットを用いて上清を吸引除去します。渦は、細胞を再懸濁し、5分間室温でRBC溶解緩衝液中でインキュベートします。 </li><li> HBSS-FCSの10ミリリットルを追加し、その後5分間、314×gで細胞をスピンし、上清を吸引除去します。白い色として細胞ペレットを観察します。 BMCメディアの所望の体積で細胞を再懸濁します。 </li><li> RESUを数えます0.4％トリパンブルーで死細胞を染色した後、血球計数器を使用してspended細胞。 注：、片足（シングル脛骨および大腿骨）からの骨髄を使用する場合は、BMCメディアの5ミリリットル中に再懸濁し、10μlの細胞懸濁液を取り、青色の0.4％トリパン70μlのとそれを希釈し、よく混ぜおよび10μlのを転送血球計数器室に1/8細胞希釈。 4つの象限中の生存細胞の数：4象限のカウントの平均は、希釈係数×10 4 =ミリリットル当たりの細胞数をxは。 RBC溶解後に4×10 7細胞- 1の脚から大腿骨と脛骨は一般的に約2が得られます。 </li><li>培養の終了時に実験に必要とされる総細胞数に基づいて、下流の実験に必要な骨髄培養10mlの料理の数を推定します。 注： - 10×10 7日目6細胞の各ディッシュは、最初の播種及び収率で2×10 6の骨髄細胞5が必要です。 <ol><li>アリ、5分間、314×gでスピンダウンし、新しいチューブにメッキのための細胞の総数をQUOT上清を吸引し、BMC培地中4×10 6細胞/ mlで細胞を再懸濁。 </li></ol></li><li> GM-CSF（組換えまたは上清を含むGM-CSFから）200ngの含有BMC培地の9.5ミリリットルを持つ新しい滅菌100ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿を準備します。 10 mlの2×10 5細胞/ mlの最終濃度のために、ペトリ皿の中央に4×10 6細胞/ mlの骨髄細胞の500μLを加えます。 注 ：滅菌ペトリ皿ではない組織培養皿を使用することが重要です。セルを追加するときは、細胞が中央に集中し、播種後、メディアの変更中皿に乱れを最小限に残っていることを確認します。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。これは、培養中0日です。 </li><li> 3日目に、細胞の各ディッシュにGM-CSFの200 ngのを含有する新鮮なBMC培地の10ミリリットルを追加します。外乱Oを最小限に抑えるように注意してください懸濁液中の細胞を濃縮し、F。細胞培養物の総容量は、現在20 mlです。 </li><li> 100Xの倍率で光学顕微鏡下で細胞を観察します。多数の非接着細胞（丸）といくつかの接着細胞（フラット）を確認します。花の3つまたは​​4つの似た花弁の群における細胞は、増殖を示し、見ることができます。 </li><li> 6日目に半分の培地交換を行います。慎重に、滅菌50mlコニカルチューブにメディアの10ミリリットルを削除し、5分間314×gでスピンダウンし、吸引して上清を捨てます。 </li><li> GM-CSFの20 ngの/ mlを含有する新鮮なBMC培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁し、穏やかにボルテックスし、20mLの総容積の元の細胞培養皿に加えます。顕微鏡下で細胞を観察します。 注：7日目文化が付着平らな細胞と丸い非付着細胞の密な雲と密集度が70％以上である必要があります。 </li></ol> 3.収集し、フローサイトメトリーのためにBMDCとBMDMsの準備<ol> &lt;LI&gt; 4℃ですべてのバッファを保管してください。 </li><li>培養上清の10ミリリットルは、約30度、垂直皿を傾け、残りの10ミリリットルをピペットで皿を洗った後、50ミリリットルコニカルコレクションチューブに細胞を採取するために10日目に7日目から細胞を採取、最初の転送皿の上から文化の。この洗浄を5回、三分の一の皿を回転するたびに繰り返します。 </li><li>同じコレクションチューブに細胞の残りの10ミリリットルを移し、プレートと付着細胞を廃棄します。 注：洗浄は非接着および緩く接着細胞を除去します。フラット接着細胞を洗浄に耐性です。一般的に、5〜 -ルッツらが、10日目6細胞5×10 - 6、非接着細胞を7日目に一枚の板から期待されている10×10と2。 10日目で報告された10×10 6個の細胞を付着細胞を正常に取得されません。しかしながら、これらの細胞は、非接着性細胞と比較する必要がある場合次のように、それらを除去することができます。接着細胞を除去し、別のチューブに収集するために、非接着細胞を除去した後、皿に1×PBS、pH7.4中0.7 mMのEDTAの5ミリリットルを加え37℃で5分間インキュベートし、上下にピペット。 </li><li> 5分間、314×gで採取した細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。 4℃で5ミリリットルの滅菌BMC培地で再懸濁は、渦は穏やかに混合し、トリパンブルーと血球計数器を使用してカウントします。 注：各料理は5得られます- 7日目培養物から10×10 6非接着細胞を。今から、4℃で、すべての手順を実行します。 </li><li>フローサイトメトリー分析5mlのポリスチレン丸底チューブに2×10 5細胞を各試料の移送のために、それぞれに4°C（1× ​​リン酸緩衝生理食塩水、2mMのEDTAおよび2％ウシ血清アルブミン）でFACS緩衝液300μLを加えますサンプル。 </li><li> 5分間、314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。見える白、不透明なペレットを守ってチューブの底。 </li><li>非標識のFc受容体抗体の100μl中に再懸濁細胞（骨髄腫細胞株を作製する2.4G2から使用1/10上清）をFc受容体結合をブロックし、4℃で20分間インキュベートします。そして、静かにボルテックス、各サンプルに300μlのFACS緩衝液を追加し、5分間314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去します。 </li><li> 0.2μgの/ mlでのCD11c-PeCy7100μl中に細胞を再懸濁、0.25μgの/ mlの群Gr1、パシフィックブルー、0.05μgの/ mlのMHC​​II-APC、およびFL-HAは、約2μg/ mlのは、マクロファージや樹状細胞を識別します。 注：以前に21を説明したようにFL-HAは、フルオレセイン及び雄鶏櫛ヒアルロン酸ナトリウム塩を使用して社内で調製しました。 </li><li>細胞表面への結合を可能にするために4℃で20分間インキュベートします。その後、4℃で5分間314×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引、優しく渦、各サンプルに300μlのFACS緩衝液を追加します。注：バイオ場合蛍光ストレプトアビジンで9 - tinylated抗体が3.8を繰り返し、3.8で使用されています。 </li><li>混合し、5分間、314×gで細胞をスピンダウンするFACS緩衝液の別の300μlを、穏やかにボルテックスで細胞を洗浄。上清を吸引し、0.1を含むFACS緩衝液200μl中に細胞を再懸濁 - 非生存細胞を標識するためにヨウ化プロピジウムまたはDAPIの1mlあたり0.2μgのを。細胞は、今、フローサイトメトリー分析の22の準備ができています。 注：集団の詳細についての結果と図3を参照して 、どのように細胞をゲートしました。 </li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid.">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li><li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique.">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

本稿では、我々はルッツら 6から採用された単一のマウス骨髄培養からGM-CSF由来のマクロファージや樹状細胞を生成する方法を提供します。この培養中の未成熟DCおよびマクロファージを区別する結合MHCII発現およびFL-HAは、以前は困難であった、（ 図3Cを参照します）。これは、一緒にHelft ら 19による別のレポートで、以前はDCのみであると考えられ...

いくつかのin vitroでの培養方法は、骨髄由来マクロファージ（BMDMs）と1つの成長因子の組み合わせを使用して、骨髄由来DC（BMDCを）を生成することが記載されています。 BMDMsは、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、またはGM-CSF 1,2のいずれかを使用して骨髄細胞を培養することによって生成することができます。 BMDCのために、骨髄文化へのFLT3リガンドの添加は、培養3,4で9日後（ 高およびCD11c 見よ 、それぞれB220 + CD11cの高い / MHCII）非接着古典と形質DCに上昇を与えます。対照的に、GM-CSFと培養7〜10日後に生成された、非接着細胞単独5,6-、GM-CSFおよびIL-4 7、またはGM-CSFおよびFLT3リガンド8,9より密接炎症性DCを似たBMDCを生成（ 高いのCD11c、MHCII 高のCD11b +）10。これらのインビトロ培養は、マクロファージを生成するために使用されている間に各培養物は純粋な集団を生じさせる場合DCは、それは不明です。例えば、GM-CSF培養中の接着細胞は、それらが均質であり、任意の観察された変動がある推定でマクロファージ5、DCを6,11-13として使用されるのと同じ培養物からの非付着細胞であることが記載されているものの開発14,15の異なる段階に起因します。さらに、研究は、 インビボ 16,17 における肺胞マクロファージの発達のために必須の増殖因子であるGM-CSFを発見し、そして肺胞マクロファージ様16,17,18を生成するためにインビトロで使用することができます。 付着以外は、GM-CSF処理した骨髄培養物からのマクロファージ及び樹状細胞を生成するための手順は、GM-CSFの骨髄培養物内に存在し得る不均質性を示唆している非常に類似しています。これは、実際に2つの論文は、BMDC培養物の非付着画分におけるBMDMsの存在を報告としてケースのように思われます。 1論文で、彼らはidentifi最も密接に肺胞マクロファージに似ていたし、T細胞19を活性化する能力が低下していた遺伝子発現特性を発現したCD11c +、のCD11b +、MHCII 半ば 、MERTK +、およびCD115 +、などの細胞の集団を編。未熟（たCD11c +、MHCII 半ば 、 低 FL-HA）および成熟異なっていた肺胞マクロファージ様人口を識別するために、MHCIIとFL-HAを使用する第二の紙（たCD11c +、 ミッド/ロー MHCII、FL-HA 高 ）樹状細胞（のCD11cの+、 高 MHCII）、両方の表現型および機能的に18。これらの論文は、GM-CSF BMDC培養が不均一であることを示してBMDC培養物からのデータを解釈する際には注意すべきであることを示すマクロファージおよびDC集団の両方を含む両方。 このプロトコルは、骨髄、GM-CSFでの培養骨髄細胞を分離し、肺胞マクロファージ様を識別する方法について説明します結合およびMHCII発現FL-HAを使用して、フローサイトメトリーによる骨髄培養における未成熟および成熟DCから人口。 。この手順は、6ルッツらの確立された手順に基づいており、5生成することができるされている- 10ミリリットルの培養7日目に10×10 6非接着細胞を。文化は日から7〜10に使用可能であり、7日目これが成長し、大量にインビトロ肺胞のようなマクロファージを単離するための簡単な方法を提供するでマクロファージ、未成熟および成熟DC、だけでなく、いくつかの前駆細胞の不均一な集団を生成します。

<table><tbody><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>Automated Inverted Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 Gauge Needle</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*Falcon brand</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (1.5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polystyrene round bottomed tubes</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>*Various&amp;nbsp;</td><td>*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon brand</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Rooster Comb Sodium Hyaluronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Used to make fluoresceinated hyaluronan</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37&amp;nbsp;&amp;#176;C before using.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>5271-10&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Clone: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clone: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clone: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clone: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinylated Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>Goat polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and identification of gm-csf derived alveolar-like macrophages and dendritic cells from mouse bone marrow

マクロファージや樹状細胞（DC）は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしている組織やリンパ器官に見られる先天性免疫細胞です。しかし、それらは、それらを詳細に研究するために十分な数に分離することが困難であるため、 インビトロモデルが開発されている。骨髄由来マクロファージおよび樹状細胞のインビトロ培養物の免疫学的研究のための十分に確立され、有益な方法です。ここで、培養およびサイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を用いて、一次マウス骨髄細胞の単一培養物からのDCおよびマクロファージの両方を同定するための方法が記載されています。このプロトコルは、最初のルッツらによって開発された確立された手順に基づいています。骨髄由来DCの1999インチ文化は不均一であり、かつMHCIIおよび蛍光標識ヒアルロン酸（FL-HA）は、未成熟および成熟DCからマクロファージを区別するために使用されます。プロこれらのGM-CSF由来のマクロファージ密接に表現型および機能の両方に肺胞マクロファージに似ているインビトロ由来のマクロファージの便利な供給源を見よ。

この方法の主要なステップを要約するフローチャートを図1に示されている。培養の異なる時点での骨髄培養物の密度および形態を、図2に示されている。1日目に、細胞は、小さなスパースしかし3日目によるものですより多くの細胞が存在し、いくつかは大きく、数が付着し始めています。 6日目までに一定の接着性および非接着性画分（ <stro...

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Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K ビュー.  University of British Columbia. Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages. 

ビデオ: Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

生物学

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

免疫・感染学

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

新生児骨髄由来マクロファージの食作用アッセイ評価 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

著者スポットライト:新生児マウスから骨髄由来マクロファージを分離するための再現性のある方法の開発により、早期の免疫応答を促進

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

要約

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骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

骨髄由来マクロファージの生産

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製