Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119503) e le scienze e ingegneria Consiglio Naturale del Canada (NSERC). NSERC supportato anche borse di studio estive per YD e AA YD è sostenuto dalla University of British Columbia (UBC), con un premio borsa di studio di 4 anni, AA è supportato da CIHR con il premio di Master studente laureato (CGS-M). Ringraziamo Calvin Roskelley per l&#39;assistenza con il microscopio utilizzato per generare le immagini nella Figura 2. Riconosciamo inoltre sostegno da parte dei UBC animali e citometria a flusso strutture.

I topi sono stati sacrificati in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali per la ricerca animale etica da procedure approvate dalla University of Columbia Comitato Animal Care britannico. 1. L&#39;acquisizione di una singola cella di midollo osseo Sospensione dal mouse femore e tibia <ol><li> Accendere una cappa di sicurezza biologica (BSC) 15 minuti prima dell&#39;inizio della procedura per eliminare l&#39;aria mobile e consentire la stabilizzazione del flusso d&#39;aria, quindi pulire / spruzzo superficie BSC con il 70% di etanolo. Tenere tutto sterile come possibile per la totalità del protocollo. Non tagliare le ossa in condizioni non sterili. </li><li> Preparare strumenti di dissezione da immersione in etanolo al 70% (1 paio di forbici dissezione, 2 paia di pinze), soluzione salina bilanciata di Hank con il 5% di siero fetale bovino (HBSS-FCS), piastre sterili (100 mm x 15 mm), 1 siringhe ml, 26½ aghi calibro, provette per la raccolta coniche (15 ml o 50 ml), e asciugamani di carta del BSC. </li><li> Euthanize il mouse usandoprotocolli approvati dal comitato etico di ricerca animale dell&#39;istituzione. Portare in BSC, posto in cima ad uno o due asciugamani di carta e spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Nel BSC, aprire una sterile Petri in modo asettico, un&#39;aliquota di 10 ml di HBSS-FCS alla base e 1 - 2 ml al coperchio. </li><li> Posizionare il mouse sul suo stomaco con il dorso rivolto verso l&#39;alto e sollevare la pelle intorno alle sezioni del torace con le dita della mano non dominante. Usare le forbici per fare un&#39;incisione in cui viene sollevato la pelle. </li><li> Aggrappati a entrambe le estremità del taglio, una estremità con ogni mano e con attenzione separare la pelle intorno il mouse da dietro allo stomaco, continuare a tirare fino a due estremità dell&#39;incisione incontrano alla stomaco. </li><li> Capovolgere il mouse per lo stomaco rivolto verso l&#39;alto, e con una mano tirare la metà inferiore della pelle verso la gamba, continuare a tirare indietro la pelle fino a quando le gambe sono esposte. </li><li> Tenere il piede del mouse e tagliare i tendini di Achille sopra la caviglia ei legamenti che collegano i muscoli di fondo all&#39;estremità inferiore della tibia con le forbici. Ciò allenta il piede dalle ossa delle gambe. </li><li> Tenendo la gamba dal piede, tagliare i muscoli e legamenti con le forbici tutto il ginocchio all&#39;estremità inferiore del femore per tagliare i muscoli della coscia dal braccio inferiore. Utilizzare pinze per estrarre delicatamente i muscoli allentati dal perone e le superfici femorale. Fare attenzione a non recidere l&#39;arteria femorale per evitare gravi emorragie. </li><li> Con una mano aggrappata al piede, premere forbici giù aperti all&#39;estremità superiore del femore all&#39;articolazione dell&#39;anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente per separare il femore dall&#39;articolazione dell&#39;anca mentre usando le forbici per fare il taglio finale alla libera la gamba dal corpo. </li><li> Da questo punto in poi, contenere solo il tessuto con una pinza sterile. Tenere sulla gamba ad una estremità ed estrarre il piede sull&#39;altro. NOTA: Questo non dovrebbe richiedere molta forza, come i legamenti di collegamento sono tagliati in fase di1.9. In alternativa, tagliare la tibia appena sopra la caviglia dove si fonde l&#39;osso. </li><li> Tenere la gamba dalla estremità distale del femore con una serie di pinze e dell&#39;estremità prossimale della tibia e fibula con un altro, piegare accuratamente la tibia e perone nella direzione opposta del ginocchio per separarli dal femore e rotula. </li><li> Utilizzare pinze per tirare giù i restanti legamenti e muscoli ancora attaccati alle ossa delle gambe inferiori. Qui, rimuovere il perone insieme con i tessuti connettivi con pinze in quanto è troppo piccolo per essere lavata per le cellule del midollo osseo. Posizionare la tibia pulita sul coperchio capovolto piastra di Petri. </li><li> Tenere l&#39;estremità inferiore del femore con una serie di pinze e rotula con un altro, piegare la rotula e tessuti circostanti nella direzione opposta del giunto per la rimozione. Poi pulire restante tessuto connettivo dal femore; tirando via con una pinza, e posizionarlo sul coperchio capovolto piastra di Petri. Eliminare la rotula. </li><li> ripetere 1.7- 1.13 con l&#39;altra gamba, se necessario. Trasferire le ossa a 1,6 ml provette da microcentrifuga contenente 1 ml sterile HBSS-FCS per il trasporto se necessario. </li><li> Posizionare ossa sul coperchio piatto Petri invertita, con 1 - 2 ml di HBSS-FCS, utilizzare pinze per pulire qualsiasi tessuto residuo ancora attaccato alla tibia e femore, quindi trasferire le ossa alla base della piastra Petri contenente 10 ml di HBSS- FCS. In alternativa, pulire le ossa e rimuovere il tessuto muscolare collegata con un fazzoletto di carta imbevuto di etanolo al 70%. </li><li> Tagliare ciascuna delle ossa a metà con le forbici. Parzialmente schermare la piastra di Petri con un coperchio sterile durante il taglio per garantire le ossa rimangono nel piatto. In alternativa, tagliare l&#39;estremità di ogni osso per consentire lavaggio nel passaggio successivo. </li><li> Fissare il 26½ ago G alla siringa 1 ml, e redige 1 ml HBSS-FCS dalla piastra di Petri. Inserire la punta di un ago nella fine di un pezzo di osso e scovare le cellule del midollo osseo (tessuti molli rosso all&#39;interno delle ossa). Inserire l&#39;ago nella testadell&#39;osso e l&#39;estremità aperta, fino a quando tutto il midollo colore rosso viene rimosso. Osservare le ossa come di colore bianco. </li><li> Passare eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa alcune volte per formare una sospensione di cellule singole. </li><li> Eliminare le ossa arrossate. Utilizzare una pipetta 10 ml per mescolare la sospensione cellulare bene e trasferire al tubo di raccolta. Lavare la piastra di Petri una volta con 5 ml di HBSS-FCS per raccogliere le cellule residue nel piatto. Mettere le cellule in ghiaccio. NOTA: La sospensione di cellule del midollo osseo è ancora valida se immagazzinato per 2 - 3 ore a 4 ° C. </li></ol> 2. placcatura e la coltura di cellule del midollo osseo (BMC) <ol><li> Preparare i seguenti reagenti e materiali di consumo. <ol><li> Preparare rosso tampone di lisi dei globuli (RBC) facendo cloruro di ammonio 0,84% in una soluzione finale di 2 mM Tris pH 7,2, poi sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micron. </li><li> Preparare supporti BMC con l&#39;aggiunta del 10% di FCS, 20 mM HEPES, aminoacido non essenziale 1x, 55 &amp; #181, M 2-mercaptoetanolo, 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1 mM di sodio piruvato, e 2 mM L-glutammina a RPMI medio 1.640. </li><li> Ottenere disponibile in commercio ricombinante GM-CSF o GM-CSF usare contenente surnatante da AG8.653 cellule di mieloma trasfettate con il gene GM-CSF 20. Determinare la concentrazione di GM-CSF nel supernatante mediante ELISA e aggiungere l&#39;equivalente di 20 ng / ml ai media BMC. </li></ol></li><li> Centrifugare le cellule del midollo osseo a 314 xg per 5 min. Il pellet è di colore rosso, a causa di globuli rossi. Nel BSC, aspirare il surnatante con una pipetta di vetro sterile Pasteur collegato a vuoto di aspirazione, allentare il pellet toccando, quindi aggiungere 10 ml di tampone di lisi RBC. Vortex per risospendere le cellule e incubare in tampone di lisi RBC a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di HBSS-FCS poi girare cellule a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare il pellet cellulare come colore bianco. Risospendere le cellule in volume desiderato di supporto BMC. </li><li> Contare il Resu-cellule trascorsa utilizzando un emocitometro dopo colorazione cellule morte con il 0,4% trypan blu. NOTA: Se si usa il midollo osseo da una gamba (tibia singolo e femore), risospendere in 5 ml di mezzi BMC, prendere 10 ml di sospensione cellulare e diluire con 70 ml di 0,4% trypan blu, mescolare bene e trasferire 10 ml di la diluizione 1/8 cella alla camera emocitometro. Contare le cellule vitali in quattro quadranti: la media dei quattro quadranti conteggi x fattore di diluizione x 10 4 = numero di cellule per ml. Un femore e tibia da una gamba generalmente produrrà circa 2 - 4 x 10 7 cellule dopo RBC lisi. </li><li> Stima il numero di 10 ml piatti di colture di midollo osseo necessari per gli esperimenti a valle in base al numero di cellule totali necessari per esperimenti alla fine della cultura. NOTA: Ogni piatto richiede 2 x 10 6 cellule del midollo osseo a seeding iniziale e rendimenti 5 - 10 x 10 6 cellule a giorno 7. <ol><li> Aliquot il numero totale di cellule per la placcatura in una nuova provetta, centrifugare a 314 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante, e risospendere le cellule a 4 x 10 6 cellule / ml in mezzi BMC. </li></ol></li><li> Preparare una nuova sterile 100 millimetri x 15 mm piastra Petri con 9,5 ml di mezzi BMC contenente 200 ng di GM-CSF (ricombinante o da GM-CSF contenente surnatante). Aggiungere 500 ml di i / cellule del midollo osseo ml 4 x 10 6 cellule al centro del piatto Petri per la concentrazione finale di 2 x 10 5 cellule / ml in 10 ml. NOTA: E &#39;importante utilizzare un non piastra di Petri sterile un piatto di coltura di tessuti. Inoltre, quando si aggiungono le cellule, affinché le cellule rimangono concentrate al centro e minimizzare il disturbo ai piatti dopo la semina e durante le modifiche di supporto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2. Questo è il giorno 0 nella cultura. </li><li> Il giorno 3, aggiungere 10 ml di mezzi freschi BMC contenente 200 ng di GM-CSF per ogni piatto di cellule. Fare attenzione a minimizzare il disturbo of cellule concentrati in sospensione. Il volume totale di coltura cellulare è ora 20 ml. </li><li> Osservare le cellule sotto il microscopio ottico a ingrandimento 100X. Osservare numerose cellule non aderenti (rotonde) e un paio di cellule aderenti (piatti). Le cellule in gruppi di tre o quattro petali che ricordano di un fiore può essere visto, indicando la proliferazione. </li><li> Il giorno 6 eseguire un cambiamento mezzo dei media. Rimuovere con cautela 10 ml di media in un tubo da 50 ml conica sterile, spin down a 314 xg per 5 minuti, aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di media BMC freschi contenenti 20 ng / ml di GM-CSF, delicatamente vortice e aggiungere al piatto originale coltura cellulare per un volume totale di 20 ml. Osservare le cellule sotto il microscopio. NOTA: Giorno 7 cultura dovrebbe essere al 70% o superiore in confluenza con cellule piatte aderenti e nuvole dense di cellule non aderenti rotonde. </li></ol> 3. Raccolta e preparazione BMDC e BMDMs per citometria a flusso <ol> &lt;li&gt; Mantenere tutti i buffer a 4 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule dal giorno 7 al giorno 10. Per raccogliere le cellule, primo trasferimento 10 ml del surnatante cultura ad un tubo da 50 ml conica di raccolta, quindi inclinare il piatto in verticale di circa 30 gradi e lavare il piatto pipettando i restanti 10 ml della cultura dalla parte superiore del piatto. Ripetere questo lavaggio 5 volte, ogni volta ruotare la piastra di un terzo. </li><li> Trasferire i restanti 10 ml di cellule per lo stesso tubo di raccolta e scartare la piastra e cellule aderenti. NOTA: I lavaggi saranno rimuovere le cellule non aderenti e vagamente aderenti; le cellule aderenti piatte sono resistenti ai lavaggi. Tipicamente, tra 5 - 10 x 10 6 cellule non aderenti sono attesi da una piastra al giorno 7 e 2 - 5 x 10 6 cellule a giorno 10, anche se Lutz et al. segnalati 10 x 10 6 cellule al giorno 10. Le cellule aderenti non vengono normalmente adottate. Tuttavia, se queste cellule devono essere confrontati con le cellule non aderenti, Possono essere rimossi come segue. Aggiungere 5 ml di 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 al piatto dopo che le cellule non aderenti sono rimossi, incubare a 37 ° C per 5 min, pipetta su e giù per rimuovere le cellule aderenti e raccogliere in un tubo separato. </li><li> Spin giù le cellule raccolte a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere in 5 ml sterile supporto BMC a 4 ° C, vortice delicatamente per mescolare, e contare utilizzando trypan blu e emocitometro. NOTA: Ogni piatto sarà resa 5 - 10 x 10 6 cellule non aderenti da una cultura giorno 7. D&#39;ora in poi, eseguire tutti i passaggi a 4 ° C. </li><li> Per l&#39;analisi citofluorimetrica, trasferimento 2 x 10 5 cellule per ciascun campione in 5 ml di polistirene provette con fondo arrotondato, aggiungere 300 ml di tampone FACS a 4 ° C (1x tampone fosfato, 2 mM EDTA e 2% di siero albumina bovina) a ciascun campione. </li><li> Spin le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare bianco, pellet opaca visibile alfondo della provetta. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di non marcata recettore Fc Ab per bloccare il recettore Fc vincolante (Usa 1/10 surnatante da 2.4G2 producendo linea cellulare di mieloma) e incubare per 20 minuti a 4 ° C. Quindi aggiungere 300 ml di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di CD11c-PeCy7 a 0.2 mg / ml, Gr1-Pacific Blue a 0.25 mg / ml, MHCII-APC a 0,05 mg / ml, e FL-HA a circa 2 mg / ml per identificare i macrofagi e le cellule dendritiche. NOTA: FL-HA è stata preparata in casa con fluoresceina e gallo pettine sale sodico dell&#39;acido ialuronico come descritto in precedenza 21. </li><li> Incubare per 20 minuti a 4 ° C per consentire il legame alla superficie cellulare. Aggiungere 300 pl di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare celle in basso a 314 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. NOTA: Se bioGli anticorpi tinylated sono utilizzati in 3.8, ripetere 3,8-9 fluorescente-streptavidina. </li><li> Lavare le cellule con altri 300 ml di tampone FACS, delicatamente vortice di mescolare e centrifugare le cellule a 314 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di tampone FACS contenente 0.1 - 0.2 mg per ml di ioduro di propidio o DAPI per etichettare le cellule non vitali. Le cellule sono ora pronti per l&#39;analisi di citometria di flusso 22. NOTA: vedere i risultati e la Figura 3 per i dettagli delle popolazioni e di come le cellule sono state gated. </li></ol>

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J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells:+'Exhausted'+or+Alert+and+Waiting.">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li><li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions.">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li><li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid.">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li><li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique.">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

In questo manoscritto, forniamo un metodo per generare macrofagi e cellule dendritiche GM-CSF derivati ​​da una singola coltura di midollo osseo di topo che è adattato da Lutz et al. 6. Espressione MHCII e FL-HA distingue tra DC immature e macrofagi vincolante in questa cultura (vedi Figura 3C), che in precedenza è stato difficile. Questo, insieme con un altro rapporto da Helft et al. 19, dimostra l&#39;eterogeneità all&#39;interno di GM-CSF culture BMDC in...

Diversi metodi in vitro di coltura sono stati descritti per generare osso macrofagi derivate dal midollo (BMDMs) e DC derivate dal midollo osseo (BMDCs) utilizzando uno o una combinazione di fattori di crescita. BMDMs può essere generato da coltura di cellule di midollo osseo utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Per BMDCs, l&#39;aggiunta di FLT3 ligando alla cultura midollo osseo comporta non aderenti DC classici e plasmacitoidi (alta CD11c / MHCII alta e CD11c lo, B220 + rispettivamente) dopo 9 giorni di coltura 3,4. Al contrario, le cellule non aderenti generati dopo 7 a 10 giorni in coltura con solo GM-CSF 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF e FLT3 ligando 8,9 generano BMDCs più da vicino assomiglia DC infiammatorie (alta CD11c, MHCII alta CD11b +) 10. Mentre queste colture in vitro sono utilizzati per generare macrofagi oDC, non è chiaro se ogni cultura dà luogo a popolazioni puri. Ad esempio, anche se le cellule aderenti nelle colture GM-CSF sono descritti come macrofagi 5, le cellule non aderenti dalla stessa cultura vengono utilizzati come DCS 6,11-13, con la presunzione che sono omogenei e ogni variabilità osservata è a causa di diversi stadi di sviluppo 14,15. Inoltre, gli studi hanno trovato GM-CSF di essere un fattore di crescita essenziale per lo sviluppo dei macrofagi alveolari in vivo 16,17, e può essere impiegato in vitro per generare macrofagi alveolari simile 16,17,18. Oltre aderenza, le procedure per la generazione di macrofagi e cellule dendritiche da GM-CSF trattata colture di midollo osseo sono molto simili suggerendo eterogeneità possono esistere all&#39;interno di GM-CSF colture di midollo osseo. Questo sembra davvero essere il caso come due documenti segnalare la presenza di BMDMs nella frazione non aderente di culture BMDC. In un articolo, che identified una popolazione di cellule come CD11c +, CD11b +, MHCII metà, MerTK + e CD115 +, che ha espresso una firma espressione genica che più assomigliava macrofagi alveolari e aveva una ridotta capacità di attivare le cellule T 19. La seconda carta utilizzata MHCII e FL-HA per identificare una popolazione macrofago-come alveolare (CD11c +, MHCII medio / basso, FL-HA alto), che è stato distinto da immaturi (CD11c +, MHCII metà, FL-HA basso) e maturo DC (CD11c +, MHCII alto), sia fenotipicamente e funzionalmente 18. Queste carte entrambe illustrano che le culture GM-CSF BMDC sono eterogenei, contenente sia macrofagi e le popolazioni DC che indicano che si deve prestare attenzione quando si interpretano i dati provenienti da culture BMDC. Questo protocollo descrive come isolare il midollo osseo, cellule del midollo cultura ossee in GM-CSF, e identificare il alveolari macrofago-likepopolazione dalle DC immature e mature nella cultura midollo osseo di citometria a flusso utilizzando FL-HA vincolante e di espressione MHCII. Questa procedura è basata sulla procedura stabilita Lutz et al 6 ed è in grado di generare 5 -. 10 x 10 6 cellule non aderenti il giorno 7 di una cultura 10 ml. La cultura è utilizzabile da 7 a 10 giorni e produce una popolazione eterogenea di macrofagi, cellule dendritiche immature e mature, così come alcuni progenitori al giorno 7. Questo fornisce un metodo semplice per crescere e isolare in vitro macrofagi alveolari simili in grandi quantità.

<table><tbody><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>Automated Inverted Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 Gauge Needle</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*Falcon brand</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (1.5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polystyrene round bottomed tubes</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>*Various&amp;nbsp;</td><td>*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon brand</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Rooster Comb Sodium Hyaluronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Used to make fluoresceinated hyaluronan</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37&amp;nbsp;&amp;#176;C before using.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>5271-10&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Clone: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clone: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clone: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clone: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinylated Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>Goat polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and identification of gm-csf derived alveolar-like macrophages and dendritic cells from mouse bone marrow

I macrofagi e le cellule dendritiche (DC) sono cellule immunitarie innate trovati nei tessuti e negli organi linfoidi che giocano un ruolo chiave nella difesa contro gli agenti patogeni. Tuttavia, essi sono difficili da isolare in numero sufficiente per studiarli in dettaglio, di conseguenza, sono stati sviluppati modelli in vitro. In vitro culture di osso macrofagi derivate dal midollo e cellule dendritiche sono metodi di valore ben consolidati e per gli studi immunologici. Qui, un metodo per la coltura e l&#39;identificazione sia DC e macrofagi da una sola coltura di cellule del midollo osseo principale del mouse utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi citochina (GM-CSF) è descritto. Questo protocollo si basa sulla procedura stabilita prima sviluppato da Lutz et al. nel 1999 per l&#39;osso DC derivate dal midollo. La cultura è eterogenea, e MHCII e acido ialuronico fluoresceinato (FL-HA) sono utilizzati per distinguere i macrofagi da DC immature e mature. Questi GM-CSF derivato macrofagi provide una comoda fonte di in vitro macrofagi derivati ​​che ricordano da vicino macrofagi alveolari sia in fenotipo e la funzione.

Un diagramma di flusso che sintetizza le fasi principali di questo metodo è illustrato in Figura 1. La densità e la morfologia della cultura midollo osseo in diversi momenti della coltura sono mostrati in Figura 2. Al giorno 1, le cellule sono piccole e sparse, ma al giorno 3, ci sono più celle, alcuni sono più grandi e alcuni hanno cominciato ad aderire. Di giorno 6 c&#39;è un aderente definito e frazione non aderente (Figura 2A). ...

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Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K Views.  University of British Columbia. Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages. 

Video: Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Ricerca

Biologia

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Immunologia e infezioni

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Valutazione del test fagocitario dei macrofagi derivati dal midollo osseo neonatale 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo riproducibile per isolare i macrofagi derivati dal midollo osseo da topi neonatali per far avanzare le risposte immunitarie precoci

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

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