この作品は、JDRF 1-FAC-2014から243-AN APF、ADA、BCMにおける糖尿病研究センター（P30-DK079638）のパイロット/フィージビリティプログラム、MLBにNIH（5K22A1119151-01と1R56DK104903-01）からの助成金によってサポートされていました1-15-JF-07、MBに免疫フェローシップ、およびロバートとジャニス・マクネア財団でAAI採用。

倫理文：あらゆる努力を照射し、尾静脈注射時に最小限に動物の不快感やストレスを維持するために行われます。マウスをこれらの実験における細胞の供給源として使用されます。以下のような何の手順や操作が安楽死から離れてはありません。マウスは死を確認するために、頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によって安楽死させます。この手順では、アメリカ獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。 1.レトロウイルス構築物を準備します<ol><li>サブクローンT細胞受容体（TCR）αおよびβ鎖は、MSCVベースのレトロウイルス11ベクター（例えば、pMIAIIまたはpMIGII）11内に、図2（a）のリンカーによって分離されます。 注：図2（a）リンカーは単一のオープンリーディングフレームからのαおよびβTCR鎖の化学量論と一致発現を可能にします。ベクターがするために使用されるIRES蛍光タンパク質カセット（アメトリンまたはGFP）が含まれ形質導入した細胞と形質導入効率を追跡します。詳細なプロトコルの場合ホルストらを参照してください。11 </li><li>商業的に得られた血漿プレップキットまたは類似の製品を使用してプラスミドDNAを単離します。 μlの2μgの-1 - 1の作業濃度を使用してください。 </li></ol>レトロウイルスプロデューサー細胞株の2世代<ol><li>レトロウイルスプロデューサー細胞株を生成するために二段階のプロセスを利用します。 注：詳細なプロトコルでは、ホルストら 11を参照してください。 <ol><li> 3つのプラスミド（pVSVG、PEQ-Pam3（-E）および利息11のベクトル）と293T細胞の一過性トランスフェクションによって、レトロウイルスを生成し、GP + E86エコトロピックレトロウイルスプロデューサー細胞株を形質導入した293T細胞からのレトロウイルス上清を取ります。 </li><li> FACSによってGP + E86プロデューサーを発現する細胞の蛍光の上部40％を隔離し、ウイルスのソースとしてtransdcuced-GP + E86プロデューサー細胞を増殖させます。 注：世代高力価生産の骨髄細胞の効率的な形質導入のために重要です。完全なプロトコルについてはホルストらをご覧ください。11 </li></ol></li></ol> 3.レトロウイルス媒介性の幹細胞の遺伝子導入（日-5） <ol><li>このプロトコルの0日によって2コンフルエント150 mmプレートのための十分な成長を可能にするために、完全DMEM中の各GP + E86のプロデューサー細胞株10％（体積/体積）のFBS 0.5 -1.0×10 6を解凍し、文化。 注：解凍0.5 -また、GP + E86を拡大するために5日間の培養を可能にします。この5日目で50％の密集度- 10cmプレート内の各GP + E86プロデューサー細胞株の1.0×10 6、30を可能にします0日目で2コンフルエント150 mmプレートにプロデューサー細胞株。 <ol><li> 5％フェタチーズウシ血清、及びマイコプラズマ汚染を避けるために、シプロフロキサシン（10μg/ ml）を含む完全組織培養培地中で培養レトロウイルスプロデューサー細胞株。 注：シプロフロキサシンの使用を中止するときgeneratinグラム骨髄形質導入のためのウイルス上清。これは負の骨髄形質導入効率に影響を与えるように、プロデューサー細胞株の過剰成長は避けてください。 </li></ol></li></ol> 5-フルオロウラシル（5-FU）（3日目）4.注入するドナーマウス<ol><li>必要な5-FUの量を決定するために - （12週齢5）ドナーマウスを秤量します。低骨髄収率の年齢結果の5週間よりも若いマウスを用いました。単一のTCRの発現を確実にするために、このようなSCID、RAGまたは骨髄ドナーとしてTCRアルファ欠損マウスなどのT細胞欠損マウス系統を使用します。 </li><li>組織培養フード内で作業し、10ミリグラムmlのに十分な量-1体重のグラムあたり0.15 mgの5-FUを送達するための5-FUのワーキング溶液を作製するために、無菌PBSで5-FUのストックを希釈します。 </li><li> 37 G針で1mlシリンジを用いて、腹腔内に、ドナーマウスあたり体重のグラムあたり0.15 mgの5-FUを注入します。 注：起動し、調整するために、1つの受信者ごとに1ドナーマウスを使用しています細胞収量に応じてドナーマウスの数。骨髄前駆細胞の濃縮および単離のための5-FUの治療の代替方法は、ビレらに記載のように系統陽性細胞の負の選択です。 </li></ol> 5.骨髄抽出手順（0日目） <ol><li>骨の単離のために解剖ハサミとピンセットを取得します。メディアを準備50mlコニカルチューブ内の骨を収集するために（HBSSは5％FCS（体積/体積）を補いました）。氷上に培地を含有する50ミリリットルの円錐形をしてください。死を確認するために頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によりマウスを安楽死させます。全く反射が検出されない保証するために、足をピンチ。 </li><li>エタノールまたはメタノールで手術部位や手術器具を滅菌します。最初に切断することにより骨盤ガードルの下に慎重に大腿骨、脛骨、上腕骨、および骨盤ガードルを削除します。バックダウン脛骨大腿骨に沿ってカットします。きれいな骨を得るために、ハサミやピンセットを使用して、すべての周囲の組織を削除します。キープHBSS + 5％（体積/体積）FBS中で水和骨。 </li><li>両者がそれぞれの骨をオフに終了カットすることを確認して、関節で切断することにより骨を区切ります。 HBSS + 5％（体積/体積）FBSを含む10 mlの注射器に取り付けた25ゲージの針を挿入します。圧力を適用し、50ミリリットルの円錐で70μmのストレーナ休憩を介してすべての骨髄をフラッシュします。 </li><li>定期的に、1ミリリットルまたは3ミリリットルシリンジからプランジャーを使用して、70ミクロンのフィルターを通して骨髄を押してください。 HBSS + 5％（体積/体積）FBSでストレーナーを洗浄します。これは、骨片と組織のない単一細胞懸濁液を確実にします。無菌フードの手順を実行することにより、無菌細胞を保管してください。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離した骨髄細胞。 </li></ol> 6.骨髄文化（0日目） <ol><li>デカントまたは培地を吸引し、50mlコニカルチューブ当たり1ミリリットル塩化アンモニウムベースの赤血球溶解バッファー（またはRBC溶解バッファー相当）で再懸濁細胞ペレット。室温で1分間インキュベートした後温度は、完全DMEM 10mlの20％（容量/容量）FBSを添加することにより、赤血球溶解緩衝液をクエンチしました。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離細胞。 </li><li>デカントまたは5ミリリットル完全DMEM 20％（体積/体積）FBSで吸引上清および再懸濁骨髄。ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 注：一般的な収率は約5であるべきである-マウスあたり10×10 6細胞;しかし、収量は、マウスの異なる系統間で異なることができます。 </li><li> IL-3（20gのミリリットル-1）を補充した完全DMEM 30ml中の150 mmのプレートあたり4×10 7細胞を、20％（体積/体積）の濃度でプレート骨髄細胞FBS、IL-6（50 Gミリリットル-1）およびSCF（50gのミリリットル-1）。 注：解凍したての-等分しサイトカインを使用してください。 2週間以上4℃で凍結させ、複数回解凍または保たれてきたサイトカインを使用しないでください。 </li><li> 5％CO 2で37℃で一晩骨髄（約24時間）インキュベートします。 </li></ol><ol><li> 18ミリリットルで150 mmのプレートあたりプレート3×10 6レトロウイルス産生細胞を完全DMEM 20％（体積/体積）FBS。 </li><li> 37℃で一晩レトロウイルスプロデューサー細胞をインキュベートします。 （ - 3ドナーマウスの約2）1500万骨髄細胞のための1つの150 mmのプレートを見込んでいます。 </li></ol> 8.レトロウイルス上清（1日目） <ol><li>翌日（約24時間後）、10-mlの注射器およびフィルタは0.45を使用して150 mmのプレートのから直接レトロウイルス上清を描画することにより（ステップ7で設定）プロデューサープレートからのレトロウイルス上清を収穫-μmシリンジフィルター。 </li><li>慎重に新鮮な完全DMEM 20％（体積/体積）FBSの18ミリリットルで削除されたレトロウイルス上清を交換してください。 </li><li> 、（G ml -1の20）IL-6（50グラムミリリットル-1）、MSCF（50グラムミリリットル-1）、ヘキサジメトリンブロミド（ポリブレン）（6＆をIL-3で濾過レトロウイルス上清を補完＃956; Gミリリットル-1）。 注：臭化ヘキサジメトリンは、レトロウイルス形質導入の有効性の低下を回避するために、2ヶ月ごとに新鮮されるべきです。 </li></ol> 9.骨髄収穫（1日目） <ol><li>ステップ8.3が完了した後、ステップ6.4から骨髄細胞を採取し、無菌の50ml試験管に、非付着細胞を含有する培地を移します。 </li><li>勢いよく10ミリリットルのPBSでプレートを洗浄し、ステップ9.1から50ミリリットルの円錐に集めます。必要に応じて、洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>遠心し、4℃で10分間、300×gで細胞、上清をデカント、小容量で再懸濁細胞（1〜3ミリリットル）完全DMEM 20％（体積/体積）FBS、およびカウントされます。サイトカインおよびヘキサジメトリンブロマイドを含むレトロウイルス上清の1ミリリットル当たり1×10 6個の細胞で、0日目に再懸濁し、骨髄から75％回復- 50を期待しています。 </li></ol> 10.骨髄形質導入（1日目） <ol><li>レトロウイルス上清/骨ミリアンペアのプレート6ウェル組織培養プレート中にウェルあたり3 mlの容量でrrow混合物。ステップ10.2での遠心分離中のガス交換を最小限にするためにラップでプレートを包みます。 </li><li> 60分、37℃、1000×gで包まれた6ウェルプレートスピン。 </li><li>スピンが完了した後、ラップを除去し、24時間、37℃のCO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol> 11.レトロウイルス上清および形質導入（2日目） <ol><li> 24時間後、ウイル​​スプロデューサー細胞株からの新鮮なウイルス上清を収集します。 10-mlシリンジおよび0.45μmのシリンジフィルターを使用してレトロウイルス上清をフィルタリングします。 IL-3（20 gでミリリットル-1）、IL-6（50 gでミリリットル-1）およびSCF（50 gでミリリットル-1）および臭化ヘキサジメトリン（6グラムミリリットル-1）でろ過レトロウイルス上清を補います。 </li><li>次に、注意深くピペットで除去または骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルからのメディアのトップ2ミリリットル吸引。 注：作業は慎重に、通常、ウェルの中央に集中している骨髄を、吸引しません。あるいは、上清を除去したが、任意の失われた骨髄細胞を回収するためにスピンダウンすることができます。 </li><li>骨髄6ウェルプレートの各に十分にはサイトカインおよびヘキサジメトリンブロマイドを含む新鮮なウイルス上清の3ミリリットルを追加します。プラスチックでプレートを包み、60分、37℃、1000×gでスピン伝達を繰り返します。プレートをアンラップし、37℃、5％CO 2で一晩（約24時間）で細胞をインキュベートします。 </li></ol>フレッシュ補充したDMEM（3日目）の12追加<ol><li> 24時間後、工程11.2と同様に、骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルからのメディアのトップ2ミリリットル取り除きます。 （グラムml -1の50）、IL-3の最終濃度で補充し、新鮮なDMEM 20％（体積/体積）FBSを（20グラムミリリットル-1）を削除したメディアを交換して、IL-6（50グラムミリリットル-1）とSCF 。 </li><li>骨髄をインキュベートさらに24時間、37℃のCO 2インキュベーターでプレート。 </li></ol> 13.収穫形質導入骨髄（4日目） <ol><li> 24時間後、6ウェルプレートからの骨髄細胞を収集します。すべての非接着細胞を除去するためにPBSと激しくプレートを洗ってください。 <ol><li> 4℃で10分間、300×gで細胞を遠心分離し、上清をデカントします。 </li><li> PBS + 0.5％（体積/体積）の少量（1ml）中の骨髄熱不活性化FBSを再懸濁します。細胞を氷上に保管してください。 </li></ol></li><li>各骨髄条件の10μlのサンプルを取り、ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 1と仮定すると-受信者ごとに2ドナーを、収率がレシピエントマウスあたり少なくとも4×10 6個の細胞を転送するのに十分であろう。マウスあたり300μlの - 200を注入するために、PBS + 0.5％（容量/容量）熱不活性化FBSのに十分な量で骨髄を再懸濁します。 <ol><li>形質導入効率で、少なくとも2×10 6個の細胞を注入し25％の静脈内投与マウスあたり（8×10 6個の細胞まで注入することができます）。 注：私たちは日常的に骨髄細胞の2つの6ウェルプレートあたり5レシピエントマウスを注入します。収率は実質的に低い場合には、十分な骨髄数が得られるまで、より多くのドナーマウスを使用すべきです。最適な再構成を達成するために、少なくとも5×10 5の形質導入（蛍光陽性）各受信者に注入されるべきです。 </li></ol></li><li>マイクロピペットを用いて、各骨髄条件の10μlのサンプルを採取し、蛍光マーカー（ 図1A）11の発現に基づいて、フローサイトメトリーにより形質導入効率を分析します。 注意：一般的に、蛍光陽性細胞のパーセンテージは、構築物およびレトロウイルスの力価に応じて、25％と70％の間です。サブ致死的照射マウスは形質導入効率に応じて変えることができる再構成するために必要な形質導入骨髄細胞の数。 TRAN下逆にsduction効率、必要以上の骨髄細胞と、骨髄形質導入効率が高い、再構成のために必要な細胞数が少ないです。 25％以下の導入効率は準最適であり、不十分な再構成および生存をもたらすことができます。最適な骨髄の回復及び形質導入効率を確保するために、新たに調製した組織培養培地およびサイトカインを使用します。 retrogenicシステムを活用した新たなTCRを発現させる場合、 生体内でのそのTCRの選択は不明です。各個々のTCRの親和性に依存して、胸腺および末梢T細胞発現におけるTCRの選択17を変化します。 </li></ol> 14.マウスの照射、骨髄注入とケア<ol><li>骨髄注入（ステップ13と同じ日）の前日、マウスを照射します。 scidマウス、300ラド）; - / -マウス、500ラドRAG1 C57BL / 6マウス（および他の野生型株）、900ラド：以下の用量を使用してください。 <ol><li>アモキシシリンに置きレシピエントマウス（50mg / kg /日）または照射前の別の抗生物質、水処理、および骨髄注射の後の最初の2週間は抗生物質を続けます。 注：最適な照射量は、経験的に決定されなければなりません。 </li></ol></li><li>注射のために、すぐに注射する前に、ブラント針を使用して、1-mlの注射器にステップ13.1から細胞をロードし、その後、空気塞栓症を避けるために、任意の空気を追い出す、注射のために27ゲージに針を変更します。熱マウス加熱ランプ下で静脈内にマウス当たり骨髄の0.2ミリリットルを注入。 注：細胞は、時間の任意の長さのために、注射器に座ってさせてはいけないか、細胞が沈降します。 </li><li>彼らは健康を維持することを確実にするために、毎週マウスを監視します。 </li><li> 5の後- 6週間、GFP + /アメトリン+とTCRの共発現（ 図1B）11に基づいて再構成をチェックするために、マウスを出血。 </li></ol>

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利害の衝突が宣言されていません。

最適な骨髄健康、導入効率および再構成を確保するためのプロトコルでは、我々の詳細のいくつかの重要なステップ。最初の重要なステップが発生し、GP + E86ウイルス産生細胞の適切なメンテナンスです。使用初期継代のプロデューサー細胞株、使用前に80％の密集度以下に維持します。 48時間 - 新鮮GP + E86ウイルスプロデューサー細胞を作製すると、293T細胞は、継代早期および24のために文?...

ヒトおよびマウスのT細胞受容体（TCR）のレパートリーは、1×10 8および2×10 6個のユニークなTCRをそれぞれ1,2と推定されています。この大きな多様性は、T細胞が自己ペプチドから、ならびに抗原提示細胞（APC）上の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）により提示される病原体由来の抗原エピトープの広大な配列を認識することができます。ユニークなペプチド - MHC複合体とTCRの相互作用の微妙な違いは、T細胞がアポトーシス、アネルギー、活性化、分化、サイトカイン産生や細胞毒性を受けるかどうかを決定します。しかし、大規模なTCRレパートリーに、特定のTCRは、特定の抗原に反応するかの分析は、単一のTCRのシステムを使用する必要があります。 様々なTCRトランスジェニックマウスは、in vivoモデル3-9で単一のTCRの機能を研究するために生成されています。しかし、を含むトランスジェニックマウスをTCRする注意点がありますコスト、単一のトランスジェニックマウスおよび生殖細胞系列DNA 10にランダムな導入遺伝子挿入のいわゆる創始者効果を生成するための時間の長さ。そのため、比較的少数のTCRトランスジェニックマウスは、任意の所与の抗原に対して生成されており、同じエピトープのための高および低TCRの親和性の機能的な意味はほとんど対処されていません。画面への迅速なアプローチの必要性に対処し、個別にまたは組み合わせて、複数のTCRを研究するために、retrogenic（レトロウイルスから「レトロ」およびトランスジェニックから「ジェニック」）マウスは、トランスジェニックマウス11-13を TCRするための代替として利用されてきました。 いくつかのウイルスの中に見つかった2Aペプチドのコンセンサスモチーフは、切断は2Aのグリシンおよび2Bのプロリンとの間で発生する、2A-ASP-ヴァル/イルGLUT-X-ASN-プロのGly-2B-プロで構成されシス -acting加水分解酵素活性から、翻訳10,14-16間にリボソームスキップが生じます。 Cを描いた詳細図については様々な2Aペプチド（F2A、E2A、T2AとP2A）のleavage参照10を参照してください - このように12、2シストロン（TCRαおよびTCRベータ）は、単一のベクター中の化学量論的な翻訳結果としてリンクすることができます。このアプローチを利用して、我々が発現し、in vivoで直接複数の抗原特異的TCRを比較することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose + glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 um syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>194-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-10G</td>
			<td>Sterile Filtered in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ61970-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil (5-FU)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M solution</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strept</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um nylon cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC0033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;PHC0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC2113L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>46-D13-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HANKS Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21020147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

骨髄代表骨髄伝達図（ 図1A）で尾静脈を静脈内に注入される前に、骨髄の形質導入効率を収穫骨髄の約10μLの100-μlに添加し、プロトコルのステップ13.3において確認されますPBSおよびアメトリン発現について分析しました。一般に、蛍光陽性細胞のパーセンテージは、構築物およびレトロウイルスの力価に応じて、25％と70％の間です。 6週間後、骨髄注射?...

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Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K ビュー.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

免疫・感染学

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

要約

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に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

骨髄由来マクロファージの生産

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

生成

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

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に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

骨髄由来マクロファージの生産

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

生成

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル