この作品は、シンガポールNRFの交わり（NRF-2011NRF-NRFF001-025）ならびにCBRG（NMRC / CBRGは/ 0070/2014）によって賄われていました。

注：この研究の文脈で目的のRNAは、AR 3&#39;UTRの断片です。 ビオチン標識RNAの調製<ol><li> RNAを得るために、市販のキットを用い、製造業者の指示11を以下のインビトロ転写に続いて、PCRによってT7-AR-オリゴを増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：T7-AR-FおよびT7-AR-R。 </li><li>非特異的結合を制御するために、 インビトロ転写、続いpsiCHECK-2プラスミドからPCRによってホタルルシフェラーゼ（FL）、DNAの部分配列を増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：hluc（+） - T7-プローブ-Fとhluc（+） -プローブ-R 表4 PCR増幅のための鋳型とプライマーの配列。。。 </li><li> 50μlのPCR反応のために、50 ngのDNAを（オリゴまたはプラスミド）を混ぜて、4μlのdNTPを（各個々のdNTP 2.5 mMの）、5μlの10×反応緩衝液、1μlの2.5 U /＆＃181;リットルのDNAポリメラーゼ、2μlの10μMのフォワードプライマー、2μlの10μMのリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリー水。 <ol><li>以下のプログラムを使用して、サーマルサイクラーでのPCR増幅を実行します。 STEP1：2分間95℃での一回; STEP2：30秒（AR）または60秒（FL）のための30秒、72℃30秒間、95℃の35サイクル、55°C; STEP3：10分間72℃での一回。 </li></ol></li><li>製造元の説明書11以下のin vitro転写キットを用いてビオチン化RNAを合成します。この実験では、RNA合成のための鋳型としてPCR産物を使用します。 20μlのin vitro転写反応のために、200 ngのPCR増幅されたDNAは、各個々のNTPの2μlを、1μlの10mMのビオチンCTP、2μlの10×反応緩衝液、および2μlのT7 RNAポリメラーゼを混ぜます。 4時間37℃で混合物をインキュベートします。 </li><li> インビトロ転写に続いて、37＃で1μlの2 U /μlのDNaseで反応混合物を処理176; Cは、15分間鋳型DNAを分解する。最後に、その後の精製のために60μlの総体積にビオチン化RNAを希釈します。 </li><li>製造業者の説明書12以下の精製カラムを用いて、塩および取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために、ビオチン化RNAを精製します。その後のプルダウンアッセイのために-80℃でRNA濃度とストアを測定します。 </li><li> 2分、2分間氷上で寒さのために90℃でRNA-タンパク質相互作用、熱50μlのビオチン化RNA（50 PM）への関心のRNAのための適切な二次構造を確保するために、その後、50μlの2倍のRNA構造のバッファ（ 表と供給3）30分13,14 RTで折りたたみRNAを可能にします。 </li></ol> RNA結合ビーズの調製注：磁気ビーズと上清を分離するための磁気スタンドを使用してください。 <ol><li>簡単なvorteによって、元のバイアル中のストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを再懸濁し製造者の指示に従って興。 1.5mlチューブにビーズを再懸濁し、150μlのを転送します。 1分間磁石上にチューブを置きます。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 注：RNAプルダウンアッセイでは、元のバイアルから再懸濁ビーズを分取、MSが続くアッセイのためにウェスタンブロッティングに続いて、アッセイのための50μlのビーズ、および200μlのビーズを使用します。 </li><li>再懸 ​​濁し、製造元の推奨1xのW＆Bの1mlでビーズペレットを（結合および洗浄）バッファー（ 表3）によって一度ビーズを洗浄し、ローテーターで、室温で5分間チューブを回転させることによって行いました。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 400μlの緩衝液A緩衝液Aでビーズペレットを再懸濁することにより、毎回、ビーズ上のRNaseを不活化二回ビーズを洗浄するには、0.1M NaOHおよび0.05 M NaClを（ 表3）を含むアルカリ性溶液です。ローテーターで、室温で2分間チューブを回転させます。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li> &lt;李&gt;は回転子に室温で2分間、チューブを回転させることで、その後再懸濁し、400μlの緩衝液Bでビーズペレットを（ 表3）、によって、二回ビーズを洗浄し、ビーズから毎回のNaOHを削除します。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 300μlの2倍のW＆B緩衝液で再懸濁ビーズペレットは、スプリットビーズ均等と3 1.5ミリリットルのチューブ（チューブあたり100μlのビーズ）に移します。 100μlのRNaseフリー水でビーズを含有するチューブを供給し、FLのRNAとそれぞれ、AR 3&#39;UTR RNAをビオチン化し、100μlのビオチン化を100μl。 </li><li>回転させながら室温で1時間各ビーズ混合物をインキュベートします。 1分間磁石上にチューブを入れます。すべての上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 400μlの1×W＆B緩衝液を用いて各ビーズペレットを再懸濁することにより、二回毎回ビーズを洗浄し、ローテーターで室温で5分間、チューブを回転させることによって行いました。 </li><li> 1分間磁石上にチューブを入れます。すべての上清を捨てます。再懸濁し、各ビーズPELLE50μlの核単離緩衝液（ 表3）でトン。 </li></ol> 3.前脂肪細胞の単離と脂肪生成誘導<ol><li>以前の刊行物5に記載したように、肩甲骨間の褐色脂肪パッド（3週齢C57BL6野生型マウス）からの前脂肪細胞を分析。 </li><li>成長し、in vitroで前脂肪細胞5を区別します 。細胞は4-5日分化の開始後に下流側のアプリケーションのための準備が整いました。 </li></ol>プライマリ脂肪細胞からの細胞溶解物の4準備注：細胞溶解物の準備のすべての手順を確認し、氷上で行われ、すべてのバッファを氷上で冷却されています。氷上でプレチルダウンスガラスホモジナイザー。 <ol><li>成長すると15cmの皿5（セクション3.2を参照）で前脂肪細胞を分化します。各皿には、1つのRNAプルダウンアッセイのための適切な細胞を提供します。分化の4日目または5日目に、細胞培養培地、および洗浄CEを破棄する1×PBSで一度LLS。 </li><li>収穫細胞に、細胞を10〜15 mlの1×PBSを追加し、室温で5分間、200×gでの遠心分離によって50mlチューブ中の細胞を収集するためにこすり、ペレット細胞。 1ミリリットルピペットを使用して、上清を捨てます。 </li><li> 2ml中に再懸濁細胞ペレットを低張緩衝液（ 表3）、そして氷上で15分間細胞をインキュベートします。転送15ミリリットルダウンスガラスホモジナイザーに細胞、および機械的に氷上で20ストロークでせん断セル。 </li><li> 4℃で15分間、3300×gでの遠心分離によってペレットは、細胞核。さらに使用するために氷上で核ペレットにしてください（セクション4.6を参照）。 1.5ミリリットルチューブに上清を移し、150mMのの最終濃度を得るために、上清に3MのKClを追加し、4℃で15分間20,000×gでスピン。 </li><li>遠心分離後、慎重に1ミリリットルピペットを用いて、トップlipidlayeron削除、および細胞質細胞溶解物として上清を収集します。 </li><li>核ペレットを再懸濁1ミリリットル核単離緩衝液中（4.4節を参照）。 Transfer核機械的に100ストロークで、氷上で15ミリリットルダウンスガラス1ミリリットルピペットを用いて、ホモジナイザー、およびせん断核へ。 4℃で15分間20,000×gで遠心分離することによって、核破片をペレット化し、そして核細胞溶解物として上清を収集します。 </li><li>核と細胞質の細胞溶解物を組み合わせ、または下流プルダウンアプリケーションのために、個別に各画分のいずれかを使用します。このデモ実験では、細胞溶解物のこれら2つの画分1の体積比で混合した：1。 </li><li> 0.5 U /μlの最終濃度を得るために、この未分画の細胞溶解物にRNase阻害剤を加えます。ウェスタンブロッティング15のための入力制御として、細胞溶解物の脇に100μLを設定します。 </li></ol> 5.結合およびRBPの溶出<ol><li>スプリットセル3つの等しいアリコートに溶解液（1.5mlチューブで1ミリリットルの細胞溶解物）、およびブランクでインキュベートは、FL RNA結合型およびAR 3&#39;UTR RNA結合ビーズは4℃で3時間、それぞれ、（2.8節を参照してください） C言語回転に。 </li><li> 1分間磁石上にチューブを入れます。 RNAの完全性を確認するために、上清からのRNAの単離に続いて1ミリリットルピペットを使用して、上清を収集します。製造業者の説明書（ 表2）は、以下の酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール溶液を用いてRNAを単離します。リボソームRNAの28Sおよび18Sサブユニットを分析することによって、RNAの完全性を評価します。氷の上にビーズペレットを保管してください。 </li><li>ローテーターで、室温で2分間、チューブを回転させることにより、続いて40 UのRNase阻害剤と0.25％IGEPALを含む1ミリリットルの核単離緩衝液を用いて各ビーズペレットを再懸濁することにより磁気ビーズを6回、毎回洗浄します。磁気ビーズと上清を分離するための磁気スタンドを使用してください。すべての上清を捨てます。氷の上にビーズペレットを保管してください。 </li><li>ウェスタンブロッティングのためのビーズからRNA-タンパク質複合体を溶出するには、次の手順を使用します。まず、75μlの核単離緩衝液中の各ビーズペレットを再懸濁。その後、25μlの4倍ウェスタンブロットローディングBUFを追加FERは、（SDSを含む）を100μlの総容積を得ました。最後に、5分間、95℃で100μlの溶液中のビーズを沸騰。 注：使用は、MSのためのビーズからRNA-タンパク質複合体を溶出するための手順を以下に示します。 STEP1：100μlの溶出バッファー（ 表3）の各ビーズペレットを再懸濁。 STEP2：回転させながら室温で2-3時間、ビーズのサンプルをインキュベート。 STEP3：遠心分離機とタンパク質含有上清を回収。 STEP4：MSの提出前に20〜30μlにタンパク質溶液を濃縮します。 </li><li> 4℃で30秒間12,000×gで遠心分離ビーズサンプルの各100μlを、上清を集めます。ウエスタンブロット分析のためにアリコート15μlの上清（セクション6.1と6.2を参照してください）​​。プローブ希釈HuRのマウスモノクローナル抗体で得られた膜（1：1,000希釈）を、一晩。 </li></ol> RBPの検証6.ウェスタンブロッティング<ol><li>標準的な技術を用いてSDS-PAGEで区切りRBPs。 </li><li>私たちを実施船尾目的のRNAに関連したRBPsのためにプローブすることによって、標準的な技術を用いてブロッティング。 注：このデモ実験では、HuRのマウスモノクローナル抗体のHuRタンパク質の免疫検出のために使用しました。 </li><li> 、脱脂粉乳、1×TBS w / vの5％に：（千希釈1）希釈HuRの抗体と得られた膜をインキュベート 0.1％ トゥイーン- 4で20 一晩、穏やかに振盪しながらC°。 1×TBSTで膜を3回洗浄します。室温で1時間二次抗体（ヤギ抗マウスIgG-HRP）を用いて膜をインキュベートします。ウォッシュ膜。開発し、信号を記録します。 </li></ol>

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利害の衝突が宣言されていません。

lncRNAsとRBPsが健康と病気に重要な役割を持っている、しかし、これらの分子の分子メカニズムはあまり理解されていません。 lncRNA分子と相互作用するタンパク質の同定は、調節機構の解明に向けた重要なステップです。 RNAプルダウンアッセイシステムによってRBPsの濃縮は、溶液内の細胞溶解物からのタンパク質は選択的にストレプトアビジン磁気ビーズに結合したビオチン化RNAベイトを用?...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPsは、細胞内で二本鎖または一本鎖RNAに結合し、RNA-タンパク質複合体の形成に関与するタンパク質です。 RBPsは、mRNAと長い非コードRNA（lncRNAs）を含むRNA種の多様性を結合し、転写後のレベルで自分の影響力を発揮することができます。 RBPsとlncRNAsの両方が脂肪の発達と機能1,2,3における新規調節因子として浮上しています。細胞経路のRBP-とlncRNA媒介調節のメカニズムを理解するためには、RNAのタンパク質パートナーの完全なスペクトルを識別するために、時々、特定のRNA分子および1つまたはいくつかのRBPsの間の相互作用を検出することがしばしば必要であり、かつ転写産物。しかし、実験が原因脂肪細胞中の脂質の含有量が高いに挑戦することができます。ここで説明するRNAプルダウンプロトコルは、初代培養4,5の脂肪細胞溶解物から特定 ​​のRNAのタンパク質パートナーを取得するために使用することができます。 このプロトの根拠次のようにcolが要約されています。 RNAの餌は、DNAテンプレートから転写された試験管 、ビオチン標識したストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ4に共役です 。 RNAの餌は、その後、磁気スタンド上にプルダウンされているRNA-タンパク質複合体の形成を可能にするために、細胞溶解物と共にインキュベートします。具体的には、RNAプルダウンプロトコルは、以下に記載のHuRタンパク質、初代培養のtheadipocytelysateから、mRNAを6,7の3&#39;UTRに結合された普遍的に発現RBPを取得するために餌としてAR 3&#39;UTRからRNA断片を使用します。このアッセイの結合特異性を試験するために、非関連RNAasだけでなく、空白のストレプトアビジンビーズを対照として含まれています。このプロトコルは、特定のRBPのキャプチャを確認したり、撮影しRBPs、それぞれ8の完全なレパートリーを識別するために、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法（MS）と互換性があります。 いくつかの技術は、RNA-タンパク質相互作用を研究するために利用可能です秒。所与RBPによって拘束RNAを明らかにするために、RIP（RNA免疫沈降）及びCLIP（UV架橋及び免疫沈降）を適用することができます。対照的に、与えられたRNA、RNAプルダウン、チャープ（RNA精製によってクロマチン分離）、グラフ（RNA標的の捕獲ハイブリダイゼーション分析）のタンパク質パートナーを識別し、RAP（RNAアンチセンス精製）を適用することができます。それ以降のものと比較して、RNAプルダウン技術が設定する労力がかかります。 in vitroおよびin vivoでタンパク質を捕捉するために使用することができます。技術的に困難なそのin vitro対応物よりもRNAプルダウンのインビボでのアプローチは、細胞内で架橋することによりRNA-タンパク質相互作用を維持し、細胞からの目的のアプタマータグ付きRNAを捕捉し、その後、結合したRBPsを検出します。 RNAプルダウンは低豊富RBPsを濃縮するために使用することができ、細胞調節9,10を制御することで、多様な機能的役割を有するRNA-タンパク質複合体を単離し、同定するために</s&gt;アップ。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Major materials used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major equipment used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA結合タンパク質（RBPs）は、脂肪の発達と機能における規制層として浮上しています。 RBPsは、標的mRNAの安定性および翻訳効率に影響を与えることにより、転写後レベルでの遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。 RNAプルダウン技術が広く機構RBP​​s &#39;ならびに長い非コードRNA」（lncRNAs）機能の根底に解明する必要があるRNA-タンパク質相互作用を研究するために使用されています。しかし、脂肪細胞における高脂質存在量は、この実験を行う際の技術的な課題を提起します。ここで詳細なRNAプルダウンプロトコールは、一次脂肪細胞の培養のために最適化されています。脂肪細胞lystateからアデニル酸ウリジル酸が豊富な、そのRBPパートナーを取得する方法を示すために例として使用elementwas、HuRのタンパク質を含むアンドロゲン受容体の（AR）3 &#39;非翻訳領域（3&#39;UTR）からのRNA断片。ここで説明する方法は、間の相互作用を検出するために適用することができますRBPsおよび非コードRNA、ならびに間RBPsとコーディングRNA。

このデモ実験において、AR RNA断片は、結合タンパク質HuRのを捕捉するために餌として使用しました。両方のHuRタンパク質に非関連であるFLのRNAの餌、およびコンジュゲートされていない空白のストレプトアビジンビーズのアリコートを陰性対照としました。 RNA-タンパク質相互作用は、核または細胞質のいずれかで発生することができ、このプルダウンプロトコールは...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K ビュー.  Duke-NUS Medical School.  RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

遺伝学

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

生化学

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

がん研究

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

RNA結合タンパク質の検出によって、

要約

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急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

ビオチンベースプルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル

RNA結合タンパク質の検出によって、

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急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

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ビオチンベースプルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs