Este trabalho foi financiado por Singapura NRF comunhão (NRF-2011NRF-NRFF001-025), bem como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: O ARN de interesse no contexto do presente estudo é um fragmento da 3&#39;UTR AR. 1. Preparação de ARN-biotina marcado <ol><li> Para obter o RNA, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguida por transcrição in vitro utilizando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante 11. NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: T7-AR-F e T7-AR-R. </li><li> Para o controlo de ligação não específico, amplificar uma sequência parcial do ADN de luciferase de pirilampo (FL) por PCR a partir do plasmídeo psiCHECK-2, seguido por transcrição in vitro. NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: hluc (+) - T7-sonda-F e hluc (+) - R-sonda Tabela 4 sequências de molde e os iniciadores para amplificação por PCR... </li><li> Para uma reacção de PCR de 50 uL, misturar 50 ng de ADN (oligo ou plasmídeo), 4 ul de dNTPs (2,5 mM de cada dNTP individuais), 5 ul de tampão de reacção 10x, 1 ul de 2,5 U / &amp; #181; L de polimerase de ADN, 2 ul de 10 mM de iniciadores para a frente, 2 ul de 10 mM de primer reverso, e água isenta de nuclease. <ol><li> Executar a amplificação por PCR num termociclador utilizando o seguinte programa. Passo 1: um ciclo de 95 ° C durante 2 min; Passo 2: 35 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg (AR) ou 60 seg (FL); Passo 3: um ciclo de 72 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Sintetizar ARN biotinilado utilizando um kit de transcrição in vitro, seguindo as instruções do fabricante 11. Neste experimento, use produtos de PCR como modelos para a síntese de RNA. Por um pi in vitro da reacção de 20 transcrição, misturar 200 ng de PCR amplificado de DNA, 2 ul de cada NTP indivíduo, 1 ul 10 mM de biotina-CTP, 2 ul de tampão de reacção 10x, e 2 ul de ARN-polimerase de T7. Incubar a mistura a 37 ° C durante 4 h. </li><li> Após a transcrição in vitro, a mistura de reacção com um mimo ul de 2 U / mL de ADNase a 37 &amp; #176; C durante 15 minutos para degradar ADN molde. Por fim, dilui-se o ARN biotinilado para um volume total de 60 uL para a purificação subsequente. </li><li> Purifica-se ARN biotinilados para remover os sais e os nucleótidos não incorporados utilizando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante 12. Medir a concentração de ARN e armazenar a -80 ° C para ensaios subsequentes pull-down. </li><li> Para garantir que a estrutura secundária adequada para o ARN de interesse na interacção RNA-proteína, de calor 50 ul de ARN biotinilado (50 pM) a 90 ° C durante 2 min, frio em gelo durante 2 min, em seguida, fornecer com 50 tampão de RNA estrutura ul 2x (Tabela 3), e para permitir o dobramento de RNA, à TA durante 30 min 13,14. </li></ol> 2. Preparação de Grânulos de ARN-conjugado NOTA: Use um suporte magnético para a separação das esferas magnéticas e sobrenadante. <ol><li> Ressuspender as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina dentro do recipiente original por breve vortexing seguindo as instruções do fabricante. Transferir 150 ul grânulos em suspensão para um tubo de 1,5 ml. Colocar o tubo no ímã para 1 min. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet. NOTA: Em ensaios de pull-down de ARN, quando alíquotas grânulos em suspensão do frasco original, use 50 pérolas ul para um ensaio seguido por western blot e 200 pérolas ul para um ensaio seguido por MS. </li><li> Lavar as pérolas uma vez por re-suspensão do grânulo pelete com 1 ml da recomendada pelo fabricante 1x tampão B W &amp; (Tabela 3) (de ligação e de lavagem), seguindo-se a rotação do tubo durante 5 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet. </li><li> Para inactivar RNase em grânulos, esferas de lavar duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota talão com 400 uL de tampão A. O tampão A é uma solução alcalina contendo NaOH 0,1 M e NaCl 0,05 M (Tabela 3). Girar o tubo durante 2 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet. </li> &lt;li&gt; Para remover NaOH a partir de grânulos, grânulos lavar duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota talão com 400 ul de tampão B (Tabela 3), seguido pela rotação do tubo durante 2 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet. </li><li> Ressuspender pellet talão com 300 ul 2x W &amp; B tampão, contas dividido em partes iguais e transferir para três tubos de 1,5 ml (100 contas ul por tubo). Fornecer os tubos contendo talão com 100 mL RNase água livre, 100 ul biotinilado FL RNA e 100 ul biotinilados AR 3&#39;UTR RNA, respectivamente. </li><li> Incubar cada mistura de pérolas durante 1 h à temperatura ambiente com rotação. Coloque tubos no ímã para 1 min. Descarte todo o sobrenadante. Manter peletes grânulo. </li><li> Lavar as pérolas duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota cada grânulo com 400 ul de 1x tampão de W &amp; B, seguido por rotação tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente num rotador. </li><li> Coloque tubos no ímã para 1 min. Descarte todo o sobrenadante. Ressuspender cada pelle talãot com 50 ul de tampão de isolamento nuclear (Tabela 3). </li></ol> 3. prï¿½adipï¿½ito Isolamento e Adipogênese Indução <ol><li> Conforme descrito em publicações anteriores 5, dissecar pré-adipócitos da almofada de gordura marrom interescapular (ratinhos de tipo selvagem C57BL6, 3 semanas de idade). </li><li> Crescer e in vitro diferenciar os pré-adipócitos 5. As células estão prontas para aplicação a jusante 4-5 dias após o início da diferenciação. </li></ol> 4. Preparação de Lisado celular dos adipócitos primários NOTA: Assegurar que todos os procedimentos de preparação de ligado celular são feitas em gelo, e todos os buffers são arrefecidas em gelo. homogeneizadores Dounce de vidro pré-frio no gelo. <ol><li> Crescer e diferenciar pré-adipócitos em 15 cm pratos 5 (ver secção 3.2). Cada prato fornece células adequadas para o ensaio de pull-down um RNA. No dia 4 ou dia 5 de diferenciação, meio de cultura de células de descarte, e ce lavarLLS uma vez com 1x PBS. </li><li> Para colher as células, adicionar 10-15 ml de 1x PBS para as células, raspar para recolher as células num tubo de 50 ml, e as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à TA. Elimine o sobrenadante utilizando uma pipeta. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão hipotónico (Tabela 3), e incuba-se as células em gelo durante 15 min. Transferência de células para um homogeneizador de vidro de 15 ml Dounce e células de cisalhamento mecanicamente em gelo com 20 golpes. </li><li> Pellets núcleos celulares por centrifugação a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C. Mantenha pellet núcleos de gelo para uso posterior (ver secção 4.6). Transferir o sobrenadante para tubos de 1,5 ml, adicionar KCl 3M de sobrenadante para se obter uma concentração final de 150 mM, e centrifugação a 20000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Após a centrifugação, remover cuidadosamente lipidlayeron topo usando uma pipeta, e recolher o sobrenadante como o lisado celular citoplasmática. </li><li> Ressuspender pellet núcleos (ver secção 4.4) em 1 ml de tampão de isolamento nuclear. Tnúcleos ransferência para um homogeneizador de vidro Dounce de 15 ml usando uma pipeta, e os núcleos de cisalhamento mecanicamente em gelo com 100 pancadas. Sedimentar os detritos nucleares por centrifugação a 20000 xg durante 15 min a 4 ° C, e recolher o sobrenadante como o lisado celular nuclear. </li><li> Ou combinar os lisados ​​celulares nuclear e citoplasmática, ou utilizar separadamente cada fracção, para aplicação pendente a jusante. Nesta experiência de demonstração, estas duas fracções de lisado celular foram combinados a uma proporção em volume de 1: 1. </li><li> Adicionar inibidor de RNase para esta ligado celular não fraccionada para se obter uma concentração final de 0,5 U / uL. Retiradas 100 ul de lisado celular como controle de entrada para western blot 15. </li></ol> 5. ligação e eluição de RBP <ol><li> lisado celular dividida em três aliquotas iguais (1 ml de lisado celular num tubo de 1,5 ml), e incuba-se com vazio, FL ARN-conjugado e os grânulos AR 3&#39;UTR ARN-conjugados (ver secção 2.8), respectivamente, durante 3 horas a 4 ° Ccom rotação. </li><li> Coloque tubos no ímã para 1 min. Recolher o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml, seguido de isolamento de RNA a partir do sobrenadante para confirmar ARN integralidade. Isolar ARN utilizando uma solução de tiocianato de guanidínio-fenol ácido, seguindo as instruções do fabricante (Tabela 2). Avaliar o ARN intacto através da análise de 28S e 18S subunidades de RNA ribossomal. Mantenha pelotas talão no gelo. </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas seis vezes, cada vez por ressuspensão cada pellet de talão com 1 ml de tampão de isolamento nuclear contendo 40 U de RNase inibidor e 0,25% de IGEPAL, seguido pela rotação tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente num rotador. Usar um suporte magnético para a separação das esferas magnéticas e sobrenadante. Descarte todo o sobrenadante. Mantenha pelotas talão no gelo. </li><li> Use etapas a seguir para eluir complexos de RNA-proteína de esferas para transferência de western. Em primeiro lugar, ressuspender cada pellet de grânulo em 75 ul de tampão de isolamento nuclear; em seguida, adicionar 25 ul 4x western blot carregamento buffer (contendo SDS) para obter um volume total de 100 ul. Finalmente, ferver grânulos em 100 ul desta solução a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Use os seguintes passos para eluir complexos de RNA-proteína de esferas para MS. Passo 1: ressuspender cada pellet de grânulo em 100 ul de tampão de eluição (Quadro 3); Passo 2: incubar as amostras de esferas durante 2-3 horas à temperatura ambiente com rotação; Passo 3: centrífuga e recolher o sobrenadante contendo proteína; Passo 4: concentrar soluções de proteína de 20-30 ul antes da apresentação para MS. </li><li> Centrifugue cada 100 ul de amostra de talão a 12000 xg durante 30 seg a 4 ° C, e recolher o sobrenadante. Alíquota de sobrenadante 15 ul para análise western blot (ver secção 6.1 e 6.2). Sondar a membrana resultante com o anticorpo monoclonal de rato Hur diluído (diluição 1: 1000), durante a noite. </li></ol> 6. Western Blotting para verificação da RBP <ol><li> RBPs separadas por SDS-PAGE usando técnicas padrão. </li><li> realizar nósStern blotting usando técnicas convencionais através de sondagem para os RBPs associados com o ARN de interesse. NOTA: Neste experimento demo, foi utilizado anticorpo monoclonal de Hur para a imunodetecção de proteína Hur. </li><li> Incubar a membrana com o anticorpo resultante Hur diluído (diluição 1: 1000) em 5% w / v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 a 4 ° C com agitação suave, durante a noite. Lavar as membranas três vezes com 1x TBST. Incubar membrana com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho-HRP) à temperatura ambiente durante 1 h. membrana de lavagem. Desenvolver e registro sinal. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

lncRNAs RBPs e desempenham um papel vital na saúde e na doença, no entanto, os mecanismos moleculares destas moléculas são mal compreendidos. Identificação de proteínas que interagem com moléculas lncRNA é um passo fundamental para elucidar os mecanismos de regulação. Enriquecimento de RBPs por o sistema de ensaio suspenso ARN baseia-se na captura em solução de complexo interagir de modo que as proteínas a partir de um lisado celular pode ser selectivamente extraído usando iscas de ARN biotinilados ligado...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs são proteínas que se ligam ao ARN de cadeia dupla ou simples em células e participam na formação de complexos de ARN-proteína. RBPs pode ligar-se uma variedade de espécies de ARN, incluindo ARNm e ARN não codificantes longos (lncRNAs), e exercem a sua influência aos níveis pós-transcricional. Ambos os RBPs e lncRNAs estão emergindo como novos reguladores no desenvolvimento adiposo e funcionar 1,2,3. Para compreender o mecanismo de RBP- e regulação mediada por lncRNA de vias celulares, é muitas vezes necessário para detectar a interacção entre uma molécula de ARN específica e um ou vários RBPs, e, por vezes, para identificar o espectro completo de parceiros proteicos de um ARN transcrição. No entanto, a experiência pode ser um desafio devido ao seu elevado teor de lípidos em adipócitos. O ARN protocolo suspenso descrito aqui pode ser utilizado para recuperar os parceiros de proteína de um RNA específico a partir dos lisados ​​de culturas de adipócitos primários 4,5. Justificativa para este protoCol é resumido como se segue. Um isco ARN é transcrito in vitro a partir de um molde de ADN, e conjugado com estreptavidina-revestida esferas magnéticas 4 marcado com biotina. O isco de ARN é incubada com lisados ​​celulares para permitir a formação de complexos de ARN-proteína, que são subsequentemente puxadas para baixo sobre um suporte magnético. Mais especificamente, o ARN protocolo suspenso descrito abaixo utilizar um fragmento de ARN de AR 3&#39;UTR como a isca para recuperar proteína Hur, uma RBP universalmente expresso ligado a 3&#39;UTR do ARNm de 6,7, a partir de uma cultura primária theadipocytelysate. Para testar a especificidade de ligação deste ensaio, um RNAas não-relevantes bem como em branco esferas de estreptavidina é incluído como controlo. Este protocolo é compatível com western blot ou espectrometria de massa (MS) para confirmar a captura de um RBP específico ou para identificar o repertório cheio de RBPs capturados, respectivamente 8. Estão disponíveis várias técnicas para estudar a interacção RNA-proteínas. Para revelar RNAs ligados por um determinado RBP, RIP (imunoprecipitação RNA) e CLIP (reticulação UV e imunoprecipitação) pode ser aplicado. Em contraste, para identificar parceiros de proteína de um determinado ARN, ARN suspenso, CHIRP (isolamento cromatina por purificação de ARN), QUADRO (análise de hibridação de captura de alvos de ARN) e RAP (purificação de ARN anti-sentido) pode ser aplicado. Em comparação com os posteriores, a técnica de pull-down RNA leva menos esforço para configurar. Pode ser empregue para capturar as proteínas in vitro e in vivo. A abordagem in vivo de RNA pull-down, que é tecnicamente mais exigente do que o seu homólogo in vitro, preserva interações RNA-proteína por reticulação nas células, capta RNAs marcado com aptâmeros de interesse a partir de células e, posteriormente detecta RBPs encadernados. ARN pull-down pode ser utilizado para enriquecer baixas RBPs abundantes, e para isolar e identificar os complexos de ARN-proteína que têm diversos papéis funcionais no controlo de regulação celular 9,10 </s-se&gt;.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Major materials used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major equipment used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

proteínas de ligação a ARN (RBPs) estão a emergir como uma camada reguladora no desenvolvimento e função do tecido adiposo. RBPs desempenhar um papel-chave na regulação da expressão de genes aos níveis pós-transcricional por afectar a estabilidade e eficiência de translação de ARNm alvo. técnica pull-down ARN tem sido amplamente utilizado para estudar a interacção RNA-proteína, que é necessário para elucidar o mecanismo subjacente a função &#39;, bem como RNAs não-codificantes longos&#39; RBPs (lncRNAs). No entanto, a abundância de lípidos alta nos adipócitos representa um desafio técnico na realização deste experimento. Aqui, um protocolo de pull-down RNA detalhada é otimizado para a cultura de adipócitos primário. Um fragmento de RNA a partir de (AR) «Região do receptor de andrógeno 3 não traduzida (3&#39;UTR) contendo um elementwas rica adenilato-uridilato usados ​​como exemplo para demonstrar como recuperar seu parceiro RBP, proteína Hur, de lystate adipócitos. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar as interacções entreRBPs e RNAs não codificadoras, bem como entre RBPs e RNAs de codificação.

Nesta experiência de demonstração, um fragmento de ARN de AR foi utilizado como isco para capturar a sua proteína de ligação Hur. Tanto uma isca FL ARN que não é relevante para a proteína Hur, e uma alíquota de esferas de estreptavidina em branco não conjugados serviram como controlos negativos. interacções ARN-proteína podem ocorrer quer no núcleo ou citoplasma, e este protocolo de pull-down pode ser aplicado a total ou fraccionado (nucleares ou citoplasmáticas) lisados ...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Um protocolo de pull-down ARN é optimizado aqui para a detecção de interacções entre proteínas de ligação a ARN (RBPs) e não-codificante, bem como ARN de codificação. Um fragmento de ARN a partir do receptor de androgénio (AR) foi usado como um exemplo para demonstrar como recuperar a sua RBP de lystate de adipócitos primários castanhos.

Detecção de proteínas de ligação a ARN pela<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down em Cultura adipócito

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K visualizações.  Duke-NUS Medical School.  Um protocolo de pull-down ARN é optimizado aqui para a detecção de interacções entre proteínas de ligação a ARN (RBPs) e não-codificante, bem como ARN de codificação. Um fragmento de ARN a partir do receptor de androgénio (AR) foi usado como um exemplo para demonstrar como recuperar a sua RBP de lystate de adipócitos primários castanhos. 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genética

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Bioquímica

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Pesquisa do câncer

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Detecção de proteínas de ligação a ARN pela

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