Questo lavoro è stato finanziato dalla Singapore NRF borsa di studio (NRF-2011NRF-NRFF001-025), così come CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: L&#39;RNA di interesse nel contesto di questo studio è un frammento di AR 3&#39;UTR. 1. Preparazione di RNA marcato con biotina <ol><li> Per ottenere l&#39;RNA, amplificare T7-AR-oligo mediante PCR, seguita da trascrizione in vitro utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore 11. NOTA: Primer per PCR sono elencate nella Tabella 4: T7-AR-F e T7-AR-R. </li><li> Per non specifico di controllo vincolante, amplificare una sequenza parziale di DNA luciferasi di lucciola (FL) mediante PCR da psiCHECK-2 plasmide, seguita da in vitro trascrizione. NOTA: Primer per PCR sono elencate nella Tabella 4: hluc (+) - T7-probe-F e hluc (+) - Sonda-R Tabella 4 Sequenze di modello e primer per l&#39;amplificazione PCR... </li><li> Per un 50 microlitri reazione PCR, mescolare 50 ng del DNA (oligo o plasmide), 4 dNTP microlitri (2,5 mm di ogni singolo dNTP), 5 ml 10x tampone di reazione, 1 ml 2,5 U / &amp; #181; l DNA polimerasi, 2 microlitri 10 micron di primer in avanti, 2 microlitri 10 micron di primer inverso, e acqua priva di nucleasi. <ol><li> Eseguire l&#39;amplificazione PCR in un termociclatore utilizzando il seguente programma. STEP1: un ciclo di 95 ° C per 2 min; STEP2: 35 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec (AR) o 60 sec (FL); Passo 3: un ciclo di 72 ° C per 10 min. </li></ol></li><li> Sintetizzare RNA biotinilati utilizzando un kit di trascrizione in vitro seguendo le istruzioni del produttore 11. In questo esperimento, utilizzare prodotti di PCR come modelli per la sintesi di RNA. Per un microlitri in vitro reazione 20 trascrizione, mescolare 200 ng PCR DNA amplificato, 2 ml di ogni singolo NTP, 1 ml 10mM biotina-CTP, 2 ml 10x tampone di reazione, e 2 microlitri T7 RNA polimerasi. Incubare la miscela a 37 ° C per 4 ore. </li><li> In seguito la trascrizione in vitro, miscela di reazione trattamento con 1 ml 2 U / ml DNasi a 37 &amp; #176; C per 15 minuti per degradare DNA stampo. Infine, diluire l&#39;RNA biotinilato ad un volume totale di 60 microlitri per successiva purificazione. </li><li> Purificare RNA biotinilati per eliminare i sali e nucleotidi non incorporati utilizzando le colonne di purificazione seguendo le istruzioni del produttore 12. Misurare la concentrazione di RNA e conservare a -80 ° C per le successive analisi di pull-down. </li><li> Per garantire la corretta struttura secondaria per l&#39;RNA di interesse a interagire RNA-proteina, calore 50 microlitri di RNA biotinilato (50 pM) a 90 ° C per 2 min, raffreddamento su ghiaccio per 2 minuti, quindi fornire con 50 tampone RNA struttura microlitri 2x (Tabella 3), e permettere l&#39;RNA pieghevole a temperatura ambiente per 30 min 13,14. </li></ol> 2. Preparazione di perline RNA-coniugato NOTA: utilizzare un supporto magnetico per la separazione delle sfere magnetiche e surnatante. <ol><li> Risospendere le sfere magnetiche rivestite di streptavidina nel flacone originale per breve vortexing seguendo le istruzioni del produttore. Trasferire 150 ml microsfere in sospensione in una provetta da 1,5 ml. Posizionare il tubo su magnete per 1 min. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. NOTA: In RNA saggi di pull-down, quando si dispensa microsfere in sospensione dal flacone originale, utilizzare 50 perle microlitri per un test seguito da western blotting, e 200 perline microlitri per un test seguito da MS. </li><li> Lavare perline volta da ri-sospensione tallone pellet con 1 ml di consigliata dal costruttore 1x W &amp; B (vincolanti e lavaggio) tampone (Tabella 3), seguita ruotando la provetta per 5 min a temperatura ambiente in un rotatore. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. </li><li> Per inattivare RNase su perline, lavare perline due volte, ogni volta per ri-sospensione tallone pellet con 400 microlitri tampone A. tampone A è una soluzione alcalina contenente 0,1 M NaOH e 0,05 M NaCl (Tabella 3). Ruotare la provetta per 2 minuti a temperatura ambiente in un rotatore. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. </li> &lt;li&gt; Per rimuovere NaOH da perline, lavare perline due volte, ogni volta per ri-sospensione tallone pellet con 400 microlitri tampone B (Tabella 3), seguita ruotando la provetta per 2 minuti a temperatura ambiente in un rotatore. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. </li><li> Risospendere tallone pellet con 300 microlitri 2x W &amp; B tampone, perline divisa in parti uguali e trasferire in tre provette da 1,5 ml (100 perle microlitri per tubo). Fornire i tubi tallone contenenti 100 microlitri RNasi acqua libera, 100 ml biotinilati FL RNA e 100 ml biotinilati AR 3&#39;UTR RNA, rispettivamente. </li><li> Incubare ogni miscela sferette per 1 ora a temperatura ambiente con rotazione. Posizionare i tubi sul magnete per 1 min. Eliminare tutto il surnatante. Mantenere pellet tallone. </li><li> Lavare perline due volte, ogni volta per ri-sospensione ogni pellet tallone con 400 microlitri 1x W &amp; B tampone, seguito da tubi rotante per 5 min a temperatura ambiente in un rotatore. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete per 1 min. Eliminare tutto il surnatante. Risospendere ogni pelle tallonet con 50 buffer di isolamento nucleare microlitri (Tabella 3). </li></ol> 3. Preadipocyte Isolamento e adipogenesis induzione <ol><li> Come descritto in precedenti pubblicazioni 5, sezionare preadipociti del cuscinetto adiposo bruno interscapolare (topi wild type C57BL6, 3 settimane). </li><li> Crescere e in vitro differenziare le preadipocytes 5. Le cellule sono pronte per l&#39;applicazione a valle 4-5 giorni dopo l&#39;inizio della differenziazione. </li></ol> 4. Preparazione di Cellular lisato da adipociti primari NOTA: Assicurarsi che tutte le procedure di preparazione lisato cellulare sono realizzati su ghiaccio, e tutti i buffer sono raffreddati su ghiaccio. omogeneizzatori vetro Dounce pre-raffreddamento su ghiaccio. <ol><li> Crescere e differenziarsi preadipocytes in 15 cm piatti 5 (vedere paragrafo 3.2). Ogni piatto fornisce cellule sufficienti per una RNA test di pull-down. Il giorno 4 o 5 giorni di differenziazione, mezzo di coltura cellulare di scarto, e lavare ceLLS una volta con PBS 1x. </li><li> Per raccogliere le cellule, aggiungere 10-15 ml PBS 1x per le cellule, raschiare per raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml, e le cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante utilizzando 1 ml pipetta. </li><li> Pellet Risospendere cellule in 2 ml di tampone ipotonico (Tabella 3), e incubare le cellule in ghiaccio per 15 min. Trasferire le cellule in un omogeneizzatore di vetro da 15 ml Dounce e cellule taglio meccanicamente su ghiaccio con 20 colpi. </li><li> Pellet nuclei delle cellule per centrifugazione a 3.300 xg per 15 min a 4 ° C. Mantenere pellet nuclei in ghiaccio per un ulteriore uso (vedere paragrafo 4.6). Trasferire il surnatante in provette da 1,5 ml, aggiungere 3M KCl al supernatante ad ottenere una concentrazione finale di 150 mM, e centrifuga a 20.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione lipidlayeron alto utilizzando 1 ml pipetta, e raccogliere il surnatante come il lisato cellulare citoplasmatica. </li><li> Risospendere pellet nuclei (vedere paragrafo 4.4) a 1 ml di tampone di isolamento nucleare. Tnuclei RASFERIMENTO ad un omogeneizzatore di vetro da 15 ml Dounce usando 1 ml pipetta, e nuclei di taglio meccanico sul ghiaccio con 100 colpi. Pellet detriti nucleare per centrifugazione a 20.000 xg per 15 min a 4 ° C, e raccogliere il surnatante come il lisato cellulare nucleare. </li><li> O combinare i lisati cellulari nucleari e citoplasmatici, o utilizzare ogni frazione a parte, per l&#39;applicazione di pull-down a valle. In questo esperimento demo, queste due frazioni di lisato cellulare sono stati combinati in un rapporto in volume di 1: 1. </li><li> Aggiungere inibitore RNase a questo lisato cellulare non frazionata per ottenere una concentrazione finale di 0,5 U / ml. Mettere da parte 100 ml di lisato cellulare come controllo di input per Western Blotting 15. </li></ol> 5. rilegatura e eluizione di RBP <ol><li> lisato Split cella in tre aliquote uguali (lisato cellulare 1ml in una provetta da 1,5 ml), e incubare con vuoto, FL RNA-coniugato e perline AR 3&#39;UTR RNA-coniugati (vedi paragrafo 2.8), rispettivamente, per 3 ore a 4 ° Ccon rotazione. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete per 1 min. Raccogliere il surnatante con una pipetta 1 ml, seguito da isolamento di RNA da surnatante per confermare l&#39;RNA integralità. Isolamento dell&#39;RNA utilizzando una soluzione di tiocianato di guanidinio-fenolo acido seguendo le istruzioni del produttore (Tabella 2). Valutare l&#39;integrità RNA analizzando 28S e 18S subunità di RNA ribosomiale. Mantenere pellet tallone sul ghiaccio. </li><li> Lavare le perline magnetiche sei volte, ogni volta per risospendere ogni pellet perlina di 1 ml di tampone di isolamento nucleare contenente 40 U RNasi inibitore e 0,25% IGEPAL, seguita da tubi rotante per 2 minuti a temperatura ambiente in un rotatore. Utilizzare un supporto magnetico per la separazione delle sfere magnetiche e surnatante. Eliminare tutto il surnatante. Mantenere pellet tallone sul ghiaccio. </li><li> Utilizzare seguente procedura per eluire complessi RNA-proteina da perline per western blotting. In primo luogo, risospendere ogni pellet tallone in 75 microlitri di buffer di isolamento nucleare; poi, aggiungere 25 ml 4x Western Blot carico buffer (contenente SDS) per ottenere un volume totale di 100 microlitri. Infine, bollire perline in questa soluzione 100 ml a 95 ° C per 5 min. NOTA: Utilizzare i seguenti passi per eluire complessi RNA-proteina da perline per la SM. STEP1: risospendere ogni pellet tallone in 100 microlitri tampone di eluizione (Tabella 3); STEP2: incubare campioni di perline per 2-3 ore a temperatura ambiente con rotazione; Fase 3: centrifuga e raccogliere il surnatante proteici; Fase 4: concentrato soluzioni di proteine ​​di 20-30 ml prima della presentazione per la SM. </li><li> Centrifugare ogni 100 ml di campione perline a 12.000 xg per 30 sec a 4 ° C, e raccogliere il surnatante. Aliquota 15 microlitri surnatante per l&#39;analisi Western Blot (vedere paragrafo 6.1 e 6.2). Sondare la membrana risultante con l&#39;anticorpo monoclonale HuR topo diluito (1: 1000 diluizione), durante la notte. </li></ol> 6. Western Blotting per la verifica di RBP <ol><li> RBPs separate mediante SDS-PAGE utilizzando tecniche standard. </li><li> condurre noipoppa assorbente utilizzando tecniche standard sondando per le RBPs connessi con l&#39;RNA di interesse. NOTA: In questo esperimento demo, HuR anticorpo monoclonale murino è stato utilizzato per la immunolocalizzazione di proteine ​​HuR. </li><li> Incubare la membrana risultante con l&#39;anticorpo HuR diluito (1: 1000 diluizione) in 5% w / v senza grassi latte in polvere, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 a 4 ° C con dolce agitazione, durante la notte. Lavare membrana tre volte con 1x TBST. Incubare la membrana con l&#39;anticorpo secondario (capra anti-topo IgG-HRP) a temperatura ambiente per 1 ora. membrana di lavaggio. Sviluppare e segnale di registrazione. </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

lncRNAs e RBPs hanno un ruolo vitale nella salute e la malattia, tuttavia i meccanismi molecolari di queste molecole sono poco conosciuti. Identificazione di proteine ​​che interagiscono con le molecole lncRNA è un passo fondamentale verso la comprensione dei meccanismi di regolazione. Arricchimento del RBPs da parte del sistema di analisi a tendina RNA si basa sulla cattura in-soluzione di interagire complesso in modo che le proteine ​​da un lisato cellulare possono essere selettivamente estratti utilizzando e...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs sono proteine ​​che si legano all&#39;RNA doppia o singola bloccati in cellule e partecipano a formare complessi RNA-proteina. RBPs possono vincolare una varietà di specie di RNA, inclusi mRNA e RNA non codificanti lunghi (lncRNAs), e di esercitare la loro influenza a livello post-trascrizionale. Entrambi RBPs e lncRNAs stanno emergendo come nuovi regolatori nello sviluppo adiposo e funzionano 1,2,3. Per comprendere il meccanismo di RBP- e regolazione lncRNA-mediata vie cellulari, è spesso necessario rilevare l&#39;interazione tra una molecola di RNA specifico e uno o più RBPs, e, a volte, per identificare l&#39;intero spettro di partner proteici di un RNA trascrizione. Tuttavia, l&#39;esperimento può essere difficile a causa dell&#39;elevato contenuto di lipidi in adipociti. L&#39;RNA protocollo tendina qui descritto può essere impiegato per recuperare i partner proteici di un RNA specifico dai lisati adipociti di colture primarie di 4,5. Motivazioni per questo protoCol è riassunta come segue. Un esca RNA è trascritto in vitro da un modello di DNA, biotina-etichettati e coniugato con biglie magnetiche rivestite di streptavidina 4. L&#39;esca RNA viene incubato con lisati cellulari per permettere la formazione di complessi RNA-proteina, che vengono successivamente abbassate su un supporto magnetico. Più specificamente, il protocollo di pull-down RNA descritto di seguito utilizzare un frammento di RNA da AR 3&#39;UTR come esca per recuperare HuR proteina, un RBP universalmente espressa vincolato al 3&#39;UTR del mRNA 6,7, da theadipocytelysate di coltura primaria. Per testare la specificità di legame di questo saggio, un RNAas non rilevanti e perline streptavidina vuote è incluso come controllo. Questo protocollo è compatibile con western blotting o spettrometria di massa (MS) per confermare la cattura di un RBP specifica o per identificare la piena repertorio di RBPs catturati, rispettivamente 8. Diverse tecniche sono a disposizione per studiare l&#39;interazione RNA-proteinaS. Per rivelare RNA legati da un dato RBP, RIP (RNA immunoprecipitazione) e CLIP (reticolazione UV e immunoprecipitazione) può essere applicata. Al contrario, per identificare i partner proteici di un dato RNA, RNA pull-down, Chirp (isolamento cromatina da purificazione RNA), CHART (cattura analisi ibridazione degli obiettivi di RNA) e RAP (purificazione RNA antisenso) può essere applicata. In confronto con quelle successive, RNA tecnica discesa richiede meno sforzo di creare. Può essere impiegato per catturare proteine ​​in vitro e in vivo. L&#39;approccio in vivo di RNA pull-down, che è tecnicamente più impegnativo rispetto al suo omologo in vitro, conserva le interazioni RNA-proteina da reticolazione nelle cellule, cattura RNA aptamer-tag di interesse da cellule, e rileva in seguito RBPs rilegati. RNA pull-down può essere utilizzato per arricchire bassi RBPs abbondanti, e per isolare e identificare i complessi RNA-proteina che hanno diversi ruoli funzionali nel controllo della regolazione cellulare 9,10 </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Major materials used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major equipment used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA-binding proteins (RBPs) stanno emergendo come uno strato di regolamentazione per lo sviluppo e la funzione del tessuto adiposo. RBPs svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell&#39;espressione genica a livello post-trascrizionale che interessano l&#39;efficienza stabilità e traslazionale di mRNA bersaglio. RNA tecnica di pull-down è stato ampiamente utilizzato per studiare l&#39;interazione RNA-proteina, che è necessario per chiarire il meccanismo sottostante funzione di RBPs &#39;così come lungo RNA non codificanti&#39; (lncRNAs). Tuttavia, la grande abbondanza di lipidi negli adipociti rappresenta una sfida tecnica nella conduzione di questo esperimento. Ecco una dettagliata protocollo di pull-down RNA è ottimizzato per la cultura adipociti primaria. Un frammento di RNA da (AR) 3 &#39;regione non tradotta del recettore degli androgeni (3&#39;UTR) contenente un elementwas ricco adenilato-uridylate-usato come esempio per dimostrare come recuperare il suo partner RBP, proteine ​​HuR, da adipociti lystate. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare le interazioni traRBPs e RNA non codificanti, così come tra i RBPs e RNA codificanti.

In questo esperimento demo, un frammento di AR RNA è stato utilizzato come esca per catturare la sua proteina legante HuR. Sia un RNA esca FL che non è rilevante per la proteina HuR, ed una aliquota di coniugati perline streptavidina vuote serviti come controlli negativi. interazioni RNA-proteina possono avvenire sia in nucleo o nel citoplasma, e questo protocollo pull-down può essere applicato a totale o frazionato (nucleare o citoplasmatica) lisati cellulari. Analisi di proteine ​...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Un protocollo di pull-down RNA è ottimizzato qui per il rilevamento delle interazioni tra RNA-binding proteins (RBPs) e non codificante e RNA codificanti. Un frammento di RNA da recettore degli androgeni (AR) è stato usato come esempio per dimostrare come recuperare la sua RBP da lystate degli adipociti bruni primarie.

Rilevamento di RNA-binding proteins by<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA a tendina nella cultura degli adipociti

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K Views.  Duke-NUS Medical School.  Un protocollo di pull-down RNA è ottimizzato qui per il rilevamento delle interazioni tra RNA-binding proteins (RBPs) e non codificante e RNA codificanti. Un frammento di RNA da recettore degli androgeni (AR) è stato usato come esempio per dimostrare come recuperare la sua RBP da lystate degli adipociti bruni primarie. 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Ricerca

Genetica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochimica

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Ricerca sul cancro

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Rilevamento di RNA-binding proteins by

Riepilogo

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