Bu eser Singapur NRF bursu (NRF-2011NRF-NRFF001-025) yanı sıra CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) tarafından finanse edildi.

NOT: Bu çalışma kapsamında ilgi RNA AR 3&#39;UTR&#39;sinden bir parçasıdır. Biotin-etiketli RNA hazırlanması 1. <ol><li> RNA elde edilmesi için, bir ticari kit kullanılarak ve imalatçının talimatları 11, aşağıdaki in vitro transkripsiyon ve ardından, PCR ile, T7-ar-oligo, yükseltmek. Not: PCR primerleri, Tablo 4&#39;te listelenmiştir: T7-AR-F ve T7-AR-R. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma kontrol için, in vitro transkripsiyon ve ardından psiCHECK-2 plasmidinden PCR ile ateşböceği lusiferaz (FL) DNA, bir kısmi sekansını yükseltmek. Not: PCR primerleri, Tablo 4&#39;te listelenmiştir: hluc (+) - T7-prob F hluc (+) - sonda-R, Tablo 4 PCR amplifikasyonu için şablon ve primer dizileri... </li><li> 50 | il PCR reaksiyonu için 50 ng DNA (oligo veya plazmit), 4 ul dNTP (her bir dNTP 2.5 mM), 5 ul 10x reaksiyon tamponu, 1 ul 2.5 U / ve karışım #181 L DNA polimeraz, 2 ul 10 uM ileri primer, 2 ul 10 uM ters primeri ve nükleaz içermeyen su. <ol><li> Aşağıdaki programı kullanılarak, bir termal döngü PCR amplifikasyonu çalıştırın. Adım 1: 2 dakika süreyle 95 ° C&#39;lik bir döngü; Adım 2: 30 saniye 95 ° C 35 döngü, 30 saniye için 55 ° C ve 30 sn (AR) ya da 60 saniye (FL) 72 ° C; Adım 3: 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;lik bir döngü. </li></ol></li><li> Imalatçının talimatlarına 11 uygulanarak, bir in vitro kopyalama kiti kullanılarak biyotinile edilmiş RNA&#39;ları sentez. Bu deneyde, RNA sentezi için şablon olarak PCR ürünleri kullanır. 20 ul in vitro transkripsiyon reaksiyonu için, 200 ng PCR ile çoğaltılan DNA, her bir NTP 2 ul, 1 ul 10 mM biyotin-CTP 2 ul 10x reaksiyon tamponu ve 2 ul T7 RNA polimeraz karışımı. 4 saat 37 ° C&#39;de inkübe karışımı. </li><li> 37 &amp; # de in vitro olarak transkripsiyonu, 1 ul 2 U / ml DNaz ile muamele reaksiyon karışımının aşağıdakı176 C 15 dk şablon DNA aşağılamak için. Son olarak, daha fazla saflaştınlmadan 60 ul bir toplam hacme biyo-küçültülmüş RNA seyreltin. </li><li> Imalatçının talimatlarına 12 Aşağıdaki saflaştırma sütunu kullanarak tuzlarını ve nükleotidleri gidermek için biyotinile edilmiş RNA&#39;ları saflaştınlır. daha sonra açılır deneyleri için -80 ° C&#39;de RNA konsantrasyonu ve mağaza ölçün. </li><li> 2 dakika, 2 dakika boyunca buzda 90 ° C&#39;de RNA-protein etkileşimi, ısı 50 ul biyotinile edilmiş RNA (50 pM) daki RNA için uygun sekonder yapısını sağlamak için, daha sonra 50 ul 2x RNA yapısı tamponu (Tablo sahip kaynağı 3), ve 30 dakika 13,14 oda sıcaklığında katlama RNA için izin verir. </li></ol> RNA eşlenik boncuklar 2. hazırlanması Not: manyetik boncuklar ve süpernatan ayrılması için manyetik bir stand kullanın. <ol><li> Kısaca vorte orijinal şişede streptavidin kaplı manyetik boncuklar süspanseXING üreticisinin yönergeleri izleyerek. 1.5 ml tüp boncuk yeniden süspansiyon haline getirildi, 150 ul aktarın. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirin. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. Not: RNA açılan deneylerinde orijinal şişeden yeniden süspansiyon haline boncuk aliquoting olduğunda, MS, ardından bir deneyde Western blotting ile ve ardından bir deneyde 50 ul boncuk ve 200 ul boncuk kullanır. </li><li> Yeniden süspansiyon üreticinin tavsiye 1x W ve B için 1 ml boncuk pelet (bağlanma ve yıkama) tampon maddesi (Tablo 3) bir kez boncuk yıkayın, bir rotatör içine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüpün döndürülmesi takip etmektedir. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. </li><li> 400 ul tampon A Tampon A ile topuk kısmı pelet yeniden süspansiyon haline getirilerek, her boncuk ilgili RNAaz ari inaktive iki boncuk yıkamak için 0.1 M NaOH ve 0.05 M NaCl (Tablo 3) ihtiva eden bir alkali bir çözümdür. rotator oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir tüp döndürün. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. </li> &lt;li&gt; rotator oda sıcaklığında 2 dakika için tüpün döndürülmesi ve ardından yeniden süspansiyon 400 ul tampon B ile boncuk pelet (Tablo 3) ile iki kez, boncuk yıkama boncuklardan her NaOH kaldırın. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun. </li><li> 300 ul 2x W &amp; B tamponu ile süspanse boncuk pelet, split boncuk eşit ve üç 1.5 ml tüpler (tüp başına 100 ul boncuklar) içine aktarın. 100 ul RNaz ücretsiz su ile boncuk içeren tüpler kaynağı 100 ul FL RNA ve sırasıyla AR 3&#39;UTR RNA biyotinile 100 ul biyotinile. </li><li> dönüşü ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca, her boncuk karışımı inkübe edin. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. tüm süpernatant atın. boncuk pelet tutun. </li><li> 400 ul 1 x W &amp; B tamponu ile her kordon pelet yeniden süspansiyon haline getirilerek, iki kez her seferinde boncuk yıkayın, bir rotatör içine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüpler döner eklenmiştir. </li><li> 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. tüm süpernatant atın. her kordon Pelle yeniden süspanse50 ul çekirdek yalıtım tamponu (Tablo 3) T. </li></ol> 3. Preadibosit İzolasyon ve adipogenesis İndüksiyon <ol><li> Önceki yayınlarda 5&#39;te tarif edildiği gibi, interskapular kahverengi yağ pedi Preadipositler (C57BL6 vahşi tip fare, 3 haftalık) keser. </li><li> Büyümek ve in vitro preadipositlerden 5 ayırt. Hücreler 4-5 gün farklılaşma başlandıktan sonra aşağı uygulama için hazır. </li></ol> Birincil adipositlerden Hücresel lizat 4. hazırlanması NOT: Hücre lizatı hazırlık tüm işlemleri emin olun buz üzerinde yapılır ve tüm tamponlar buz üzerinde soğutulmuş edilir. buz üzerinde önceden soğuk Dounce cam homojenizatörler. <ol><li> Büyümek ve 15 cm yemekleri 5 (bakınız bölüm 3.2) &#39;de preadipositlerden ayırt. Her yemeğin bir RNA açılan tahlil için yeterli hücreleri sağlar. günde 4 veya farklılaşması, ıskarta hücre kültür ortamının 5 gün ve yıkama CEbir zamanlar 1x PBS ile LLS. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj ile 50 ml&#39;lik bir tüp içinde hücreleri ve pelet hücreleri toplamak için kazıma, hücreler hasat hücrelere 10-15 mi 1x PBS ekleyin. 1 ml pipet kullanarak süpernatant atın. </li><li> Tekrar süspansiyon hücre 2 ml pelet hipotonik tampon maddesi (Tablo 3), ve 15 dakika süreyle buz üzerinde hücrelerin inkübe. Transferi 15 ml Dounce cam homojenizatör hücreleri ve mekanik buz üzerinde 20 vuruş ile kesme hücreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 3300 x g&#39;de santrifüjleme ile pellet hücre çekirdekleri. ileride kullanılmak üzere buz üzerinde çekirdekleri pelet tutmak (bölüm 4.6). 1.5 ml tüpler süpernatantı aktarın, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de bir son 150 mM konsantrasyonuna ve spin elde etmek üzere süpernatana 3M KCI ekleyin. </li><li> santrifüj sonrasında, dikkatli 1 ml pipet kullanarak üst lipidlayeron kaldırmak ve sitoplazmik hücresel lizat olarak supernatant toplamak. </li><li> çekirdek pelletini 1 ml nükleer izolasyon tamponunda (bakınız bölüm 4.4). Transfer 1 ml pipet kullanarak 15 ml Dounce cam homojenizatör çekirdekler ve mekanik 100 vuruş ile buz üzerinde kayma çekirdekler. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile nükleer yıkıntıları pelet haline ve nükleer hücre lizatı olarak supernatant toplamak. </li><li> Ya nükleer ve sitoplazmik hücresel lizatları birleştirmek, ya da aşağı açılan uygulama için, ayrı ayrı fraksiyonu kullanın. Bu tanıtım deneyde, hücre lizatı, bu iki fraksiyon 1 bir hacim oranında birleştirildi: 1 arasındadır. </li><li> 0.5 U / ul son konsantrasyon elde etmek için, bu bölünmemiş hücre lizatı RNaz önleyici. Batı lekeleme için 15 giriş kontrol olarak hücre lizatının bir kenara 100 ul ayarlayın. </li></ol> 5. Bağlayıcı ve RBP elüsyonu <ol><li> Bölünmüş hücre, üç eşit kısma lisatı (1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hücre lisatı) ve boş bir kuluçkalanması, FL RNA konjüge ve AR 3&#39;UTR RNA eşlenik boncuklar 4 ° &#39;de 3 saat boyunca, sırası ile, (bakınız bölüm 2.8) Cdönüşü ile. </li><li> 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. RNA bütünselliği onaylamak için süpernatanından RNA izolasyonu, ardından 1 ml pipet kullanılarak süpernatan toplamak. Üreticinin talimatlarına (Tablo 2), aşağıdaki bir asit guanidinyum tiosianat-fenol solüsyonu kullanılarak RNA izole edin. ribozomal RNA 28S ve 18S alt birimleri analiz ederek RNA Bozulmamışlık değerlendirin. buz üzerinde boncuk pelet tutun. </li><li> rotator oda sıcaklığında 2 dakika için tüpler döner ve ardından 40 U RNaz inhibitör ve% 0.25 IGEPAL içeren 1 mi, nükleer yalıtım tamponu her kordon topağın tekrar askıda bırakılmasıyla manyetik boncuk altı kez, her seferinde yıkayın. manyetik boncuklar ve süpernatan ayrılması için manyetik bir stand kullanın. tüm süpernatant atın. buz üzerinde boncuk pelet tutun. </li><li> Western blotting için boncuklardan RNA-protein kompleksleri elüte etmek için aşağıdaki adımları kullanın. İlk olarak, 75 ul nükleer izolasyon tamponunda her boncuk pelet; Daha sonra, 25 ul 4x western blot yükleme buf eklemekfer (SDS içeren) 100 ul toplam hacim elde edilmiştir. Son olarak, 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de, bu 100 ul çözelti içinde boncuk kaynatın. NOT: adımları MS için boncuk RNA-protein kompleksleri Zehir için aşağıdaki. Adım 1: 100 ul elüsyon tamponu (Tablo 3), her topuk kısmı pelet; Adım 2: rotasyon ile oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle boncuk örnekleri inkübe; Adım 3: santrifüjden sonra protein ihtiva eden süpernatan toplamak; Adım 4: MS için sunulmadan önce 20-30 ul protein çözümleri konsantre. </li><li> Santrifüj, her 100, 4 ° C&#39;de 30 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de boncuk örnek ul ve supernatant toplanır. western blot analizi (Bölüm 6.1 ve 6.2) için Kısım 15 ul süpernatant. gece boyunca, (1000 sulandırma 1) ile seyreltildi Hur fare monoklonal antikoru ile elde edilen membran kontrol edin. </li></ol> RBP doğrulanması için 6. Western Blot <ol><li> standart teknikler kullanılarak, SDS-PAGE ile ayrı RBPS. </li><li> biz Davranışkıç ilgi RNA ile ilişkili RBPS için sondalama tarafından standart teknikler kullanılarak kurutma. NOT: Bu demo deneyde, Hür fare monoklonal antikoru Hur proteininin İmmuno için kullanılmıştır. </li><li> seyreltilmiş Hür antikor ile sonuçlanan membran inkübe: a / h yağsız süt, 1x TBS% 5 (1 1,000 seyreltme), % 0.1 Tween - 20 4 at Gecede, nazik sallayarak ° C. 1x TBST ile membran üç kez yıkayın. 1 saat süre ile oda sıcaklığında (anti-fare IgG-HRP işaretli keçi) ikincil antikor ile membran inkübe edin. Yıkama membran. Geliştirmek ve kayıt sinyali. </li></ol>

<ol>
	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome.">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973 (2013).</li><li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation.">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li><li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-RNA+interactions:+new+genomic+technologies+and+perspectives.">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li><li>Ferr&#232;, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein-lncRNA+interaction.">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

lncRNAs ve RBPS ancak bu moleküllerin moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır, hastalık ve sağlıkta önemli roller üstlenir. lncRNA molekülleri ile etkileşime proteinlerin tanımlanması düzenleyici mekanizmaların tanıtılması yolunda önemli bir adımdır. RNA açılan deney sistemi ile RBPS zenginleştirilmesi, bir hücre lizatından proteinler seçici streptavidin manyetik taneleri bağlanmış biyo-küçültülmüş RNA yemler kullanılarak elde edilebilir, böylece kompleks etkileşim iç...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPS hücrelerde, tek veya çift sarmallı RNA bağlanan ve RNA-protein komplekslerinin oluşturulması katılmak proteinlerdir. RBPS mRNA ve uzun kodlamayan RNA&#39;lar (lncRNAs) de dahil olmak üzere RNA türlerinin, çeşitli bağlamak, ve post-transkripsiyonel seviyede nüfuzlarını olabilir. Hem RBPS ve lncRNAs adipoz geliştirme gibi yeni regülatörleri ortaya çıkan ve 1,2,3 işlev görmektedir. özel bir RNA molekülü ve bir ya da daha RBPS arasındaki etkileşimi saptamak için çoğu zaman gerekli olan, RBP- mekanizmasını ve hücresel yolların lncRNA-aracılı düzenlenmesinin anlamak için, ve bazen de bir RNA protein ortakları tam spektrum tespit etmek transkript. Ancak, deneme nedeniyle adipositlerdeki lipidlerin içeriği yüksek zor olabilir. Burada tarif edilen RNA açılan protokolü primer kültürlerinde 4,5 arasında adiposit lisatlanndan özel bir RNA protein ortakları almak için de kullanılabilir. Bu proto Gerekçesişöyle col özetlenmiştir. Bir RNA yem, bir DNA şablonu in vivo transkribe olan, biyotin-etiketli streptavidin kaplı manyetik boncuklar 4 ve konjuge. RNA, yem, daha sonra, bir manyetik stand aşağı çekilir RNA-protein kompleksleri oluşumuna olanak sağlamak için hücresel lizatları ile inkübe edilir. Daha spesifik olarak, RNA açılan protokolü aşağıda açıklanan HÜR proteini, birincil kültür theadipocytelysate gelen mRNA 6,7 3&#39;UTR&#39;sinden bağlı bir evrensel ifade RBP almak için yem olarak AR 3&#39;UTR&#39;sinden bir RNA parçası kullanın. Bu deneyde bağlanma spesifitesini test etmek için, uygun olmayan bir RNAas da boş streptavidin boncuk kontrol olarak dahil edilir. Bu protokol belirli RBP yakalama teyit etmek veya çekilen RBPS sırasıyla 8 tam repertuarını tespit etmek western blotting ya da kütle spektrofotometresi (MS) ile uyumludur. Çeşitli teknikler RNA-protein etkileşimi incelemek için kullanılabilirs. Belirli bir RBP, RIP (RNA immünopresipitasyon) ve CLIP (UV çapraz ve immünopresipitasyon) bağlı RNA&#39;lar ortaya çıkarmak için uygulanabilir. Buna karşılık, belirli bir RNA protein ortakları belirlemek için, RNA açılır, cıvıltı (RNA saflaştırma ile kromatin izolasyon), ABC (RNA hedeflerinin yakalanması hibridizasyon analizi) ve RAP (RNA antisens arıtma) uygulanabilir. Daha sonra olanlar ile karşılaştırıldığında, RNA açılan teknik kurmak için daha az çaba gerektirir. In vitro ve in vivo proteinler yakalamak için kullanılabilir. Onun in vitro meslektaşı daha teknik olarak daha zor RNA pull, in vivo yaklaşım hücrelerinde çapraz bağlama RNA-protein etkileşimleri korur, hücrelerin ilgi aptamer-etiketli RNA&#39;lar yakalar ve daha sonra bağlı RBPS algılar. RNA açılan düşük bol RBPS ettirecek ve izole edilmesi ve hücresel düzenleme 9,10 kontrol farklı fonksiyonel rolleri var RNA-protein kompleksleri tespit etmek için kullanılabilir </s&gt; Yukarı.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Major materials used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major equipment used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) adipoz gelişiminde ve fonksiyonunda bir düzenleyici bir tabaka olarak ortaya çıkmaktadır. RBPS, hedef mRNA stabilitesi ve dönüşüm etkinliğini etkileyerek transkripsiyon sonrası seviyelerde gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. RNA açılan tekniği yaygın mekanizmasının RBPS &#39;hem de uzun kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar&#39; (lncRNAs) işlevini yatan aydınlatmak için gerekli olan RNA-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Ancak, adipositlerde yüksek lipid bolluk bu deneyi yapan bir teknik sorun teşkil etmektedir. İşte detaylı RNA açılan protokol birincil adiposit kültürü için optimize edilmiştir. androjen reseptörün (AR) 3 &#39;çevrilmemiş bölge adiposit lystate gelen, onun RBP ortağı Hür proteini almak nasıl göstermek için bir örnek olarak kullanılan bir adenilat-üridilat zengin elementwas içeren (3&#39;UTR) bir RNA fragmanı. Burada tarif edilen yöntem ile etkileşimini tespit etmek için uygulanabilirRBPS ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, hem de arasındaki RBPS ve kodlama RNA.

Bu tanıtım deneyde, AR RNA fragmanı kendi bağlanma proteini Hur yakalamak için yem olarak kullanılmıştır. Hem Hur proteinine ilgili olmayan bir FL RNA yem ve konjüge edilmemiş boş streptavidin boncuk bir alikosu negatif kontrol olarak görev yapmıştır. RNA-protein etkileşimleri çekirdek veya sitoplazmada ya da oluşabilir ve bu açılan protokolü total veya parçalanmış (nükleer ve sitoplazmik) hücre lizatlarında, ya da uygulanabilir. Western blotting ile proteinle...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture at JoVE.com

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K Görüntüleme.  Duke-NUS Medical School.  Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır. 

Video: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biyokimya

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Kanser Araştırmaları

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler