このプロトコルは、分化されたアディポサイトにおけるタンパク質、またはマイクロRNA発現を操作して、アディポ細胞機能におけるその役割を研究することを可能にする。この逆トランスフェクション法は、オリゴヌクレオチドをマウス3T3-L1アディポサイトにトランスフェクトする簡便で経済的で効率の高い方法です。この方法は、アディポサイトに分化したヒトの前読細胞にも適用できる。
手順を実証することは、私たちの研究室の技術者メラニー・ゴードフリンです。ピルビン酸なしDMEMの100ミリメートルの皿で3T3-L1線維芽細胞を成長させます, 25 ミリモルグルコース, 10% 新生児子牛血清, ペニシリンとストレプトマイシン.37°Cと7%の二酸化炭素で組織培養インキュベーターに料理を置きます。
合流の2日後、培養培地を変え、ピルビン酸を含まないDMEM、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン1%を0.25ミリモルIBMX、0.25ミクロモルデキサメタゾン、ミリリットルインスリン当たり5マイクログラム、および10マイクロモロラーラグリタゾンで補充した。2日間の料理をインキュベートします。2日後、培養液をピルビン酸なしDMEM、25ミリモルグルコース、10%FCS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを1ミリリットルインスリンあたり5マイクログラム、10ミクロモルロシグリタゾンを補充し、さらに2日間培養します。
ピルビン酸、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を使用せずに2日ごとに細胞を供給し、細胞をインキュベーターに保管します。トランスフェクションの1日または数時間前に、1ミリリットル当たり1ミリグラムのストック溶液から30%エタノールで1ミリリットル当たり100マイクログラムのコラーゲンタイプIの溶液を調製する。12ウェルプレートのウェルあたり250マイクロリットルまたは24ウェルプレートのウェルあたり125マイクロリットルを加え、井戸の表面に溶液を広げます。
コラーゲンが乾くまで、培養フードの下に蓋をせずにプレートを放置します。その後、D-PBSで2回洗浄します。混合し、室温で5分間インキュベートする改善された最小必須培地とsiRNAをピペット。
トランスフェクション試薬と改善された最小必須培地をsiRNAとピペットに加え、混合します。室温で20分間インキュベートします。次に、コラーゲンコーティングされたプレートの各ウェルにトランスフェクションミックスを加えます。
100ミリのペトリ皿の細胞をD-PBSで2回洗います。5倍のトリプシンを細胞に加え、表面全体をトリプシンで覆います。30秒待ってから、トリプシンを慎重に取り外します。
ペトリ皿をインキュベーターで摂氏37度で5~10分間インキュベートします。その後、細胞の損傷を避けるために、細胞を取り外すために皿をタップします。ピルビン酸なしのDMEM10ミリリットル、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えてトリプシンを中和します。
慎重に上下に培地をピペットし、細胞を取り外し、細胞懸濁液を均質化します。マラッセス計房または自動セルカウンターを使用して細胞を数え、培地のミリリットル当たり0.625百万細胞に細胞の濃度を調整します。トランスフェクションミックスを含む24ウェルプレートのウェル当たり12ウェルプレートまたは400マイクロリットルの細胞懸濁液のウェル当たり800マイクロリットルの細胞懸濁液の種子。
細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートし、24時間乱散しないでください。翌日、上清をピルビン酸なしの新鮮なDMEM、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%に慎重に交換し、細胞をインキュベーターに戻します。siRNAまたはmiR送達後の標的のノックダウンを検出するための典型的なタイムポイントは、mRNAの場合は24〜48時間、タンパク質では48〜96時間である。
機能性実験は、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、アディポカイン分泌、脂肪分解、およびリポジェネシスを含むトランスフェクトされた脂肪細胞に対して行うことができる。このアディポサイトは、トランスフェクション後に形態を維持することが示されている。トランスフェクションの2日後、脂肪細胞は、トランスフェクトと非トランスフェクトされた脂肪細胞の間で異ならない脂質含有量を有する多発性脂質滴を提示した。
トランスフェクション細胞における種々の分化マーカーのmRNA発現は、非トランスフェクトされたアディポサイトと比較して変化していない。逆トランスフェクションプロトコルは、70%以上のアディポサイトがトランスフェクションされたとして効率的である。ペリリピン-1に対するsiRNAによるトランスフェクションの3日後、ペリリピン-1のmRNAレベルは70%減少し、タンパク質レベルはトランスフェクションの4日後に蛍光顕微鏡法によって63%ペリリピン-1発現を分析し、対照脂肪細胞の発現と比較して92%減少したことがわかった。
miR-34aの発現をアップレキュレートするマイクロRNAを用いたアディポサイトの逆トランスフェクションをここに示す。miR-34aの過剰発現により、VAMP2タンパク質発現が50%減少し、3T3-L1脂肪細胞におけるペリリピン-1のノックダウンが基底脂肪分解の増加につながり、miR-34aの過剰発現がインスリン誘導タンパク質キナーゼBリン酸およびグルコース取り込みの阻害につながった。新たに分化したアディポサイトのトランスフェクションを実行し、トリプシンによるアディポサイトの治療を注意深く監視するために、高レベルのアディポサイト分化に達することが重要です。
トランスフェクション後、脂肪細胞に対する機能実験を行い、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、および脂肪分解に対するタンパク質またはマイクロRNA操作の影響を研究することができる。
