この作品は、フランス国立研究機構（ANR-14-CE02-0010）によってサポートされていました。私たちは、原稿の重要な読書のための博士ベンジャミン・フィールド博士エロディLanetに感謝します。私たちは、ビデオ編集との彼の助けのために氏ミシェル・テレーズに感謝します。

20〜50％（w / v）のスクロース勾配の調製注：勾配13.2 mlの超遠心分離管中のスクロースの4層（50％、35％および20％の2層）で形成されています。我々の経験では、2つの別個の層では20％スクロースを注ぐことは大いにポリソーム製剤の品質が向上します。 <ol><li>ストック溶液を準備します。すべてのソリューションは、RNアーゼおよびDNアーゼを含まないことを確認してください。 <ol><li> 400 mMトリス塩酸pHが8.4、200 mMのKCl及び100のMgCl 2：10X塩溶液を準備します。 </li><li> 200ミリリットルのために、1X塩溶液中のスクロースの137グラムを溶解：2 Mショ糖液を準備します。 </li></ol></li><li>勾配を調製し、表1に記載されるように、塩溶液中のスクロース溶液を希釈。指定されたボリュームは6勾配のためのものです。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 最終スクロース濃度 </td><td> スクロース2M（ミリリットル） </td><td> 塩溶液1X（ミリリットル） </td><td> 最終巻。 （ml）を </td></tr><tr><td> 50％ </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35％ </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20％ </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20％ </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> 表ショ糖液の1希釈は6勾配を作製しました。 <ol start="3"><li>表2のとおり層を注ぎます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> スクロース層 </td><td> 50％ </td><td> 35％ </td><td> 20％ </td><td> 20％ </td></tr><tr><td>巻。 （ml）を</td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> 層あたりのショ糖溶液を表2巻。 <ol start="4"><li>それぞれの層を注いだ後、次のショ糖の層を追加する前に、完全に凍結するまで℃の冷凍庫-40℃または-80にチューブを保持します。凍結は、通常、-40℃で2時間後に達成されていますが、次の層を注ぐ前に、約6時間を待ってお勧めします。最後の20％の層を凍結または実験の日に新たに追加することができます。 注：次のいずれかを追加する前に、それぞれの層をフリーズすると、層の任意の混合または妨害から防ぐことができます。グラデーションは、少なくとも6ヶ月間℃の冷凍庫-40℃または-80に保つことができます。 </li><li>それはまだ行われていない場合は、実験の日に勾配に最後の20％の層を追加します。そして、勾配は低温室または冷蔵庫内で解凍しましょう​​。 </li></ol>サイトゾル抽出物の調製注：私たちはrecomm生体試料ごとに2つの勾配を使用して終了します。 300 mgを6日齢のシロイヌナズナの苗で作業するときに、2つの勾配を準備する植物材料の最適量です。以下翻訳活性組織を操作する場合、植物材料の量は600ミリグラムまで増加させることができます。 <ol><li>液体窒素中で急速凍結することにより、1％スクロースまたは同等のメディアを補っ½ムラシゲ・スクーグ8培地上で増殖させ、収穫6日齢の実生</li><li>液体窒素で予冷乳鉢と乳棒で挽く植物材料。 </li><li>予冷計量皿に粉末材料の300ミリグラムを秤量します。サンプルの融解を避けるために、迅速に、この手順を実行します。 注：-80℃の冷凍庫にせいぜい1週間凍結サンプルを保管してください。 </li><li> 50μg.ml1、予冷ポリソームバッファー（塩溶液4X、5.26 mMのEGTA、0.5％（v / v）のオクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノールは、分枝状、50μg.ml-1シクロヘキシミドの2.4ミリリットルを追加します。クロラムフェニコール）とピペットチップと混合することによって均質化します。 2 1.5ミリリットルチューブに移します。温暖化からサンプルを防ぐために、迅速に作業。 </li><li>破片をペレット化するために微量で4℃で15分間、16,000×gで遠心分離します。 注：常に、RNAの分解を防ぐために4℃でサンプルを維持するために、RNアーゼ/​​ DNアーゼを含まない条件でのRNase / DNaseを無料ソリューションと作品を使用。ヘパリンは、RNAの保護を強化するために、300μg.ml-1の最終濃度まで、ポリソーム緩衝液に添加することができます。ヘパリンは、下流分析を妨害することができるので、それは塩化リチウム析出の代わりにエタノール沈殿（参照ノート4.7）を行うことによりRNAを沈殿工程中に除去されなければなりません。 </li></ol> 3.ポリソームプロファイリング<ol><li>ペレットを乱さないように注意して上清をピペット。植物片がピペット注入された場合は、ステップ2.5を繰り返します。優しくpipettinによって勾配の上に上清をロードします一定のストリーム内のチューブの側壁の上にグラム。各1.5mlチューブ用の1の勾配を使用してください。 </li><li> （SW41ローターを使用している場合例えば32,000 rpm）で超遠心機で、4℃で2時間45分間175,000×gでバケツや遠心分離機を予冷するために転送します。 </li><li> 図1で説明したように傾斜収集システムを設定する。UVキュベットは、1 mm光路長を有しています。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> 図1勾配収集システム。UVキュベットは勾配の底部に下降するガラス毛細管にポリ塩化ビニルチューブにより接続されています。勾配は、システムを介して蠕動ポンプのおかげで進行します。 OD 260が連続的に読み取られ、2ミリリットル画分を集めている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>この図。 <ol start="4"><li> RTにフラクションコレクターを調整し、2ミリリットルの分画の収集を可能にするであろう速度でカルーセルを設定します。あらかじめ冷却したコレクションチューブを使用してください。 </li><li>傾斜収集システムにポリ塩化ビニルチューブで接続されたガラス毛細管を用いて下から上への画分を収集します。ポリ塩化ビニル管とガラス毛細管との間の接続を保護するためにプラスチックパラフィンフィルムを使用します。 </li><li>勾配の下から上に260 nmの吸光度を読みます。全体の勾配が収集されると、RNA抽出の前に氷上で回収チューブを配置します。 </li></ol> 4. RNA抽出<ol><li>以下のように、遠心管をキャップした50ミリリットルで2勾配から回収した画分を、プール： ポリソーム：画分1〜3（11 ml）を Monosomes：画分4（4ミリリットル） 上清：フラクション5と6（8ミリリットル） </li><li>各画分に、1容量を追加します。 8Mグアニジン塩酸塩50μgのアクリルキャリアおよび1.5容量。イソプロパノール。 注：アクリル担体はアルコール沈殿中の核酸の回収率を改善するための共沈剤として使用し、直鎖状アクリルアミドです。 </li><li>チューブを転倒混和し、-20℃でO / N物を沈殿。 </li><li>超遠心機で4℃、（SW32ローターで32,000 rpm）で1時間175,000×gで遠心分離します。沈殿工程は、超遠心分離と互換性がありませんチューブ内で行われている場合は、適切なチューブに移します。 </li><li>上清を捨て、200μlのRNaseフリーのTE緩衝液（10mMのTris-HCl pHが7.5から1 mMのEDTA）でペレットを溶解します。新しい1.5 mlチューブに移します。 </li><li> 1容量を追加することにより、RNAを抽出します。水飽和フェノール液（pH 6.6）および1巻。クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）。勢いよく混ぜます。 4℃で20分間、15,000×gで遠心分離します。新しい1.5 mlチューブに水相を転送します。 注：酸フェノール液（pH 4.5）DNAの混入を最小限にするために使用することができます。 </li><li>1/10体積を添加することにより、RNAを沈殿させます。 3 M酢酸ナトリウムと3体積100％エタノール。 -20℃で20分間またはO / Nのため-80℃での沈殿を許可します。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。 注：ポリソームバッファ（参照ノート2.5）にヘパリンを使用する場合は、適切に下流分析9に干渉する可能性ヘパリンの痕跡を除去するための塩化リチウム（LiClの）降水量の代わりにエタノール沈殿を行います。抽出した後、2.5 Mの最終濃度までのLiClを追加し、-20℃またはOで/ N 4℃で30分間沈殿を許可します。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。 </li><li> 500μlの75％エタノールでペレットを洗浄。空気は、ペレットを乾燥し、30μlのTE緩衝液に溶解します。 RNAseを含まない1.2％アガロースゲル（100V、15分）、またはキャピラリー電気泳動法により電気泳動によってRNAの質を評価します。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>グラフィックおよびデータ分析ソフトウェアにエクスポートした生データ。 注意： 図2AおよびBに示すように、生のプロファイルは、定性的な情報を与える：見ることができますポリソームピークの数、モノソームピークの高さ、および無料のリボソームサブユニットに対応する肩の存在を。 </li><li>サンプル間のプロファイルの比較を可能にするために、プロファイルをマージします。各サンプルのモノソームピークのX値を決定するために、スクリーンリーダーツールを使用して、曲線の先頭に余分なデータポイントを除去することにより、モノソームピークを合わせます。曲線の最低点を特定し、そのY値（スクリーンリーダーツールを使用して）を決定します。 「セットの列値」機能を使って、0に最低点のY値を設定します。 </li><li>生プロファイル（ 図3C）からの曲線下面積を積分することによってポリソーム/ monosomes比を決定します。統合される領域の境界を定義するデータ選択ツールを使用します。そして、統合機能（分析 - 数学）を使用します。 </li><li>ノーマライズ（スクリーンリーダーツールを使用して決定）モノソームピークの頂上のY値によって曲線のすべてのデータポイントを分割することによってモノソームピークにカーブ。列を選択し、[分析 - 数学の下で、ノーマライズを選択し、「指定した値で割った &quot;メソッドを選択します。このステップは、ポリソームの相対レベル（ 図3D）の比較を可能にします。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> 図2.代表的ポリソームプロファイル。 シロイヌナズナ野生型（WT、生態型COL-0）と変異苗が長い一日の光周期（16時間明、8時間暗）下½ムラシゲ・スクーグ培地上で6日間増殖させました。 ：重量苗からの生ポリソームプロファイル。 B：変異苗からの生ポリソームプロファイル。 C：曲線Dの下の面積の積分によりポリソームとmonosomesの割合の決意：ポリソームPROFIレモノソームピークに正規化された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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</ol>

The authors have nothing to disclose

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ribosomes to the mRNA (as cycloheximide does for the cytosolic ribosomes)12 . We have also reduced the total ultracentrifugation time7.
To obtain high quality polysome profiles, it is essential to use freshly collected plant material and to perform all steps at 4&#176;C. When using tissues that are poorly translationally active, more plant material can be loaded on the gradient (up to 600 mg).
Analysis of polysome profiles can provide insights into both the overall translational status of cells13 and the translational status of a specific mRNA. We have used RNAs isolated by this method for different applications. Using the RNAs for microarrays allowed us to identify a class of cadmium stress response genes for which transcription and translation are uncoupled 14. We also used this method to identify small RNAs associated with polysomal fractions. This identification was made by northern blotting15 of RNA extracted from polysomal fractions, and provided biochemical evidence for a translational component in the miRNA pathway in plants. In another study, a cis-NAT RNA was identified by quantitative RT-PCR. This cis-NAT is associated to the phosphate homeostasis and promote translation of the PHO1;2 transcript 16. 
The main limits of the polysome profiling approach are the lack of information concerning both the position of the ribosome on the mRNA and its progression along the mRNA. Ribosome profiling has emerged to address these limitations 17 and has been successfully used on plant tissues18. Ribosome profiling provides a global measurement of translation by taking advantage of the advances in sequencing technology. Nevertheless, as for any sequencing based assays, the quality of the results depends on the mapping of the sequences to the genome, therefore focusing on the small ribosome-protected fragments makes it difficult to deconvolute repetitive sequences. Moreover, the digestion of RNA not protected by the ribosomes leads to the loss of regulatory information contained in the 3' and 5' UTRs. It is then impossible to distinguish transcript variants that have different 3' or 5' UTRs and show different levels of translation19. The polysome profiling method described here is rapid and does not require specific technical skills. Altogether, these two methods represent complementary approaches to study translation regulation.

タンパク質合成は、すべてのセル1において不可欠とエネルギー的にコストのかかるプロセスです。まず第一に、細胞は、翻訳機構、リボソームの生産にエネルギーを投資しなければなりません。例えば、活発に分裂酵母細胞は毎分ほど2,000リボソームを生成します。このような生産は、総転写活性の60％及びセル2の全スプライシング活性の最大90％までを必要とします。また、エネルギーは、アミノ酸、アミノアシルtRNAおよびペプチド結合の合成に必要とされます。植物では、ATP 3の4.5〜5.9分子からペプチド鎖コスト1つのアミノ酸を付加します。したがって、変化する環境条件に対処することになる場合は特に、タンパク質へのmRNAの翻訳を調節する主要な部位であることは驚くべきことではありません。 リボソームとmRNAの関連で翻訳の開始段階では、規制の主なターゲットであります翻訳4。翻訳の調節の結果、ならびに他の転写後調節ステップとして、タンパク質濃度の変動の40％のみがmRNA量5,6によって説明することができます。このように、全mRNAの研究は、タンパク質存在量についての比較的低い情報を提供します。一方、リボソームとmRNAの関連は、翻訳に関与するそれらのmRNAへのアクセスを与えることによって、タンパク質存在量より深い洞察を提​​供します。積極的に翻訳されたmRNAはポリソームと呼ばれる構造で、いくつかのリボソームに関連付けられています。逆に、不十分な翻訳mRNAは唯一のリボソーム（モノソーム）に関連付けられます。その結果、mRNAの翻訳状態はリボソーム7との会合をモニターすることによって評価することができます。 このプロトコルは、6日齢のシロイヌナズナの苗、RNAのその後の単離、および結果の分析からポリソームの単離を記載しています。ポー川lysom​​esとmonosomesは、ショ糖密度勾配を介して分離されています。勾配は6画分に回収されます。ポリソーム、monosomesおよび軽質留分（以下、上澄み液と呼ばれる）、リボソームに関連付けられていないフリーの60Sおよび40SリボソームサブユニットとのmRNAが含まれています：画分の一部は、3つのよく分離された画分を得るためにプールされています。グローバル翻訳活性、およびポリソームプロファイルを比較することにより、曲線下面積の積分によって決定されるポリソーム/モノソーム比を生成することによって推定することができます。 mRNAおよびタンパク質は、次いで、異なる画分から抽出し、RT-PCR、定量RT-PCR、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ウエスタンブロットまたはプロテオミクスによる分析のために使用されます。このプロトコルは、他の植物との組織のために検証されています。 このプロトコルを実行するために必要な装置は、一般に、ほとんどの実験室で見られる：勾配メーカーは必要ありません。次のいずれかの防止加える前に、それぞれの層を凍結層の任意の組合せや外乱からの。いいえ管穿孔は、勾配のガラス毛細管を浸漬することによって達成することができる傾斜収集のために使用されません。したがって、高価な超遠心管が無傷のままであり、何度も再利用することができます。まとめると、これは本プロトコルポリソームプロファイリングのための簡単​​かつ安価な方法になります。

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary tube</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima series</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV cuvette</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Quartz flow-through cuvette</td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Read every 0.0125 sec</td></tr><tr><td>All chemicals</td><td>Any</td><td></td><td>Use only Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free water</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide (acryl carrier)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA precipitation carrier</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analysis software</td></tr></tbody></table>

an easy method for plant polysome profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

文献では、ポリソームプロファイルは、多くの場合、すなわち、上から下へ、勾配が収集されている方法の結果として、軽質留分からの重質留分に示されています。ここで説明されたプロトコルで勾配が下から上に収集されているので、我々が表示さプロファイルは、重質留分（ポリソーム）で始まり、軽質留分（無料リボソームサブユニットとのRNA）（ 図2A）にアクセスしてください。それから6 2mLの画分にそれぞれ勾配を収集するが、ポリソームの含有量のより詳細な分析を行う必要がある場合、小さい方の画分を採取することができます。 マージとモノソームピーク（ 図2D）に曲線を正規化することは、異なるラインまたは増殖条件からのプロファイルの比較を可能にします。これは、独立して、開始のレベルのポリソームの相対的な量の情報を提供します。にもう一つの方法プロファイルをnalyze、曲線下面積を計算することが、一つはmonosomesまたはポリソーム（ 図2C）のいずれかに関連したmRNAの相対量を決定することができるです。この比率は、植物や成長条件に固有のものです。しかし、このアプローチは乏しい翻訳活性の組織の場合には関連しないかもしれません。 我々はA.のためにこの方法を使用していますシロイヌナズナ全体苗、老いも若きもロゼット、ならびにN.用ベンタミアナ （ 図3C）、S. リコペルシカム （ 図3E）およびO.サティバの葉（ 図3D）。プロファイル形状は、成長条件、植物の年齢と分析した組織に依存します。ここでは、Aを使用しましたシロイヌナズナ 6日齢の苗。この段階では、翻訳活性が高く、プロファイルがよく、成形ピーク（ 図2AおよびB）を示しています。また、これはケースですときA.シロイヌナズナ花（ 図3A）に使用されます。 4週齢Aを使用する場合シロイヌナズナロゼット（ 図3B）、サンプルは主に細胞が分裂しない場合に、完全に発達した大人の葉が含まれています。したがって、ポリソームとmonosomesの全体的な量が低くなっています。プロファイルは少ないが、それでも十分に形ポリソームピークを示します。モノソームピークの隣に、肩が自由60Sリボソームサブユニットの大規模な量を示しています。植物または組織の他の種類では、ポリソームのピークはほとんど見えないかもしれません。 30日齢Oを使用した場合でありますサティバの葉（ 図3D）。翻訳に関与するmRNAの量が（ないポリソームピークプロファイルで見ることができない）非常に低い場合であっても、モノソームピークの存在は、分別が正しく行われたことを示し、mRNAはさらに、さらなる分析のための画分から抽出することができます。抽出したRNAの質の質をアガロースゲル電気泳動によって評価されます（ <str<html>オング&gt;図4）。 25Sおよび18S細胞質ゾルリボソームRNAは、ゲル上ではっきりと見えるはずです。 RNAは緑の組織10から抽出された場合葉緑体リボソームRNAに対応する下位バンドも表示されるはずです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig3.jpg" /> 3. ポリソーム異なる植物材料からのプロファイルと種を 図 。 （A） シロイヌナズナの花（300mgの）、（B）、シロイヌナズナ 4週齢ロゼット（600mgの）、（C） ベンサミアナタバコ （40日齢短日-生育した植物の若葉- 300mgの）、（D） オリザ・サティバ （ 30日齢植物の葉- 300mgの）、（E） トマト （35日齢短日-生育した植物の若葉- 300mgの）。モノソームピークは矢印で示されています。ジル/ ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig4.jpg" /> 図4に示さ画分からのRNA品質 RNA の評価は、（500 ngの6日目のシュート古いシロイヌナズナの苗から抽出された）を1.2％アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。（100V - 15分）。サイトゾル（25Sおよび18S）のrRNAは、矢頭や葉緑体ブラケットによって（23Sおよび16S）のrRNAで示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Easy Method for Plant Polysome Profiling

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  Aix-Marseille Université. This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

ビデオ: An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

生化学

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

発生生物学

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

生物学

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper describes methods optimized to isolate plant-derived polyribosomes and their associated mRNAs to be analyzed using RNA-sequencing. First, cytoplasmic lysates are obtained through homogenization in polysome- and RNA-preserving conditions from whole, frozen soybean nodules. Then, lysates are cleared by low-speed centrifugation, and 15% of the supernatant is used for total RNA (TOTAL) isolation. The remaining cleared lysate is used to isolate polysomes by ultracentrifugation through a two-layer sucrose cushion (12% and 33.5%). Polysome-associated mRNA (PAR) is purified from polysomal pellets after resuspension. Both TOTAL and PAR are evaluated by highly sensitive capillary electrophoresis to meet the quality standards of sequencing libraries for RNA-seq. As an example of a downstream application, after sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to obtain differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels. In summary, this method, in combination with RNA-seq, allows the study of the translational regulation of eukaryotic mRNAs in a complex tissue such as the symbiotic nodule.

This protocol describes a method for eukaryotic polysome purification from intact soybean nodules. After sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to identify differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels.

ダイズ共生団塊からのポリソーム精製

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

神経科学

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

工場ポリソームプロファイリングのための簡単な方法

要約

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リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

ダイズ共生団塊からのポリソーム精製

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

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要約

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