Name: an easy method for plant polysome profiling
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
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Diese Arbeit wurde von der Französisch nationalen Forschungsagentur (ANR-14-CE02-0010) unterstützt. Wir danken Dr. Benjamin Field und Dr. Elodie Lanet für das kritische Lesen des Manuskripts. Wir danken Herrn Michel Terese für seine Hilfe bei Videobearbeitung.

1. Herstellung von 20 bis 50% (w / v) Saccharosegradienten Anmerkung: Die Gradienten sind aus 4 Schichten von Saccharose (50%, 35% und 2 Schichten aus 20%) in 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen. Unserer Erfahrung nach in zwei getrennten Schichten, die die 20% Saccharose Gießen verbessert die Qualität der Polysoms Zubereitungen. <ol><li> Bereiten Sie die Stammlösungen. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen RNAse und DNAse frei. <ol><li> Bereiten 10X Salzlösung: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl und 100 mM MgCl 2. </li><li> Bereiten Sie 2 M Saccharose-Lösung: Für 200 ml, lösen sich 137 g Saccharose in 1X Salzlösung. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Saccharose-Lösung in Salzlösung, wie in Tabelle 1 beschrieben, um die Steigungen vorzubereiten. Die Volumina beziehen sich auf sechs Steigungen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Endgültige Saccharosekonzentration </td><td> Sucrose 2M (ml) </td><td> Salzlösung 1X (ml) </td><td> Finale Vol. (ml) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Verdünnungen der Saccharose - Lösung sechs Steigungen vorzubereiten. <ol start="3"><li> Gießen Sie die Schichten gemäß Tabelle 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sucrose Schicht </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (Ml) </td><td> 1,85 </td><td> 3,65 </td><td> 3.65 </td><td> 1,35 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Volumen von Saccharoselösung pro Schicht. <ol start="4"><li> Nach jeder Schicht Gießen, halten Sie die Röhrchen in einem -40 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank bis zur vollständigen Einfrieren, bevor die nächste Schicht Saccharose Zugabe. Das Einfrieren ist in der Regel nach 2 Stunden bei -40 ° C erreicht, sondern warten etwa 6 Stunden, bevor die nächste Schicht wird empfohlen, zu gießen. Die letzten 20% Schicht kann frisch des Experiments am Tag eingefroren oder hinzugefügt werden. Hinweis: jede Schicht Einfrieren bevor Sie die nächste Zugabe von jeder Vermischung oder Störung der Schichten verhindert. Gradienten können in einem -40 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank für mindestens sechs Monate aufbewahrt werden. </li><li> Wenn sie nicht bereits geschehen ist, fügen Sie den Gradienten am Tag des Experiments die letzten 20% Schicht. Dann lassen Sie die Steigungen in einem kalten Raum auftauen oder einen Kühlschrank. </li></ol> 2. Herstellung von Cytosolextrakten Hinweis: Wir empfmit zwei Steigungen pro biologischen Probe zu beenden. 300 mg ist die optimale Menge an Pflanzenmaterial zwei Steigungen vorzubereiten , wenn sie mit 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen arbeiten. Wenn es mit weniger translational aktiven Geweben arbeiten, kann die Menge an Pflanzenmaterial erhöht werden, bis zu 600 mg. <ol><li> Ernte 6 Tage alten Sämlinge wachsen auf ½ Murashige und Skoog 8 - Medium mit 1% Saccharose oder gleichwertigen Medien ergänzt durch das Tiefgefrieren in flüssigem Stickstoff </li><li> Grind Pflanzenmaterial in einem vorgekühlten Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Man wiegt 300 mg pulverisiertes Material in einem vorgekühlten Waagschale. Führen Sie diesen Schritt schnell Auftauen der Probe zu vermeiden. Hinweis: Halten Sie die gefrorenen Proben für nicht mehr als eine Woche in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Hinzufügen 2,4 ml vorgekühltem Polysomen - Puffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) Octylphenoxy - poly (ethylenoxy) ethanol, verzweigt, 50 μg.ml -1 Cycloheximid, 50 μg.ml 1Chloramphenicol) und homogenisieren, indem sie mit der Pipettenspitze vermischt wird. Übertragen in zwei 1,5-ml-Röhrchen. Arbeiten Sie schnell die Proben, um zu verhindern Erwärmung. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge zur Pelletierung Schutt. Hinweis: Um die RNA-Abbau zu verhindern, halten immer die Proben bei 4 ° C, verwenden RNase / DNase frei Lösungen und arbeiten in RNase / DNase freien Bedingungen. Heparin kann in die Polysomen - Puffer zugegeben werden, bis zu einer Endkonzentration von 300 μg.ml -1, RNA - Schutz zu verbessern. Da jedoch Heparin mit nachgeschalteter Analyse stören kann, wird es durch Ausführen einer Lithiumchloridfällung anstelle von Ethanolfällung (siehe Anmerkung 4.7) während der RNA-Fällungsschritt entfernt werden. </li></ol> 3. Polysomen Profilieren <ol><li> Sorgfältig pipettieren den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Wenn Pflanzenfragmente pipettiert wurden, wiederholen Sie Schritt 2.5. Laden Sie den Überstand auf der Oberseite des Gradienten durch sanft pipetting auf die Seitenwand des Röhrchens in einem konstanten Strom. Verwenden Sie einen Gradienten für jede 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Transfer zum vorgekühlten Eimer und Zentrifuge bei 175.000 xg für 2 h 45 min bei 4 ° C, in einer Ultrazentrifuge (zB 32.000 Umdrehungen pro Minute bei einem SW41-Rotor verwendet wird). </li><li> Stellen Sie den Gradienten Sammelsystem auf , als in Figur 1 beschrieben ist . Die UV - Küvette hat einen 1 mm Weglänge. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Abbildung 1. Gradient Sammelsystem. Die UV - Küvette wird durch Polyvinylchlorid Schlauch auf eine Glaskapillare verbunden, die auf dem Boden des Gradienten abfällt. Die Steigung schreitet durch das System dank einer Schlauchpumpe. OD 260 wird kontinuierlich gelesen und 2 ml - Fraktionen werden gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen</a>diese Figur. <ol start="4"><li> Stellen Sie den Fraktionssammler auf RT und setzen Sie das Karussell mit einer Geschwindigkeit, die die Sammlung von 2 ml Fraktionen ermöglichen. Verwenden Sie vorgekühlten Sammelröhrchen. </li><li> Sammeln Sie die Fraktionen von unten eine Glaskapillare von Polyvinylchlorid Schlauch mit dem Gradienten Sammelsystem verbunden nach oben mit. Mit einem Kunststoffparaffinfilm die Verbindung zwischen dem Polyvinylchlorid-Rohr und der Glaskapillare zu sichern. </li><li> Die Extinktion bei 260 nm von der Unterseite zur Oberseite des Gradienten. Wenn der gesamte Gradienten gesammelt wird, legen Sie die Sammelröhrchen auf Eis vor der RNA-Extraktion. </li></ol> 4. RNA-Extraktion <ol><li> Pool der Fraktionen aus zwei Gradienten gesammelt, in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit einer Kappe bedeckt, wie folgt: Polysomen: Fraktionen 1 bis 3 (12 ml) Monosomes: Fraktion 4 (4 ml) Überstand: Fraktionen 5 und 6 (8 ml) </li><li> Zu jeder Fraktion, fügen Sie 1 vol. 8M Guanidin-Hydrochlorid,50 &amp; mgr; g Acrylträger und 1,5 Vol. Isopropanol. Hinweis: Acryl Träger lineares Acrylamid, als Co-Fällmittel verwendet, um die Rückgewinnung von Nukleinsäuren während Alkoholfällung zu verbessern. </li><li> Mischen Sie durch die Rohre Umkehren und O / N bei -20 ° C auszufallen. </li><li> Zentrifuge bei 175.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge (32.000 rpm in einem SW32 Rotor). Wenn das Fällungsschritt in einem Rohr durchgeführt wird, die nicht kompatibel mit Ultrazentrifugation ist, zu einem geeigneten Rohr. </li><li> Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 200 &amp; mgr; l RNAse-freiem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Übertragen auf ein frisches 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Extrahieren RNA durch Zugabe von 1 vol. Wasser gesättigtem Phenol (pH 6,6) und 1 Vol. Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1). Gründlich mischen. Zentrifuge bei 15.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Anmerkung: Säure Phenol (pH 4.5) kann verwendet werden, um DNA-Kontamination zu minimieren. </li><li>Ausfällen RNA von 1/10 Vol Zugabe. 3 M Natriumacetat und 3 vol. 100% Ethanol. Lassen Sie Fällung bei -80 ° C für 20 min oder O / N bei -20 ° C. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Hinweis: Wenn in der Polysomen - Puffer (vgl Note 2.5), führen ein Lithiumchlorid (LiCl) Fällung anstelle von Ethanolfällung unter Verwendung von Heparin richtig jede Spur von Heparin zu entfernen , die 9 mit nachgeschalteter Analyse stören könnten. Nach der Extraktion hinzufügen LiCl zu einer Endkonzentration von 2,5 M. Niederschlag Lassen Sie für 30 Minuten bei -20 ° C oder O / N bei 4 ° C. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 500 ul 75% Ethanol. Air das Pellet trocknen und in 30 ul TE-Puffer lösen. Beurteilen RNA Qualität durch Elektrophorese auf einem RNAse frei 1,2% Agarosegel (100 V, 15 min) oder durch Kapillarelektrophorese Methoden. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Export-Rohdaten in eine Grafik und Datenanalyse-Software. Hinweis: Wie in 2A und B gezeigt, geben die Rohprofile qualitative Informationen: die Anzahl der Polysoms Spitzen, die die Höhe des monosome Spitze, und das Vorhandensein einer Schulter entsprechend den freien Ribosomen - Untereinheiten zu sehen ist. </li><li> Merge Profile Vergleich der Profile zwischen den Proben zu ermöglichen. indem zusätzliche Datenpunkte zu Beginn der Kurven Verwenden Sie den Bildschirmleser Werkzeug, um den X-Wert des monosome Spitze für jede Probe zu bestimmen und die monosome Gipfel auszurichten. Identifizieren Sie den tiefsten Punkt der Kurve und bestimmen dessen Y-Wert (mit dem Screenreader-Tool). Stellen Sie den tiefsten Punkt Y-Wert auf 0, indem Sie den &quot;Set Spalten Wert&quot; -Funktion. </li><li> Bestimmen Sie den Polysomen / monosomes Verhältnis , indem die Fläche unter der Kurve von Rohprofile (3C) zu integrieren. Verwenden Sie die Datenauswahlwerkzeug die Grenze des Gebiets zu definieren, zu integrieren. Dann die Integration verwenden Funktion (Analysis-Mathematik). </li><li> Normalisierendie Kurven an den monosome Spitze durch alle Datenpunkte einer Kurve von der Y-Wert des Gipfels des monosome Spitzenteilung (bestimmt den Screenreader-Tool). Wählen Sie die Spalte, dann unter Analysis-Mathematik, wählen Sie Normalisieren und wählen Sie die &quot;geteilt durch einen bestimmten Wert&quot; Methoden. Dieser Schritt ermöglicht einen Vergleich der relativen Pegel von Polysomen (Abbildung 3D). </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Polysoms Profile. Arabidopsis thaliana Wildtyp (wt, Ökotyp Col-0) und mutierten Keimlinge wurden für sechs Tage auf ½ Murashige und Skoog - Medium unter langen Tag Photoperiode gezüchtet (16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit). A: roh Polysoms Profile wt Sämlinge. B: roh Polysoms Profile aus dem mutierten Sämlinge. C: Die Bestimmung des Prozentsatzes von Polysomen und monosomes durch Integration der Fläche unter der Kurve D: Polysomen Profiles zum monosome Spitze normalisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ribosomes to the mRNA (as cycloheximide does for the cytosolic ribosomes)12 . We have also reduced the total ultracentrifugation time7.
To obtain high quality polysome profiles, it is essential to use freshly collected plant material and to perform all steps at 4&#176;C. When using tissues that are poorly translationally active, more plant material can be loaded on the gradient (up to 600 mg).
Analysis of polysome profiles can provide insights into both the overall translational status of cells13 and the translational status of a specific mRNA. We have used RNAs isolated by this method for different applications. Using the RNAs for microarrays allowed us to identify a class of cadmium stress response genes for which transcription and translation are uncoupled 14. We also used this method to identify small RNAs associated with polysomal fractions. This identification was made by northern blotting15 of RNA extracted from polysomal fractions, and provided biochemical evidence for a translational component in the miRNA pathway in plants. In another study, a cis-NAT RNA was identified by quantitative RT-PCR. This cis-NAT is associated to the phosphate homeostasis and promote translation of the PHO1;2 transcript 16. 
The main limits of the polysome profiling approach are the lack of information concerning both the position of the ribosome on the mRNA and its progression along the mRNA. Ribosome profiling has emerged to address these limitations 17 and has been successfully used on plant tissues18. Ribosome profiling provides a global measurement of translation by taking advantage of the advances in sequencing technology. Nevertheless, as for any sequencing based assays, the quality of the results depends on the mapping of the sequences to the genome, therefore focusing on the small ribosome-protected fragments makes it difficult to deconvolute repetitive sequences. Moreover, the digestion of RNA not protected by the ribosomes leads to the loss of regulatory information contained in the 3' and 5' UTRs. It is then impossible to distinguish transcript variants that have different 3' or 5' UTRs and show different levels of translation19. The polysome profiling method described here is rapid and does not require specific technical skills. Altogether, these two methods represent complementary approaches to study translation regulation.

Die Proteinsynthese ist ein wesentlicher und energetisch kostspieliger Prozess in allen 1 - Zellen. Zuallererst Zellen müssen Energie in der Herstellung der Translationsmaschinerie, die Ribosomen investieren. Zum Beispiel erzeugt eine teilungsaktiven Hefezelle so viel wie 2000 Ribosomen pro Minute. Eine solche Produktion erfordert bis 60% der Gesamttranskriptionsaktivität und bis zu 90% der Gesamt Spleißen Aktivität der Zelle 2. Zusätzlich wird Energie für die Synthese von Aminosäuren, Aminoacyl-tRNA und Peptidbindungen erforderlich. In Pflanzen, das Hinzufügen einer Aminosäure einer Peptidkette Kosten 4,5-5,9 Moleküle ATP 3. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Translation von mRNA zu Protein ein wichtiger Ort der Regulierung, vor allem, wenn es mit wechselnden Umweltbedingungen fertig zu werden. Die Einleitung Schritt der Übersetzung, dass die Assoziation einer mRNA mit dem Ribosom ist, ist das Hauptziel der RegulierungÜbersetzung 4. Als Folge der Regulation der Translation sowie andere post-transkriptionale regulatorische Schritte können nur 40% der Variationen in Proteinkonzentration von mRNA Menge 5,6 erläutert. So gibt die Studie der Gesamt-mRNA relativ schlechte Informationen über Protein Hülle und Fülle. Auf der anderen Seite gibt der Verband der mRNA mit Ribosomen besseren Einblick in die Proteinmenge durch den Zugang zu diesen in Translation beteiligt mRNAs zu geben. Aktiv werden übersetzt mRNAs mit mehreren Ribosomen in Strukturen genannt Polysomen assoziiert. Im Gegensatz dazu wird schlecht übersetzt mRNAs mit nur einem Ribosom (monosome) zugeordnet werden. Folglich kann die Translations Status einer mRNA durch Überwachung seiner Verbindung mit Ribosomen 7 ausgewertet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Polysomen aus 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlinge, die anschließende Isolierung von RNA und die Analyse der Ergebnisse. Polysomes und monosomes werden durch einen Saccharose-Dichtegradienten getrennt. Gradienten werden in sechs Fraktionen gesammelt. Einige der Fraktionen werden vereinigt drei zu erhalten gut getrennten Fraktionen: Polysomen, monosomes und die Leichtfraktion (im Folgenden als Überstand), die enthält die freien 60S und 40S ribosomalen Untereinheiten und mRNAs, die nicht mit Ribosomen assoziiert. Globale Translationsaktivität kann durch Erzeugen eines Polysomen / monosome Verhältnis geschätzt werden, die durch Integration der Fläche unter der Kurve bestimmt wird, und durch die Polysomen Profilen verglichen wird. mRNAs und Proteine ​​werden dann aus den verschiedenen Fraktionen und zur Analyse mittels RT-PCR, qRT-PCR, Northern Blot, Microarray, Western-Blot oder Proteomik extrahiert. Dieses Protokoll wurde für andere Pflanzen und Geweben validiert. Das Gerät benötigt, um dieses Protokoll zu erfüllen sind häufig in den meisten Labors gefunden: Es besteht keine Notwendigkeit für einen Gradienten ausgestattet. Einfrieren jede Schicht bevor die nächste Zugabe verhinderns aus einem Mix oder Störung der Schichten. Kein Schlauch piercer für Gradienten Sammlung verwendet, die durch Eintauchen eines Glaskapillarrohres in dem Gradienten erreicht werden kann. Daher bleiben die teuren Ultrazentrifugenröhrchen unbeschädigt und wiederverwendet oft werden kann. Zusammen macht dies das vorliegende Protokoll eine einfache und billige Methode für Polysoms Profilierung.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary tube</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima series</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV cuvette</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Quartz flow-through cuvette</td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Read every 0.0125 sec</td></tr><tr><td>All chemicals</td><td>Any</td><td></td><td>Use only Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free water</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide (acryl carrier)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA precipitation carrier</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analysis software</td></tr></tbody></table>

an easy method for plant polysome profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

In der Literatur sind Polysomen Profile oft aus der leichten Fraktion in die Schwerfraktion als Ergebnis der Art und Weise gezeigt sind, die Gradienten gesammelt, also von oben nach unten. Da in dem beschriebenen Protokoll hier die Gradienten von unten nach oben gesammelt werden, mit der schweren Fraktion (die Polysomen) und gehen die Profile zeigen wir auf die leichte Fraktion (freie Ribosomen - Untereinheiten und RNAs) (2A) beginnen. Wir sammeln dann jeden Gradienten in sechs 2-ml-Fraktionen, aber auch kleinere Fraktionen können gesammelt werden, wenn eine detailliertere Analyse der Polysoms Inhalt durchgeführt werden muss. Zusammenführen und die Normierung der Kurven auf die monosome Peak (2D) ermöglicht den Vergleich von Profilen aus verschiedenen Linien oder Wachstumsbedingungen. Sie liefert Informationen über die relative Menge von Polysomen unabhängig von der Höhe der Initiation. Eine weitere Möglichkeit, eineAlysieren die Profile ist die Fläche unter der Kurve zu berechnen, so kann man die relative Menge an mRNA bestimmen mit zugehörigem entweder den monosomes oder den Polysomen (Abbildung 2C). Dieses Verhältnis ist spezifisch für eine Pflanze und Wachstumsbedingungen. Jedoch kann dieser Ansatz nicht in dem Fall von schlecht translatorisch aktiven Geweben relevant sein. Wir haben diese Methode für A verwendet thaliana ganze Sämlinge, junge und alte Rosetten sowie für N. benthamiana (3C), S. lycopersicum (Abbildung 3E) und O. sativa Blätter (3D). Die Profilform hängt von den Wachstumsbedingungen, Pflanzenalter und den analysierten Geweben. Hier haben wir A. thaliana 6 Tage alten Keimlingen. In diesem Stadium ist die Translationsaktivität hoch ist , und das Profil zeigt , gut geformte Spitzen (2A und B). Dies ist auch der Fall,wenn A. thaliana Blumen verwendet (Abbildung 3A). Bei der Verwendung von 4 Wochen alt A. thaliana Rosetten (3B), enthalten die Proben meist voll entwickelten Erwachsenen lässt , wo Zellen teilen sich nicht. Daher ist die Gesamtmenge an Polysomen und monosomes niedriger. Das Profil zeigt weniger, aber immer noch gut Polysoms Spitzen geformt. Neben dem monosome Spitze zeigt die Schulter, um die große Menge an freiem 60S ribosomalen Untereinheiten. Mit anderen Art von Pflanzen oder Geweben können die Polysoms Peaks können kaum sichtbar. Dies ist der Fall , wenn sie 30 Tage alt O. Verwendung sativa Blätter (3D). Selbst wenn die Menge an mRNAs in Translation beteiligt ist sehr niedrig (kein Polysomen peak kann auf das Profil zu sehen), das Vorhandensein des monosome peak zeigt an, dass die Fraktionierung richtig durchgeführt wurde und daß mRNAs kann weiter aus der Fraktion für eine weitere Analyse entnommen werden . Die Qualität der extrahierten RNA-Qualität wird durch Agarose-Gelelektrophorese beurteilt ( <str<html> Ong&gt; Abbildung 4). Die 25S und 18S ribosomale RNA cytosolischen sollte auf dem Gel deutlich sichtbar sein. Untere Bänder Chloroplasten ribosomale RNA entsprechend sollte auch sichtbar sein , wenn die RNA aus grünen Geweben 10 extrahiert werden. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig3.jpg" /> Abbildung 3. Polysomen Profile aus verschiedenen Pflanzenmaterial und Arten. (A) Arabidopsis thaliana Blumen (300 mg), (B) Arabidopsis thaliana 4 Wochen alt Rosetten (600 mg), (C) Nicotiana benthamiana (junge Blätter von 40 Tage alt kurzen Tageswachsene Pflanzen - 300mg), (D) Oryza sativa ( Blätter 30 Tage alten Pflanzen - 300 mg), (E) Solanum lycopersicum (junge Blätter von 35 Tage alt kurzen Tageswachsene Pflanzen - 300 mg). Die monosome Peaks sind durch Pfeile angedeutet ist.iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig4.jpg" /> . (- 15 min 100V) Abbildung 4. Beurteilung der RNA - Qualität RNA aus den angegebenen Fraktionen wurden geladen auf einem 1,2% Agarosegel und durch Elektrophorese (500 ng von Sprossen von 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen extrahiert). Cytosolic (25S und 18S) rRNA angegeben werden durch Pfeilspitzen und Chloroplasten (23S und 16S) rRNA durch eine Klammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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An Easy Method for Plant Polysome Profiling

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Aufrufe.  Aix-Marseille Université. This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Serie: An Easy Method for Plant Polysome Profiling

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Forschung

Biochemie

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biologie

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper describes methods optimized to isolate plant-derived polyribosomes and their associated mRNAs to be analyzed using RNA-sequencing. First, cytoplasmic lysates are obtained through homogenization in polysome- and RNA-preserving conditions from whole, frozen soybean nodules. Then, lysates are cleared by low-speed centrifugation, and 15% of the supernatant is used for total RNA (TOTAL) isolation. The remaining cleared lysate is used to isolate polysomes by ultracentrifugation through a two-layer sucrose cushion (12% and 33.5%). Polysome-associated mRNA (PAR) is purified from polysomal pellets after resuspension. Both TOTAL and PAR are evaluated by highly sensitive capillary electrophoresis to meet the quality standards of sequencing libraries for RNA-seq. As an example of a downstream application, after sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to obtain differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels. In summary, this method, in combination with RNA-seq, allows the study of the translational regulation of eukaryotic mRNAs in a complex tissue such as the symbiotic nodule.

This protocol describes a method for eukaryotic polysome purification from intact soybean nodules. After sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to identify differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels.

Polysomenreinigung aus Sojabohnen-Symbiose-Knötchen

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Entwicklungsbiologie

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Neurowissenschaften

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...