We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ポリソームプロファイリングは、異なる処置条件下での特異的転写物の翻訳の状態の定量化を可能にする強力な技術である。それはまだそれが良いソームプロファイルを生成するために重要であるそのうちのいくつかは、実行のいくつかのステップを必要とし、原則として、非常に単純な手法である。これらの重要なステップは次のとおりです。1）RNaseフリー化学物質やプラスチック製品を使用して、2）優れたショ糖勾配を（我々の経験では10-50％スクロース勾配が効率的にバインドされたリボソームを持つ40 / 60SサブユニットとmRNAを解決するための最善の仕事）を​​製造し、3 ）指数関数的に翻訳の最高速度を捕捉するために成長し、80％以下のコンフルエントされた細胞を使用。そのような遺伝子ノックダウンまたは過剰発現する限り、細胞治療を行う際にめっきする細胞の量は、細胞は、エンドポイントでコンフルエントにどれだけの関数になるように、この後者のステップは、考慮されるべきである。 結果にPRESENテッドはここで、ポリソームプロファイル分析は、IRES-保有するmRNA XIAPおよびBcl-xLの12の翻訳調節にPDCD4の役割を評価するための重要なツールでした。我々はPDCD4ノックダウン（ 図1B）の際に、一般的なポリソームプロファイルの変化を観察しなかったという事実は、私たちはPDCD4、実験の条件の下でグローバルセルラー翻訳を損なわなかったと結論することができました。我々は次に、PDCD4または対照siRNAで処理した細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布を決定するために、RT-qPCR分析を使用した。それはmRNAの分布を定量的にではなく、半定量的分析のために、および処置の間の翻訳効率の微妙なシフトの検出を可能にするため、定量PCRは、標準的なRT-PCRまたはノーザンブロット法とは対照的に、ポリソームプロファイルを分析するために選択される方法である。この技術を用いて、XIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布は、（グラムでの合計は、標的mRNAのパーセントとして表されていることを示すことができたadient）PDCD4がノックダウン後に有意したがって、これらのmRNAの翻訳の増加を示している（ 図1D、E）重いポリリボソーム（それらに関連するリボソームの数が多いのmRNA）にシフトした。これをさらにXIAPおよびBcl-xLのタンパク質レベルではなく、それらの定常状態のRNAレベル（ 図1F、G）の増加によって確認された。重要なことは、XIAPの非IRES変異体のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）の間で変化しなかった。代わりに、翻訳効率は14（通常2〜4を留分）モノソーム対ポリソーム中のmRNA量の比率（通常は5から10分画）として提示することができた。 254nmでの吸光度測定から観察されたピークが自分でリボソームRNA（洗剤に起因することができないようなプロトコルを通じてコン​​トロールの使用は、結果プロファイリング任意のポリソームを検証する上で重要であるトリトンX-100のようなsは、強く）スペクトルのこの領域で吸収し、勾配の最上部40 / 60Sピークを不明瞭にすることができる。溶解物なしで、および/または溶解物緩衝液ブランク勾配は、254nmにおける吸光度のバッファの相対的な寄与を決定するために実行される必要がある。人為的な高次構造も事実なしで（ 例えば 「擬似ポリソーム」20）があるポリソームの誤った解釈につながることができます。 EDTAが溶解物への勾配緩衝液（15分間の20mM）に加え、二価カチオンキレート剤は、その成分の小さい（40S）にリボソームの分離を引き起こし、大きな（60Sになると（80Sリボソームを安定化するための手順を通して使用される）、マグネシウムを封鎖）サブユニット。 260nmで記録された吸光度ピークがポリソーム確かであればこのように、EDTA処理は、単一の最大値は、mRNAとリボソームユニットを解放するために対応する勾配の最上部付近に観察されるように、プロファイルを崩壊する（データは示さず）。一致するプロファイルのEDTA誘発性崩壊で、定量PCRによって分析具体的な目標のすべてが今、勾配の上部に見つかるはずです。 mRNAと関連したリボソームの数は、常に特定のmRNAが翻訳されていることをどのように効率的にするものではありません。実際、ポリソーム上のアクティブな変換は、読者が知っておくべき21,22失速となるような特定のコンテキストがあります。転写物は積極的にEDTAとは異なり、「流出」を積極的mRNAを横切って転位されたリボソームを引き起こすピューロマイシンで試料を処理すること）により行うことができる翻訳機構に係合し、またはb）試料を処理しているか否かを判定する再び、任意の下流の転位リボソームの「流出」を引き起こし、開始コドンでのみ最初のリボソームの転位を抑制するホモハリングトニンと。 qPCR分析のための制御転写物の使用も重要である。セレクXIAP IRESの非IRES変種など、いくつかのハウスキーピング遺伝子（GAPDH、アクチン、チューブリン、ヌクレオリン）、リボソームのmRNA（18S、RPL13A）などの異なる処理条件によって、またはこの場合には影響を受けません転写物るが、中には重要である翻訳に対する治療の効果は、特定または一般化されている場合を検証。 XIAPおよびBcl-xLのmRNAはGAPDH mRNAに対して標準化し、すべての画分中のmRNA含有量の和で表される全mRNA含量の百分率として表し（ここで行ったように、これらの制御転写産物は、分析のmRNAの分布を正規化するために使用することができ）、又は代替的に、標的および対照mRNAは、絶対値として表され、別々に表示することができる。入力された溶解物（総体積の通常10％）のqPCR分析は、特定のmRNAの分布のた​​めに制御するもう一つのステップである。理想的には、入力された溶解物中の特定の転写物のmRNA含有量を分析し、すべての10の画分中のmRNA量の合計に匹敵する必要があります。最終的にフェノールのために制御するための任意のステップ：クロロホルム抽出工程（たとえばCAT、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど） のin vitro転写レポーターmRNAと各ポリソーム画分をスパイクすることで、その後、qPCRにより定量化され、さらに正規化するために使用することができるデータ14。 任意の技術と同様に、ポリソームプロファイリングは、いくつかの制限を提示します。通常、10画分の最小（変換効率のより微妙なシフトが20以上を必要とするかもしれない）素晴らしいポリソーム分布を有するために収集する必要があるという事実は、4つのサンプルのみを最大とすることができるという意味で、このステップは制限させる快適に一度に40個のサンプルと4の入力コントロールのRNA抽出およびqPCR分析を扱うことができるように時間に分析した。サンプルサイズは、容易に定量PCRを行うためにレプリケートする方法の多くの転写物解析されるべきであり、何を追加することができ、これはコストがかかる。プロファイリング定量PCRベースのポリソームの別の制限nalysisはそれだけで（分析される転写物が予め分かっている）は、候補ベースの手法で行うことができ、翻訳のゲノムワイドな解析のために適用することができないことである。しかし、21 世紀の初めに、研究者らは、DNAを用いてゲノムレベルでのそれらのポリソームRNAを調べるために開始した次世代シーケンス16,17とより最近15とをマイクロアレイ。むしろ個々の画分の定量PCR解析を行うよりも、ことを除いて、このプロトコルで説明したように、この強力なアプローチでは、ポリソームプロファイリングが行われ、グローバルな翻訳にフラクション（通常分2-4）およびポリソーム画分（通常留分）を一緒にプールされ、バリエーションを分析したモノソームDNAマイクロアレイまたは全ゲノムRNA配列決定によって。したがって、このアプローチでは、特定の治療の際に、その分布のシフトポリソームからモノソームに（翻訳の減少）またはその逆（翻訳の増加）全てのmRNAを評価することが可能であるメント。特定のmRNAのポリソーム分布の検証および定量化は、その後qPCRにより行うことができる。ポリソームプロファイリング原理のさらに強力な使用はリボソームプロファイリングです。この技術のさらなる高スループット拡張がポリソーム画分23の何百もの同時モニタリングが可能になることが最近報告された。変異体のコレクションや大規模RNAiスクリーニングの並進効率をプロービングするときに明確な利点を提供する。リボソームプロファイリングは、タンパク質合成24,25に従事リボソーム（リボソームフットプリント）によって保護RNA断片をマッピングするために、次世代シークエンシングを利用している技術である。この技術では、リボソームの転位は、リボソーム足跡の集団を得るために細胞溶解およびRNase消化に続いて（可逆）、シクロヘキシミドまたはエメチン（不可逆的）を抑制することができる。リボソームは、濃縮された全RNAを単離し、夾雑リボソームおよびミトコンドリアリボソームRNAを除去する。約26〜28ヌクレオチドのRNA足跡を単離し、逆転写、cDNAライブラリーに変換され、26を配列決定した。標準ポリソームプロファイリングとは異なり、このアプローチは、翻訳制御されている特定のmRNAを識別するだけでなく、そのような特定の転写物に沿ってリボソームの正確な占有密度などコドン解像度でのmRNAに固有の情報が得られる。それは転写物上リボソームの募集が行われている場所の詳細な情報を与えることができるので、これは、そのようなIRES-保有するmRNAの翻訳などの特定のモードを持つmRNAをするために特に重要である。

タンパク質合成（翻訳）の調節は、密接に細胞生存にリンクされている重要な細胞プロセスです。翻訳が細胞のエネルギーの50％以上を消費することを考慮すると、変換が厳密に調節されていること、および翻訳の摂動が十分に許容されていないことは驚くべきことではない。逆に、多くの異常な細胞プロセスは、翻訳機構と翻訳出力（ すなわちプロテオーム）を修正しなければならないことを要求している。これは、しばしば、様々なストレス応答および疾患状態における場合であり、おそらく最も癌に例示されている。翻訳制御の重要な利点は、迅速に、様々な外部及び内部トリガー、先端細胞生存および死亡1のバランスそれによって微調整機構に応じて、タンパク質の出力を再プログラムする細胞の能力である。 翻訳制御には2つの側面は、特に興味深いものです。規制MECの性質の理解hanism（単数または複数）と特定の変換を可能にする制御エレメントは、特定のmRNAおよび最初の場所で選択的翻訳を誘発し、特定のトリガに対する細胞応答に関与するそれらのタンパク質産物の同定。ソームプロファイリングは、両方のプロセスの効果的な研究を可能にする技術である。 ポリソームプロファイリング技術の全体的な目標は、異なる細胞条件下で特定のmRNAの翻訳状態を研究し、定量化することである。技術の原理は、「異なる転写産物上で「積極的に翻訳するリボソームを「凍結」することによってmRNAの翻訳を取り込むため、（数リボソームによって結合された）高度に翻訳された転写産物の区別を考慮して、ショ糖勾配上で遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することで、不十分（1つまたは2つのリボソームによって結合された）ものを翻訳した。この特定のプロトコルに結合する抗生物質シクロヘキシミド中60SリボソームサブユニットとブロックリボソームのEサイト2からの脱アセチル化されたtRNAのリリースは、リボソームの転位を阻害し、mRNAの翻訳にリボソームを停止するために使用されます。しかし、このようなエメチンもブロック翻訳伸長3などの他のブロッキング剤を使用することができる。 翻訳プロセスの最終的な出力を測定し、ウェスタンブロッティングおよび35 Sメチオニン標識技術とは異なり、ポリソームプロファイリングは、このように異なる条件下で変換メカニズムのより詳細な研究を可能にし、積極的に翻訳mRNAとリボソームとの関連を測定するという利点を有する。したがって、この技術は、容易に翻訳調節7-9、タンパク質合成1,10,11、又はIRESの上流またはmRNA構造の効果に影響を与えるストレス状態に関与するタンパク質因子は、特異的に翻訳4-6の異なるモードを研究するために適合させることができるタンパク質シンセ上のオープンリーディングフレームESIS 12-14。今日では、ポリソームプロファイリングアプリケーションがさらに広いポリソーム関連するmRNAを分析するためのDNAマイクロアレイ15または次世代シーケンス16,17を用いている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

タンパク質合成の調節は、ストレスに対する細胞応答の重要な制御点を表す。具体的には、控えめなRNA調節エレメントは通常、特定のストレス応答に必要なタンパク質をコードする特定のmRNAの選択的翻訳を可能にすることが示された。これらのmRNAの同定だけでなく、選択的な翻訳のために責任を調節メカニズムの特徴付けは、しばらくの間、分子生物学の最前線に立ってきました。ソームプロファイリングは、これらの研究における礎石方法です。ポリソームプロファイリングの目標は、異なる転写に積極的に翻訳するリボソームを固定化することによってmRNAの翻訳をキャプチャし、これにより、高度に翻訳された転写物および不完全に翻訳されたものとの区別を可能にする、スクロース勾配上の超遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することである。次いで、これらは、さらに伝統的な生化学的および分子生物学的方法によって特徴付けることができる。重要なことは、組み合わせのpハイスループットゲノムアプローチとolysom​​eプロファイリングは翻訳制御の大規模解析を可能にします。

我々は最近、アポトーシス阻害剤XIAPおよびBcl-xLの12をコードするIRES-保有するmRNAの選択的な翻訳阻害剤として腫瘍抑制PDCD4のための新規の役割を説明した。ソームプロファイリングはIRES媒介翻訳PDCD4の具体的な関与を実証するための重要な技術だった。 HEK293細胞を一過性にPDCD4（ 図1A）の内因性レベルを枯渇させるトランスフェクトし、その後、プロファイル分析をポリソームに供した。我々は、比較siCTRLとsiPDCD4細胞（ 図1B）で処理ソームプロフィールの変化の欠如によって判断されるようにPDCD4のレベルを減らすことが、グローバル細胞翻訳を損なわなかったことを観察した。同様に、XIAP 19の非IRES変異型のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）との間で変化しなかった。対照的に、2つのIRES-保有するmRNAのポリソーム分布は、XIAPおよびBcl-xLのは、有意に変化した。 Pの非存在下でDCD4これら2つのmRNAの分布は重いribopolysomes（ 図1D、E）にシフトされます。これはXIAPおよびBcl-xLのmRNAは（ 図1F）の定常状態レベルの変化を伴わないので、これらの結果は、ウェスタンブロッティング（ 図によって確認された減少PDCD4のレベルの細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのの翻訳の増強を実証1G）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 図1：ポリソームプロファイリングがXIAPおよびBcl-xLの翻訳の選択的阻害剤としてPDCD4を識別し、（A）HEK293細胞を、PDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）で処理し、抗PDCD4で溶解し、ウェスタンブロット分析に供したsiRNAを、非標的およびPDCD4の程度を確認するために、抗ヌクレオリン抗体がノックダウン（B）PDCD4は（A）のようにノックダウンしたと細胞溶解物をプロファイリングポリソームに供した。代表ポリソームプロファイルは、トップパネルに示されている。 XIAP非IRES（C）の分布は、GAPDHのそれと比較したBcl-xLの（D）、およびXIAP IRES（E）のmRNAが各画分中の全mRNAのパーセント（％mRNA）のように示されている。（F）で点灯-state mRNAレベルはPDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）siRNA処理細胞におけるRT-qPCRにより測定した。（G）からの溶解物（A）抗XIAP、抗-Bcl-xLの、及び用いたウエスタンブロット分析に供した抗ヌクレオリン抗体。 （NB。データが元々 12に掲載された図1に示した） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.9K ビュー.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

生物学

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...