このプロトコルにより、細胞タイプ特異的な方法でタンパク質を標識することができます。これはそのような可能性を提供する最初の技術であり、インビトロまたはインビボで行うことができます。この技術の主な利点は、標識された細胞型特異的タンパク質を未同定で精製したり、免疫蛍光によってその場で可視化したりできることです。
組織の湿重量の12〜15倍の容量で溶解緩衝液を添加して組織ライセートを調製し始め、均質になるまで組織を粉砕する。このホモジネートを摂氏75度に15分間加熱してタンパク質を変性させ、サンプルを遠心分離して上清を新しいチューブに移します。このサンプルは摂氏マイナス80度で保存できます。
次に、アルキル化のために、均質化した試料をEDTA非含有プロテアーゼ阻害剤を含むリン酸生理食塩水緩衝液で2〜3倍に希釈する。次に、新たに調製したヨードアセトアミドを最終濃度20ミリモルまで加えます。暗所で摂氏20度でサンプルを1〜2時間放置します。
ヨードアセトアミドの添加とインキュベーションの手順を2回繰り返します。最初にカラムをボルテックスすることにより、製造元の指示に従ってカラムを準備します。次に、蓋を外して底部を切断し、遠心分離します。
次に、最初にクリックケミストリー交換バッファーを使用してバッファー交換カラムを平衡化し、次にすべてのアルキル化サンプルを交換することにより、バッファー交換を実行します。アジドノルロイシンの取り込みを評価するには、ほのめかしたサンプルを40マイクロリットル取り、リン酸生理食塩水を最終容量120マイクロリットルに加えます。次に、反応を20秒間ボルテックスすることにより、クリック化学反応を設定します。
各試薬を指示された順序でできるだけ早く添加した後、サンプルを摂氏4度の暗所で一晩連続回転させてインキュベートします。翌日、遠心分離後、サンプルを17, 000倍Gで5分間遠心分離すると、わずかにターコイズブルーのペレットが見えます。上清を新しいチューブに移し、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。
標識タンパク質精製用。平衡化バッファーとしてニュートラアビジン結合バッファーを使用して遊離アルキンの残り物を洗浄することが実証されているように、すべてのサンプルをバッファー交換手順にかけます。次に、ニュートラアビジン高容量ビーズを結合バッファーと混合することにより3回洗浄します。
混合物を遠心分離し、上清を捨ててこれを3回繰り返す。次に、同量のニュートラアジンドライビーズとニュートラアビジン結合バッファーを加えて1対1のスラリーを調製します。各サンプルを前精製ライセートとして20〜40マイクロリットル確保し、摂氏マイナス20度で保管します。
試料のタンパク質濃度を測定した後、1ミリグラムのタンパク質を40マイクロリットルのビーズスラリーと混合する。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、連続的に回転させて標識タンパク質をビーズに結合させます。翌日遠心分離により上清を回収する。
後で分析するために上清の20〜40マイクロリットルのアリコートを取っておき、残りを摂氏マイナス80度で凍結します。次に、洗浄バッファー1液に冷やしたニュートラアビジンを加えてビーズを3回洗浄する。ビーズを沈降させ、上清を捨てる。
次に、同じバッファーを追加し、上清を廃棄する前に、摂氏4度で連続回転下でビーズを10分間インキュベートします。ニュートラアビジン洗浄バッファー2および3で洗浄を繰り返し、使用した乾燥ビーズの1容量に相当する量のニュートラアビジン溶出バッファーと共にビーズを摂氏20度で30分間インキュベートすることにより、クリックされたタンパク質を溶出する。溶出中は、サーモブロックシェーカーでビーズを毎分1000回転で懸濁状態に保ち、両方の溶出液を2回組み合わせます。
クリック反応は、SDSページおよびウエスタンイムノブロットによって分析した。腹腔内注射によるアジドノルロイシン投与および飲料水を介したアジドノルロイシン投与について、実験の代表的な画像を示す。さらなる実験は、最適なジスルフィドビオチン切断可能なアルキン濃度を決定するための例を提供する。
この例では、標識サンプルとコントロールとの間のフォールド変化は、14マイクロモルアルキン濃度で最も高くなります。対照と比較したアジドノルロイシン標識試料中の明確な富化を伴う質量分析結果の例をここに示す。この違いは、総タンパク質染色ですでに見られていました。
ペプチド強度の変化に加えて、両方のサンプルに見られるユニークなタンパク質もあります。これは技術的に複雑なプロトコルであり、適切なネガティブコントロールアルキル化、適切(不明瞭)、および非クリックアーカイブの適切なクリーニングを使用して、慎重に手順に従う必要があります。このプロトコルにおける当社の重要なステップである精製タンパク質は、研究者がタンパク質を研究することに興味がある場合は質量分析によって同定するか、ウェスタンブロットによって目的のタンパク質を研究するためにゲルにロードすることができます。
特定の細胞起源からのタンパク質を標識するこの方法の能力は、タンパク質の張力またはインビトロまたはインビボでのタンパク質合成の研究など、多くの用途があります。
