Name: high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96 웰 긴 뇌관 PCR <ol><li> -80 ° C의 냉동고에서 사전 동결 96 웰 PCR 쿨러. </li><li> 10 ML 튜브에서, 마스터 섞어 준비 : 2,100 μL의 DDH 2 O, 105 ㎕의 PCR 학년 DMSO, 접시 당 2,415 μL의 총 부피 105 μL 10 밀리미터의 dNTPs, 105 ㎕의 pPOT 템플릿 (25 NG / μL) 9 . </li><li> 분취 량을 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 23 μL. </li><li> 각각 P20 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 잘로드에 프라이머를 풀링 100 μM의 2 μl를 추가합니다. 사전 냉장 PCR 쿨러에 필름, 장소 플레이트 인감 및 -80 ° C에서 20 분의 최소 고정 할 수 있습니다. </li><li> 10 ML 튜브에서, 마스터 믹스 B를 준비 : 2,048 μL의 DDH 2 O, 525 ㎕의 10 배 버퍼, 접시 당 2,626 μL의 총 볼륨의 52.5 μl를 중합 효소. </li><li> -80 ° C 냉장고에서 플레이트와 PCR 쿨러를 제거합니다. </li><li> PCR을 쿨러에 여전히 판으로, 동결의 상단에 25 μl의 마스터 믹스 B를 추가N 마스터 믹스 50 μL의 총 반응 볼륨. 이 시간이 중요하고, 혼합 A는 해동하기 전에 완료해야합니다. 필름 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> 다음과 같이 열 자전거 타는 사람을 설정 10 분 동안 94 ° C를, 다음 7 분 72 ° C의 최종 연장 기간 다음 2 분 15 초, 30 초 동안 65 ° C, 72 ° C 94 ° C의 30주기 . </li><li> 블록이 94 °의 C에 도달 한 후 PCR 플레이트를 넣습니다. </li></ol> 96 웰 긴 뇌관 PCR 2. 검증 <ol><li> 큰 1 % 캐스트 트리스 아세테이트 EDTA (TAE)에서 아가로 오스 겔 (/ V 승) 4 × 28 웰 빗으로 버퍼를 실행하는 우물의 4 행으로 겔을 제공 할 수 있습니다. 12 채널 멀티 채널 피펫의 팁 빗의 대체 치아를 맞 춥니 다. 차선가로드 된 후 조심스럽게 버퍼를 실행 TAE에서 젤 잠수함. </li><li> 1 차 및 28 일도의 각 행에로드 1킬로바이트의 DNA 사다리. </li><li> P20 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여, PCR 생성물의 DIR 2 μL를 전송할ectly 겔 (그림 1A)의 각 레인에. 앰플 리콘 오염의 가능성을 줄이기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다. <ol><li> (- 레인 3, A2 - 레인 5 ...... A11 - 레인 (23), A12 - 레인 (25) A1) 및 PCR 제품을로드 겔의 첫 번째 행의 홀수 차선으로 PCR 플레이트의 행 A로부터 PCR 제품을로드 겔의 1 차 행의 짝수 레인에 PCR 플레이트의 행 B에서 (B1 - 레인 4, A2 - 레인 6 ...... B11 - 레인 24, B12 - 레인 (26)). </li><li> 짝수 번째의 차선에 차선 행 D 홀수 행으로 C와, 상술 한 바와 같은 패턴을 사용하여 PCR 플레이트의 로우 C 및 D에서 PCR 제품로드. PCR을 플레이트의 각 웰 겔 상에 로딩 될 때까지 로딩 패턴을 계속한다. DNA 로딩 버퍼는이 겔을로드 할 필요가 없습니다. </li></ol></li><li> 실행중인 탱크에 젤을 놓고 겔 침수 될 때까지 버퍼를 실행 TAE와 탱크를 채우십시오. 30 분 동안 100 V에서 실행하고UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 예를 들어 겔 그림 1B를 참조하십시오. 주 : PCR 제품 몇 주 전에 형질 감염을 위해 -20 ℃에서 저장 될 수있다 </li></ol> 3. 96 - 웰 형질 <ol><li> T.를 사용하여 brucei procyclic 형태 세포주이 절차 SMOXP9 10 FCS 10 10 % 함유 SDM-79 미디어에서 성장. </li><li> 형질 당 1 × 10 7 세포를 사용 (1.1 × 109 세포의 총) N 개의 단백질의 말단 및 형질 당 2 × 10 7 세포에 태그 (2.2 × 109 세포의 합계)의 C 말단에 태그 단백질. 형질 감염 전에 몇 일 동안 중앙 로그 (1.2 × 10 6 -1 × 10 7 세포 / ㎖)의 세포를 유지하고, 5-8 × 106 세포 / ml의 밀도로 형질 감염을 위해 세포를 수확. </li><li> 형질 전환을위한 냉동 PCR 제품은 실온에서 해동하도록 허용합니다. </li><li> 헴를 사용하여 세포를 계산ocytometer 또는 자동 세포 계수기. </li><li> 10 분 동안 800 XG에 여러 50 ml의 튜브에 세포 펠렛 필요한 수. </li><li> 원심 폐기 상등액 후 10 ㎖의 세포를 재현 탁 변성 cytomix (0.8 mM의 EGTA, 24 mM의 KCl을 0.15 mM의 CaCl2를 10 mM의 인산 칼륨 완충액 pH7.6, 25 mM의 HEPES-KOH pH7.6, 2.6 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % (W / V) 포도당, 튜브 당 100 μg의 / ㎖ BSA, 1 ㎜의 하이포크 산틴, 144 MM의 자당). 하나의 관에 대한 모든 셀 솔루션을 전송하고 10 분 동안 800 × g으로 다시 스핀. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 5 × 107 세포 / ㎖의 최종 농도를 위해 수정 cytomix 23 ㎖ 중의 세포를 재현 탁. </li><li> 세포가 회전하는 동안, 4 × 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 SDM-79 미디어 1 ㎖를 추가한다. 판의 AD 레이블 및 플레이트 방향을 돕기 위해 영구 마커의 각 접시에 주위에 잘 A1을 반지를 그립니다. </li><li> electroporator에 판 핸들러를 연결합니다. electropora에토 부 1500 V의 전압을 100 마이크로 초까지의 펄스 길이와 12의 펄스 수 500 밀리의 펄스 간격을 설정한다. 판 핸들러에서이 그 electroporator가 전기 판의 12 열 각각에 단일 펄스를 적용 할 것을 보장 1에 펄스 수를 설정합니다. </li><li> P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 일회용 전기, 4mm 간격으로 PCR 플레이트에서 PCR 반응을 옮긴다. </li><li> 세포가 스펀 및 5 × 107 세포 / ㎖ (단계 3.7)의 최종 농도로 재현 탁 될 때, 시약 저장 용기에 옮긴다. 피펫 P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 전기 천공 플레이트의 각 웰에 세포 용액 200 μL를, 피펫 팅하여 PCR 생성물과 함께 혼합한다. </li><li> 조직을 사용하여 단락을 방지하기 위해 판의 상부에서 모든 액 적을 제거한다. </li><li> 일렉트로 플레이트, POS의 상단 플레이트 패키지에 제공되는 밀봉 막 적용이를 itioning 각 기둥의 상단과 하단에 드러난 전극 용 구멍 남도록. 필름을 가이드하는 데 상승 점을 덮는 피. </li><li> 판 핸들러에 전기 플레이트를 넣고 뚜껑을 닫습니다. electroporator 유닛을 눌러 &#39;펄스&#39;. </li><li> 전기 천공 후, 신속하게 4 × 24 웰 조직 배양 플레이트의 96 웰 플레이트에서 전기 천공 된 세포를 옮긴다. 셀을 전송하려면, 다른 모든 팁 누락으로 P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하는 등 나머지 6 팁 24 잘 조직 배양 접시에 6 행으로 줄 것이다. 24 웰 조직 배양 플레이트 (도 2A)에 미리 정의 된 패턴으로 96- 웰 플레이트에서 electroporations 일렉트릭 세포 이동. </li><li> P200 피펫 팁을 준비 - 각 96 웰의 형질을 제거 다른 모든 컬럼 (96) 팁이 상자를 준비합니다. <ol><li> 96 웰 전기 판에 전송 우물 A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11에행 B로 24 웰 조직 배양 플레이트의 행 A, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11를 접시, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 행 C로 및 D1 / D3 / D5 / D7 24 웰 플레이트의 96 웰 플레이트를 6 웰의 각 세트의 전송 후에 행 D.로 / D9는 / D11, 96 웰 플레이트의 웰을 다음 24에 해당하는 웰로부터 매체로 세척 웰 플레이트 및 세척 후, 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li><li> 행 B에 E1은 / E3가 / E5는 / E7이 / E9 / E11 96 - 웰 전기 판에 24 웰 플레이트 B 행 (A)에, F1은 / F3는 / F5는 / F7은 / F9가 / F11 전송 우물, G1 / G3 / G5 / 96에서 행 C와 H1 / H3는 / H5 / H7은 / H9 24 웰 플레이트에 96 웰 플레이트 6 우물의 각 세트의 전송 후 행 D.에 / H11, 우물에 G7은 / G9 / G11 웰로 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li><li> 24 웰 플레이트 C 행 A, B2 / B4 / B6 / B에 96 웰 전기 판에 전송 우물 A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12 행 B에, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 행 C와 96에서 6 우물의 각 세트의 전송 후 행 D.에 D2가 / D4는 / D6는 / D8은 / D10 / D12에 24 웰 플레이트 웰로는 96- 웰 플레이트의 웰을 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li><li> 전송 우물 E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24 웰 플레이트 D 행 (A)에 96 - 웰 전기 판에, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / 행 B에 F12, G2 / G4 / G6 / 행 C로 G8 / G10 / G12 및 H2는 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 행 D.로 24 웰 플레이트에 96 웰 플레이트 6 우물의 각 세트의 전송 후, 96 웰 웰로 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다. </li></ol></li><li> 역 위상차 현미경을 사용하여 세포를 확인하기 위해 각각의 열로부터도 1을 검토한다. A의 라이브와 죽은 세포의 혼합물이있을 것이다세포 파편의 상당량. 그들은 위상차 현미경 하에서 밝은 것 및 이동되기 때문에 생균 사균과 구별 될 수있다. </li><li> 꽉 밀봉을 형성하는 뚜껑 깨끗하고 플라스틱 상자에 24 웰 플레이트를 놓습니다. 28 ° C 배양기에서 상자를 넣습니다. </li><li> 시간 6-8 년 사이에 후, 각 웰에 2 배 선택적 항생제를 포함하는 10 % FCS와 SDM-79 1 ㎖를 추가합니다. 우리의 경험에서, 유전자의 N 말단에 태그 된 세포주 선택적 약물의 높은 농도에 내성이다. 따라서, N 말단에 태깅, 예를 들어 블라스트 사용하여 용액 및 C 말단에 태깅 / ㎖ 블라스트 10 μg의 최종 농도를 필요로 블라스트 / 20 μg의 최종 농도를 필요로한다. 참고 : 형질 전환 세포주가 형질 전환 후 볼 수 9-10일 될 것입니다. </li><li> 회 이상 신선한 미디어 약물 및 사전 분석 통로.도 2b는 전형적인 96- 웰 transfe의 결과를 나타낸다상기 N 말단에 96 서로 다른 단백질을 태그에 대한 ction. 건강한, 약제 내성 세포가 포함되어 있는지 확인 위상차 현미경으로 각 웰을 평가합니다. 건강 잘 위상 계약 현미경의 밝은 주로 (&lt;95 %)이 높은 활성 셀이 포함되어 있습니다. 표면 형광 현미경 또는 웨스턴 블롯에 의해 후속 분석 단백질에 태그가되었는지를 결정하기 위해 요구된다. </li></ol>

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	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. 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The authors have nothing to disclose.

지난 5-10년에서 단백질 체학 및 transcriptomics 방법의 감도에 극적인 개선은 유전자와 그들의 제품의 수천에 중요한 데이터를 제공하고 있습니다. 그러나 도구는이 단백질의 기능이 속도를 유지하지 않은 해결합니다. 단백질에 태그를 지정하면 그 기능을 결정하기 위해 다양한 실험을 용이하게한다. 예를 들어, 단백질은 지역화 공동 지역화 연구를 용이하게하기 위해 서로 다른 색상의 다양한 형광 단백질에 융합 될 수있다. 태그는 APEX2 또는 miniSOG 11, 12 등의 전자 현미경을 위해 개발 된 태그 단백질의 미세 현지화 할 수 있습니다. 같은 TAP 태그 및 ProtC-TEV-의 동지 (PTP) 등의 생화학에 대한 태그, 7,13 바인딩 파트너의 식별 또는 생체 외 생화학 적 분석에서 단백질과 관련된 단지의 정화를 허용 태그. protoc의 성공에 중요한 특정 단계상기 PCR 마스터 믹스 (1)에 DMSO 혼입 마스터 믹스 (2), 마스터 믹스 (2)의 상업용 폴리머의 사용과 cytomix 전기 천공 버퍼의 변형 예의 첨가하기 전에 PCR 마스터 믹스 한 동결 : 올이다. 우리의 경험에서, 양성의 웰과 유사한 비율을 달성하기 위해 N 말단 태깅 형질 감염 용으로 C 말단 태깅을 위해 형질 세포의 두 수를 사용하는 것이 필요하다. 따라서 설명한 모든 단계가 수행되어야한다. 이 기술은 곤충 procyclic 양식 트리파노소마를 형질 때 성공에만 가능성이있다. 혈류 형태는 또한 그들이 때문에 선택적 약물 관련이 농도 의존적 독성 선택시 사망 할 가능성이 낮은 형질 전환 효율 (14)이있다. 따라서, 우리의 이전 프로토콜은 혈류 형태의 트리 파노 솜 (9)의 태그의 현재 최고의 기술을 나타낸다. 또한 트랜스 것으로 보인다fection 효율은 특정 트리파노소마의 분리에 의존 달라질 수 있습니다. 다른 균주 추가 최적화를 요구할 수있다 -이 프로토콜은 927 SMOX procyclic 양식을 사용하여 최적화 하였다. 성공 확률을 증가시킬 조치 포함, PCR 증폭 물 양을 증가 형질 감염에 포함되는 세포의 수를 증가시킨다. 우리는 단백질의 수백 병렬로 태그 할 수있는 방법을 제시한다. 이는 기존의 대규모 데이터 세트를 보완하고 지역 사회에 귀중한 정보를 제공, 현지화 및 상호 작용에 대규모 연구를 촉진 할 것이다. 프라이머 템플릿 요청 및 플라스미드 템플릿 목록에 따라 사용할 수 있습니다에서 사용할 수 http://www.sdeanresearch.com/

트리파노소마 (Trypanosoma) brucei는 가축에서 인간의 아프리카 trypanosomasis 및 nagana을 일으키는 원생 동물 기생충이다. T. brucei 인해 고품질 게놈 수많은 프로테오믹스 및 transcriptomics 데이터 세트와 잘 개발 툴 1-3 분자의 결합으로 단백질 기능 분석을위한 이상적인 유기체이다. 단백질 체학 및 시퀀싱의 발전은 잠재적으로 흥미있는 유전자 4-6 강조 대규모 데이터 세트 이어질; 그러나, 많은 유전자는 기존의 데이터베이스와 연관된 최소한의 정보를 가지고있다. 단백질의 기능적 특성을 돕기 위해 고 처리량 방법이 요구된다. 태그가 단백질의 발현은 단백질의 기능에 대한 통찰력의 다양성을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 단백질 또는 에피토프 태그 단백질은 PROT에 대한 정보를 제공 형광 현미경에 의해 국부적 수EIN은 생물학적 효과를 발휘 될 수 있습니다. 대안 적으로, TAP 7 태그 단백질은 HaloTag 8 또는 그의 태그 생화학 분석법과의 상호 작용 파트너의 식별을 위해 정제 될 수있다. 우리는 최근 T.에 대한 강력한 태그 방법론을 개발 brucei 9. 이 형질의 DNA를 생성하기 위해 긴 프라이머 PCR을 사용하여 병렬 단백질의 수십개의 태그 허용 - 기존 프로토콜에 대한 주요 개선. 우리는 지금 크기의 순서에 의해 procyclic 형태의이 프로토콜의 확장 성을 개선했다. 여기서, 우리는 24 웰 플레이트에서 발생 회수 및 선택과 함께 96 웰 플레이트에 PCR 및 형질 전환을 수행하는 우리의 방법을 제시한다. 단백질 수백 이제 병렬로 태그 될 수있는 바와 같이,이 방법은 전체 게놈 트리파노소마 태그를위한 비용 효율적이고 실현 가능한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

이 대표 형질에서, 프라이머는 TagIt 펄 스크립트 (9)를 사용하여 설계 및 상업적으로 합성 하였다. 96 웰 PCR 수행되고 설명 (도 1a)로 확인되었다; 이 예에서, 95/96의 PCR (그림 1B)에 성공했습니다. 우리의 경험에 의하면, 성공적인 PCR 발생하지 않습니다 원래 프라이머 또는 재 합성 프라이머와 하나 실패 반응을 반복. 앰플 리콘은 전기 (도 2A)에 대해 96- 웰 전기 판에 전사 한 후 회수 및 선택 24- 웰 배양 플레이트로 옮겼다. 선택이 발생할 수 있도록 충분한 시간 후, 우물은 추가 분석을하기 전에 생존을 득점했다. 이 예에서, 96분의 88 웰 (92 %)는 15 일 선택 후옵니다. <img의 고도 = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1 :. PCR의 유효성 검사를 위해 아가로 오스 겔 96 웰 PCR 플레이트에서 PCR 제품을 전송하기위한 긴 프라이머 PCR (A) 패턴의 확인. (나) N 말단에 95 유전자를 태그에 대한 대표 96 - 웰 PCR 검증 젤, 및 형질 전환에 부정적인 제어 역할을 할 5 &#39;대상 동성을 포함하지 않는 1 앰플 리콘. 샘플은 1 %에로드 (w / v)의 아가로 오스 겔 30 분 동안 100 V에서 해결됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> 도 2 : 96 웰 전기 및 선택 96- 웰 전기 천공 전기 천공 작은지면으로부터 세포를 전달하기위한 (A) 패턴.24- 웰 조직 배양 플레이트에 전자. (B) 개략적 인 24 웰 플레이트의 선택 15 일 후 일반적인 라이브 / 죽은 득점을 표시합니다. 녹색 회색은 죽은 세포로 잘이고, 성공적인 형질을 나타냅니다. 이 예에서, 우물 96분의 88 (92 %)을 성공적으로 형질 기생충이 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K 조회수.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

비디오: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

유전학

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

생화학

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

검출<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em자기 활성 셀 정렬 및 유동 세포 계측법에 의해&gt; 변형 표면 당 단백질 전환

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 글리코솜 pH를 위한 pHluorin2 기반 센서 개발

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

저자 스포트라이트: pHluorin2 Biosensor를 사용한 Trypanosoma brucei 의 당체 pH 모니터링의 발전

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

높은 처리량 유전자 태그에

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Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

유전 조작

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

검출

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정

살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정