Name: a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

著者はZonMW-VICIグラント918.11.635（オランダ）からの財政支援を認めます。著者は彼らの実用的な提案をし、顕微鏡上で有益な助言のためのセットアップコンポーネントとカールツァイスオランダのヤルノVoortmanを製造するためのVrijeはUniversiteitアムステルダムの工具店に感謝したいと思います。マリョレインBlaauboerは批判的に原稿のいくつかの草稿にコメントで大きなサポートでした。

全ての実験手順は、動物の法律上のオランダの実験に従って行いました。 注：浸漬濾紙サンドイッチ法は1から変更されています。 1.水中フィルターペーパーサンドイッチ準備<ol><li> Pannett-コンプトン（PC）-saline 27,28 <ol><li>ストック溶液を（超純粋H 2 Oの1 L、塩化ナトリウム、塩化カリウム、 塩化カルシウムの10.42グラムの15.5グラムの121グラム・H 2 O、およびMgCl 2の12.7グラム・6H 2 O）を準備し、Bの（1 L超純H 2 O、2.365グラムのNa 2 HPO 4・2H 2 O、およびのNaH 2 PO 4の0.188グラム・2H 2 O）きれいな1-Lボトルインチ4℃で保管してください。 </li><li> （沈殿を避けるために、この順序で）のストック溶液Bの40原液Aのmlを、60 mlの超純粋H 2 O 900 mlと混合することによってPC-食塩水1リットルを調製。 PC-生理食塩水たてのFRを準備オム原液A及びB毎週。 注：ストック溶液は、数ヶ月間、4℃で保存することができます。オートクレーブ処理および/または抗生物質または抗真菌剤を添加することは必要ありません。 </li></ol></li><li>ニワトリ受精卵のインキュベーション<ol><li>加湿インキュベーターでは、彼らの側に卵を産むし、それらが所望の年齢に達するまで、37.5℃でそれらをインキュベートします。 注：もはや2週間以上ストアの卵（好ましくは12時 - 15°C）、実験前に、孵化率が大幅に低下するように</li></ol></li><li>濾紙担体（1から適応） <ol><li>可能な場合は、厚手の濾紙（28ミリメートル×22 mm）のからの砂時計状のろ紙キャリアを切断するためにレーザ切断機を使用しています。 10.4ミリメートルに22ミリメートルから中央に幅を先細り。フィルターペーパーキャリアの大きい側に楕円向いパラレル（ 図1-Mの長軸と、中央の楕円形の開口部（X 5.5ミリメートル10.6ミリメートル）を切り出します）。 <ol><li>必要に応じて、正しい寸法で段ボール原紙を準備し、鉛筆を使用して、厚手のろ過紙にその概要と中央開口部のそれを転送します。細かいハサミを使用して、ろ紙のキャリアを切り出します。 </li></ol></li><li>各胚を外植するための2つの同一のろ紙キャリアをカットします。胚が外植中に紛失した場合のバックアップとして余分なろ紙キャリアを準備します。 </li></ol></li><li> （実験の日に）温度制御油浴<ol><li>直立ズーム顕微鏡の電動式XYステージの中央に温度制御されたビーカーを置き、その温度コントローラにビーカーを接続します。 </li><li>重みとして作用し、温度制御されたビーカーの中央に皿を置くを6 cmのペトリ皿に四大ステンレス鋼リング（30 mmの外径、高さ4mmの1.5ミリメートルの壁の厚さ）を置きます。 注：このペトリ皿は、ちょうどオイルLEVEを調整するためのプレースホルダとして機能しますリットル。 </li><li>軽鉱物油の130ミリリットルと温度制御ビーカーを埋めます。必要であれば、それは約3ミリメートル6センチメートルペトリ皿の上縁の下に終了するようにオイルレベルを調整します。 </li><li>温度制御されたビーカーから6センチメートルペトリ皿を取り外し、40℃に温度を設定。 </li></ol></li></ol> 2.水中フィルターペーパーサンドイッチ生産<ol><li> （実験の日に）培地<ol><li> 50mlの遠心分離チューブに（ステップ1.1.2に1.1.1で調製した）PC-の生理食塩水30ミリリットルを注ぎます。すべての2胚を外植するために、PC-の生理食塩水30ミリリットルを入れた1 50ml遠心チューブを準備します。 </li><li>慎重に10センチメートルペトリ皿に非インキュベートした卵を割ます。 </li><li>ペトリ皿の壁に沿ってプラスチック製のトランスファーピペットを移動させ、薄い卵白に吸引して薄い卵白を収穫。各2胚を外植するために50ミリリットルの遠心管に30ミリリットルに薄い卵白を収集します。唯一のトンを取得することを確認します卵白ヒン。 注：通常3から4卵は薄い卵白の約30ミリリットルの収穫を可能にします。 </li><li> （ステップ2.1.1で調製した）すべてのPC-生理食塩水に薄い卵白の20ミリリットルを入れ、50 ml遠心チューブを満たしました。 </li><li>静かにチューブを数回反転させて薄い卵白を搭載したPC-生理食塩水を混ぜます。それは数分のために解決し、ここ以降から培養液と呼ばれる混合物は、明確であるかどうかを確認してみましょう。培地は明確ではない場合は、原液と収穫新鮮な薄い卵白から新鮮なPC-生理食塩水を準備します。 </li></ol></li><li>新鮮に6cmのプラスチックシャーレにできるだけ離れ二つの小さなステンレス鋼リング（20ミリメートル外径、高さ4ミリメートル、1.5ミリメートルの壁の厚さ、リング内の6.5ミリメートルのギャップ）を配置し、文化の22ミリリットルでそれを埋めます培地25ミリリットルのプラスチックピペット（ 図1-H）を使用して（ステップ1.4.4に1.4.1で調製しました）。媒体上に蓄積された残骸は遠心管に残っていることを確認してください。 </li><li>任意の破片Oを削除しますrはプラスチックトランスファーピペットを用いて培地から気泡。 </li><li> PC-生理食塩水75mlで10センチメートルペトリ皿を埋める（ステップ2.15で使用されます）。 </li><li>インキュベーターから卵を取り出して、それが胚は卵黄の一番上に来るようにする1分間の側のベンチに置いても。 </li><li>慎重にペトリ皿（ 図1-A）に卵を割ます。濃厚卵白における微細組織の一枚の紙の端を浸し、必要に応じて、引っ張ることにより、胚盤葉を中央に配置します。 </li><li> （濃厚卵白の取り込みを容易にするために、カットオフチップを備えた）プラスチック製トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿から薄いと濃厚卵白の大部分を削除してください。 </li><li>静かに、ティッシュペーパーの切れ端で濃厚卵白を払拭センター（ 図1-B）から離れて移動することにより、胚の周りの濃厚卵白中のウィンドウを作成します。卵黄膜に付着するティッシュペーパーを防ぎます。 </li><li>ピンセットを使用して、慎重にヴィーテの濾紙担体を配置胚（ 図1-C）の前後軸に楕円開口平行の長軸と胚の周りLLINE膜、。 </li><li>フィルターペーパーキャリアに近く、すぐに全体のフィルターペーパーキャリア（ 図1-D）の周りにカット卵黄膜を介して爪はさみ1先端をつまんで。 </li><li>ピンセットを用いて、胚（ 図1-E）の前後軸に対して斜め平行な方向に離れて卵黄からフィルターペーパーキャリアを持ち上げます。 </li><li>上胚の腹側を持っており、PC-生理食塩水でそれを沈めるために周りろ紙キャリアをオンにします。斜め方向の胚の前後軸に沿ったフィルターペーパーキャリアを浸し。 </li><li>すべての卵黄を取り除くにはまだ静かにプラスチック製トランスファーピペットからPC-生理食塩水でそれをフラッシュすることによって卵黄膜と胚盤​​葉を添付しました。で水没フィルターペーパーキャリアの全体を保ちますLL時間（ 図1-F）。 </li><li>斜め方向に胚の前後軸に沿ってPC-生理食塩水からフィルターペーパーキャリアを外し、ティッシュペーパー上にフィルターペーパーキャリアの端を軽くたたくことにより、余分な液体を取り除きます。 </li><li>上向き胚の腹側と、水平に濾紙を保持し、最初の上に別のフィルターペーパーキャリアを置き、ピンセットの第二の対を使用して。その開口部は、それによってろ紙の2層（ 図1-G）との間の胚を挟んで、正確に一致する必要があります。 </li><li>直ちに胚の前後軸に沿って斜め方向に培地中に濾紙担体サンドイッチを水没。 2スチールリング（ 図1-H）との間のスペースにまたがる領域に配置します。 </li><li>確認しながら、他の二つの上にさらに2つの鋼製リングを配置することにより、ろ紙サンドイッチを修正し、その電子を持つ開口mbryoは完全に覆われていない（ 図1-I）のまま。 </li><li>中レベルをチェックし、上部スペーサはちょうど媒体中に沈められていることを確認してください。必要に応じて、培地の少量を追加または削除。 </li><li>慎重に温度制御されたオイルバスの中央に、ペトリ皿に置き、油中皿に次の3つの大きいステンレス鋼リング（30 mmの外径、高さ4mmの1.5ミリメートルの壁の厚さ）を配置することにより皿を横方向に安定させます。 （ 図1-J）のスチールリングは皿の側面に触れていることを確認してください。 </li><li>媒体は鉱油の連続的な層（ 図1-K）で覆われるようにゆっくりと、プラスチック製のトランスファーピペットで培地の上に光鉱油約6ミリリットルピペット。 </li><li>タイムラプス買収を設定します。 注：5重複サブ画像（タイル）の水平方向のパノラマのような胚のイメージングは​​、一般的なoverviで、詳細なイメージング（5X目標を）ことができます形態29から30のEW。 3と10分の間に撮像間隔は、形態学的変化31の詳細な追跡を可能にし、小のzスタック（30μmの距離で5〜7個の異なる面）の取得は、胚30の肥厚と旋回の多くを補償します。最も高いコントラストを有するZ-平面は（画像取得の詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください）タイムラプスムービーに単一フレームをさらに処理32の前に選択することができます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> 図1：水中フィルターペーパーサンドイッチを設定します。 （A）卵をペトリ皿中に割れています。 （B）の厚さと薄い卵白の大部分は、プラスチック製トランスファーピペット（図示せず）を有するペトリ皿から除去されます。その後、濃厚卵白中のウィンドウが作成されますそっとティッシュペーパーで濃厚卵白を拭き取ることによって胚のラウンド。 （C）濾紙担体は卵黄の上に胚盤葉の周りに配置されています。 （D）濾紙担体は卵黄の頂部から除去周囲の卵黄膜と、（E）から切り離されています。 （F）残りの卵黄は、慎重にPC-生理食塩浴で洗い流されます。 （G）胚は、第二の同一の濾紙担体とに挟まれています。 （H）濾紙サンドイッチを培地中に浸漬し、二つの金属ステンレス鋼リング（胚対向背又は腹側を上）に配置されています。 （I）二つのリングがトップからサンドイッチを安定させます。 （J）胚を含むペトリ皿を、温度制御されたオイルバスに転送されます。ステンレス製リングは、横方向にペトリ皿を安定させます。 （K）培地を鉱油の層で覆われています。（L）水没フィルターサンドイッチの概略図。 （M）浸漬濾紙サンドイッチに使用される濾紙担体の寸法。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<ol>
	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

十分に確立されたEC文化1の新しい亜種としては、水没ろ紙サンドイッチは、周りの温度と湿度が管理されたインキュベータを行うことによってニワトリ初期胚の元、卵の長期明と暗視野タイムラプスムービーの取得を容易に不要顕微鏡。むしろ半固体寒天卵白底に培養されているよりも、胚は完全にPC-生理食塩水と薄い卵白からなる単純な培養液中に沈め保持されます。蒸発熱損失は、培養培地の上に浮遊ミネラルオイルの層によって最小化されます。胚は、品質に見える違いなしに、簡単に背や腹側を上にいずれかを培養することができます。ここに示されているように、水没ろ紙サンドイッチ中の胚はモルフォゲン浸したビーズのアプリケーションのように、顕微介入にアクセスできます。将来のアプリケーションは、ミリアンペアにライブ蛍光イメージング、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション、および遺伝子サイレンシングを含みますnipulateとは腹側（ 例えば、初期の心と体節形成）と背側（ 例えば、後期原腸形成、神経管閉鎖、及び早期の脳）開発中に形態形成のイベントの広い範囲を勉強しています。濾紙サンドイッチを含むペトリ皿を鉱油層の下の培地の交換を可能にする、灌流チャンバーで置換される場合、時間依存性の薬物治療が可能です。水没ろ紙サンドイッチは、レーザベース（光シート顕微鏡を含む）イメージングと液浸対物レンズとの組み合わせで、完全なイメージングの可能性を開発します。 水没ろ紙サンドイッチの準備といくつかの困難が、以下の段落で対処されることになります。それはろ紙サンドイッチに卵黄から胚を転送するために、トレーニングの唯一の適度な量を必要とするが、いくつかのステップは、依然として大幅に培養中の胚の品質に影響を与えることができます。濾紙担体である前卵黄の上に置き、胚の周りの卵黄膜は、任意の濃厚卵白から解放する必要があります。その場合にのみ、ろ紙と卵黄膜との間の接続は、PC-生理食塩水での洗浄に耐えるのに十分強力になります。できるだけ液体/空気界面を横切るべき胚を運ぶ濾紙、膜の張力を最小化します。洗浄のためのPC-生理食塩水に持ち込まれると、全体のろ紙キャリアは完全にすべての回で沈め滞在する必要があります。卵黄膜がろ紙から解放開始されますように、60秒 - PC - 生理食塩水浴中の時間は約30に制限しなければなりません。卵黄残党が後胚のビューを不明瞭になりますように、まだ、胚の洗浄は、非常に徹底的に実行する必要があります。洗濯時には、常に半径方向に離れてから胚に直接転送ピペットからのストリームを指していませんが、決して。 PC-生理食塩水から胚を除去した後、最小化するために水平にろ紙を保持するようにしてください胚性膜上の緊張。そして、第2濾紙担体と胚を安定化させます。第濾紙キャリアが配置されると、互いに対して濾紙キャリアをシフトし、胚の膜を引き裂く可能性のある横方向の張力を作成しません。濾紙サンドイッチを培地になると、それはまた、膜の張力を最小にするために、一度だけ、空気/液体界面を横切る必要があります。上部から濾紙サンドイッチを安定化するために使用されるステンレス鋼リングの第二の対は、非常にゆっくりと胚膜の圧縮を最小限にするために任意の圧力なしで配置されるべきです。胚の暗域の小さな破裂は通常、培養の最初の時間の間に治癒するが、油層を培地の上にピペットで添加される前に、損傷を受けた胚は、常に新しいサンプルに置き換えてくださいすることができます。 画像への全体胚または高解像度タイムラプスムービーのための複数のサンプル、マイクroscopeは、顕微鏡ソフトウェアによって制御、電動式XYステージを装備する必要があります。これは、画像品質を低下させる培地と油中の胚および乱流への損傷を回避するために最小限の速度でXYステージの動きを持っている非常に重要です。ここで提示タイムラプス動画の取得のために、電動XYステージは、約1.75ミリメートル/秒の速度で移動しました。将来的には、イメージングは​​、第一希望の位置にステージを移動し、振動や乱流が消えるようにする短い休止期間後の画像を取得することによって改善することができます。 液浸対物レンズのない正立顕微鏡を使用している場合の制限として、潜在的なユーザーは、この培養方法のために必要な比較的長い作動距離（約1cm）に注意する必要があります。胚の上に媒体の層から、ミネラルオイルのこの作動距離をもたらします。 6センチメートルシャーレでは、油層はthicknesを持っています約1秒 - 2.4 mmであり、胚培養培地中の深い約4mmに沈められます。目的の直径に応じて、6センチメートルペトリ皿の上縁も、胚へのアクセスを制限することができます。これは、より大きな皿を使用することによって回避することができました。 頂部から作動距離はわずかに液体層の厚さを最小化することによって減少させることができます。また、下から作動距離がさらに下ペトリ皿の底に胚をもたらし、加熱ビーカーのガラス窓の厚さを減少させることによって最小化することができます。プロトコルは直立長い作動距離のズーム顕微鏡で動作するように最適化されたが、それは同様に倒立顕微鏡に取り付けることができました。予備実験は、限られた拡散がPROBように見えるしないことを示唆しているものの、今後のユーザーは、培養液中にあまり深く胚を浸漬すると、O 2型拡散問題につながる可能性があるということを覚えておいてくださいLEMは、限り胚を培養培地とに挟まれた濾紙の十分に大きな貯水池に囲まれるようにペトリ皿の底に押されていません。 別の制限は、温度制御です。 40℃に加熱したビーカーのためのコントローラの温度を調整することで、媒体の温度は、媒体は、ミネラルオイルで被覆されている胚の周りに37.5℃に平衡化。これは、一部のエネルギーは、加熱要素と温度センサが配置されているビーカーの底部、及び胚の位置との間で失われていることを示しています。温度制御は、センサを再配置し、加熱要素を再分配することによって最適化することができます。

胚は、歴史の初めから人を魅了しています。どのように胚の構造および形態は、明確に定義された時間的、空間的な方法で開発するのですか？ニワトリ胚は、いくつかの理由のために、胚発生のための古典的な脊椎動物のモデルの一つとなっている：それは母親の外に展開するように、それは、簡単に、入手可能な安価な、その初期の段階では透明、および実験操作のためにアクセス可能です。また、それは、心臓や脳の形成、原腸形成、神経胚形成、および体節形成15早けれ形態形成のイベント、中にはほぼフラットな形状を有します。 彼らはそのようなタイムラプス画像の取得を通るように、動的に検討されている場合、形態形成のプロセスは、最もよく理解することができます。ニワトリ胚は、卵 16 ではなく、実験操作や透過光顕微鏡イメージングのための限られた視界の貧アクセシビリティ可視化することができます。したがって、切断19または外植片培養1,20として- - 23らの技術は13,17全体卵黄培養系のいずれかで、 元のOVO培養ニワトリ胚に提案されています。全卵黄培養系では、胚は、無傷の卵黄の上に残り、卵の全体の内容は、インキュベーションのために別の容器に移されます。このコンテナは、代理卵殻17、ペトリ皿19、またはプラスチック製のラップラップ13,18製ハンモックすることができます。全体卵黄培養中の胚は、理想的には孵化し、micromanipulationsにアクセス可能になるまで培養することができます。若い胚を視覚化するのは難しいままでこれらの技術は、（コントラストを増大させる）、血液循環の開始後の胚の発達を研究するために特に有用です。彼らは卵黄から切り出し、 インビトロ外植片として培養されている場合は、これらの初期胚は、最良の画像化することができます。外植片は、実験のために簡単にアクセスできますアル操作および培養のためのより少ないスペースを必要とします。長年にわたり、1955年にデニス新によって開拓された技術とそのバリエーションは、それによってタイムラプス顕微鏡および顕微介入20,21のための胚がアクセスできるよう、ニワトリ胚のための移植片培養法の黄金の基準でした。その偉大な成功にもかかわらず、新規の技術は、比較的厳しいと時間がかかります。胚盤葉を運ぶ卵黄膜は、適切なテンション1を達成するためにガラスリングに張架されたときに胚盤葉は頻繁に切り離します。さらに、胚は、その腹側を上にして培養することができます。 EC（初期チック）文化、チャップマンとコリニョン1によって開発されたより最近の技術は、中央の開口部とフィルターペーパーキャリアを使用して、卵黄膜の延伸を回避します。濾紙によりその自然の張力を維持し、卵黄膜に付着し、画像フレーム1のような胚を取り囲みます。胚では通常、腹側を上にして、寒天、卵白底に培養されます。背側を上に培養することはHH8 15歳以上で胚のためにのみ可能と思われます。多くのグループが、このような外科手術用縫合糸の繊維24またはコラーゲン被覆膜25からなる支持体と寒天卵白底を交換するなど、ニーズにろ紙キャリアを適応しています。多くの場合、新規の技術を持つまたはEC文化を用いて培養した胚は、酸素拡散1,20を容易にするために、空気中に自分の背や腹面で、露出しています。これらの外植片培養物は、培地の蒸発を回避し、乾燥から胚を防ぐために、加湿雰囲気中で維持されなければなりません。これは、湿ったティッシュペーパー1を含むより大きなペトリ皿に外植片培養物を皿をインキュベートすることによって達成されます。これらの胚のタイムラプス画像の取得は、全体顕微鏡や気性の周りの気候制御インキュベーターの使用のいずれかが必要ature-制御された光路14に結露を防止するために加熱された蓋付き容器。完全に、ろ紙培養25として培養液中に沈め新の技術2,21のadaptionsで重鉱物油と卵白の層の間に挟まれた、または「コーニッシュペースト状文化で折り畳まれた胚盤葉外植片としてOVOしかし、ニワトリ胚は、また元に開発することができます「23,26、空気との直接接触なし。 浸漬濾紙サンドイッチを濾紙キャリア技術の新たな変異体です。 元オボひよこの胚を培養することで、以前の知識を組み合わせることで、気候制御インキュベーターと加熱蓋不要になります。胚は、二つの同一の（レーザーカット）との間に挟まれている、完全に単純な培地（Pannett-コンプトン生理食塩水27,28および3の薄い卵白：2の比率）に沈めろ紙キャリア24と培養含まれて制御された温度でえー。媒体の上に浮遊軽質鉱油の層を蒸着2,21を防止し、環境への熱損失を最小限に抑えます。容器の底部は、ガラス窓を有し、全体のセットアップは、直立長作動距離のズーム顕微鏡で行われます。ハンバーガー・ハミルトンこの設定は28体節期に早期原始線条段階に至るまで、胚発生の約30時間の高解像度明と暗視野タイムラプスムービーの取得を可能にする（等価は16、HH5-16に5段）15。胚は、彼らの腹や背側を上にして同様に良好に培養することができます。 （ - 5、および初期の脳の9から13 例えば、後期原腸陥入2、神経管閉鎖3）開発したがって、胚を観察し、腹側（ 例えば、初期の心臓7,8および体節形成6）と背側の操作にアクセスできます。水没ろ紙サンドイッチPマイクロサージェリー、ビーズ移植、マイクロインジェクション、遺伝子サイレンシング、およびエレクトロポレーションの研究のためのシンプルで安定した環境をrovides。そのイメージング電位と液浸対物レンズ（光シート顕微鏡を含む）レーザーベースのイメージングを使用して、はるかにさらに押し込むことができます。

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&amp;nbsp;Reference Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&amp;nbsp;laboratory bottles, with caps, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution A&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution B&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-laser, 130&amp;nbsp;W, wavelength 10.6&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipette Controller</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Serological plastic pipettes, 25&amp;nbsp;ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Plastic document sleeves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue culture dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stainless steel rings, custom-made&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&amp;nbsp;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS Number&amp;nbsp;8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Agar bottoms for EC culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microbead implantation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &amp;micro;m beads were used)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30&amp;nbsp;mm</td><td>SEIRIN</td><td>&amp;nbsp;type J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature controlled beaker&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#039;s and Thermistors MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscope setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&amp;nbsp;mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Rotary Control MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transillumination top 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Insert plate S, glass 237x157x3&amp;nbsp;mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controller EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>System Control Panel SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&quot;</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN module Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/ Positions</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Experiment Designer</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>not available anymore</td></tr></tbody></table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

5、体節形成6、7を曲げ心、 - 、その可用性、低コスト、フラット形状、および透明性に、ニワトリ胚、卵の元には 、原腸陥入2、神経胚形成3のような形態形成のイベント、の研究のための主要な脊椎動物のモデルとなっています初期胚形成の間に13、 - 8、および脳の形成9。形態形成のプロセスを理解する鍵は、タイムラプスイメージングによって動的に従うことです。ひよこ胚発生の元と、卵のタイムラプスムービーの買収は、短い時間のウィンドウにまたは胚14の周囲の温度と湿度を制御するために、インキュベーターの必要性にも限定されています。ここで、我々は文化のひよこに新しい手法を提示すると、透過光顕微鏡を用いた高解像度タイムラプスイメージングのための元、卵を胚。水没ろ紙サンドイッチは、十分に確立されたフィルターペーパーキャリアのTECHNの変形でありますiQue（EC-文化）1と気候室を必要とせずにニワトリ胚の培養を可能にします。胚は、2つの同一のろ紙キャリアとの間に挟まれている、完全に軽質鉱油の層で覆われた単純な、温度制御媒体に浸漬維持されます。少なくとも28体節期（HH16）15まで原始線条段階（ハンバーガー・ハミルトンステージ5、HH5）15から出発し、胚はどちらか自分の腹や背側を上にして培養することができます。これは、胚発生の約30時間をカバーするタイムラプスムービーの取得を可能にします。代表タイムラプスフレームとムービーが示されています。胚は、標準のEC培養で培養した胚に形態学的に比較されます。 水没ろ紙サンドイッチは、早期背側と腹側の形態形成過程を研究するための安定した環境を提供します。それはまた、顕微手術、ビーズIMPとして、ライブ蛍光イメージングとmicromanipulationsを可能にしますlantation、マイクロインジェクション、遺伝子サイレンシング、およびエレクトロポレーション（光シート顕微鏡を含む）レーザーベースのイメージングのための液浸対物レンズと結合する強い可能性を有します。

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ<em&gt;例OVO</emニワトリ初期胚の&gt;タイムラプスイメージング

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.2K ビュー.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

ビデオ: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

最適化された<em&gt;元OVO</em&gt;開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

発生生物学

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling.  In addition, it allows for molecular perturbations of several types, including placement of protein-coated beads and introduction of plasmid DNA using in ovo electroporation.  These experiments have yielded important data on the development of the central and peripheral nervous systems.  For many of these studies, it is necessary to open the eggshell and reclose it without perturbing the embryo's growth.  The embryo can be examined at successive developmental stages by re-opening the eggshell.  While there are several excellent methods for opening chicken eggs, in this article we demonstrate one method that has been optimized for long survival times.  In this method, the egg rests on its side and a small window is cut in the shell.  After the experimental procedure, the shell is used to cover the egg for the duration of its development.  Clear plastic tape overlying the eggshell protects the embryo and helps retain hydration during the remainder of the incubation period.  This method has been used beginning at two days of incubation and has allowed survival through mature embryonic ages.

The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling. In this article we demonstrate one egg preparation method that has been optimized for long survival times.

発達研究のためのウィンドウ鶏卵

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

生物学

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis is becoming increasingly recognized. In particular, the embryonic chick heart and brain tube, which undergo drastic morphological changes as they develop, are among the prime candidates to study the role of physical forces in morphogenesis. Progressive ventral bending&#160;and rightward torsion of the tubular embryonic chick brain happen at the earliest stage of organ-level left-right asymmetry in chick embryonic development. The vitelline membrane (VM) constrains the dorsal side of the embryo and has been implicated in providing the force necessary to induce torsion of the developing brain. Here we present a combination of new ex-ovo experiments and physical modeling to identify the mechanics of brain torsion. At Hamburger-Hamilton stage 11, embryos are harvested and cultured ex ovo (in media). The VM is subsequently removed using a pulled capillary tube. By controlling the level of the fluid and subjecting the embryo to a fluid-air interface, the fluid surface tension of the media can be used to replace the mechanical role of the VM. Microsurgery experiments were also performed to alter the position of the heart to find the resultant change in the chirality of brain torsion. Results from this protocol illustrate the fundamental roles of mechanics in driving morphogenesis.

Here, we present a protocol introducing a set of new ex-ovo experiments and physical modeling approaches for studying the mechanics of morphogenesis during early chick embryonic brain torsion.

初期ニワトリ胚形態形成における物理的な力の役割を探る

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

生物工学

ニワトリ胚発生における神経板力学の縦断的モニタリング

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

著者スポットライト:Brillouin顕微鏡を用いた生きたニワトリ胚の組織力学の非接触測定

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ

文字起こし

要約

さらに動画を探す

この動画の章

最適化された

発達研究のためのウィンドウ鶏卵

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

シンプルの力：ウニ胚として

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプスイメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

アン EX - OVOニワトリ胚培養システム

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

初期ニワトリ胚形態形成における物理的な力の役割を探る

ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ

文字起こし

要約

さらに動画を探す

この動画の章

最適化された

発達研究のためのウィンドウ鶏卵

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

シンプルの力：ウニ胚として

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

アン EX - OVOニワトリ胚培養システム

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

初期ニワトリ胚形態形成における物理的な力の役割を探る

ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプスイメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化