Name: a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario di una borsa ZonMw-VICI 918.11.635 (Paesi Bassi). Gli autori desiderano ringraziare il negozio strumento della Vrije Universiteit di Amsterdam per i loro suggerimenti pratici e per la produzione di componenti di installazione e Jarno Voortman di Carl Zeiss Paesi Bassi per consigli utili sulla microscopia. Marjolein Blaauboer è stato un grande sostegno nel commentare criticamente sulle diverse bozze del manoscritto.

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con i Paesi Bassi esperimenti sugli animali Act. NOTA: Il metodo del panino carta da filtro sommerso viene modificato da 1. 1. Filtro sommerso Sandwich carta Preparazione <ol><li> Pannett-Compton (PC) -saline 27,28 <ol><li> Preparare soluzioni A (1 L superpuro H 2 O, 121 g di NaCl, 15,5 g di KCl, 10.42 g di CaCl 2 · H 2 O e 12,7 g di MgCl 2 · 6H 2 O) e B (1 L di ultrapura H 2 O, 2.365 g di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, e 0,188 g di NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) in pulite bottiglie da 1 litro. conservarli a 4 ° C. </li><li> Preparare 1 L di PC-salina mescolando 900 ml di H 2 O ultrapura con 40 ml di soluzione A e 60 ml di soluzione B (in questo ordine per evitare la precipitazione). Preparare PC-salino fr frescoom soluzioni madre A e B ogni settimana. NOTA: Le soluzioni madre possono essere conservati a 4 ° C per diversi mesi. Autoclave e / o l&#39;aggiunta di antibiotici o antimicotici non sono necessari. </li></ol></li><li> L&#39;incubazione delle uova di gallina fecondate <ol><li> In un incubatore umidificato, deporre le uova dalla loro parte e li incubare a 37,5 ° C fino a quando non raggiungono l&#39;età desiderata. NOTA: Conservare le uova non più di due settimane (preferibilmente a 12 - 15 ° C) prima dell&#39;esperimento, come la schiusa si ridurrà in modo significativo </li></ol></li><li> Vettori di carta filtro (adattato da 1) <ol><li> Se disponibile, utilizzare una macchina di taglio laser per tagliare vettori carta da filtro a forma di clessidra dalla carta di filtrazione di spessore (28 mm x 22 mm). Cono la larghezza al centro da 22 mm a 10,4 mm. Tagliare un&#39;apertura centrale ellittico (10.6 mm x 5,5 mm), con l&#39;asse maggiore dell&#39;ellisse orientato parallelamente al lato maggiore del vettore carta da filtro (Figura 1-M). <ol><li> Facoltativamente, preparare un stencil cartone con le dimensioni corrette e trasferire il suo contorno e quella dell&#39;apertura centrale per carta spessa filtrazione con una matita. Tagliare il vettore carta da filtro con le forbici sottili. </li></ol></li><li> Tagliate due vettori di carta filtro identici per ogni embrione deve essere espiantato. Preparare vettori carta da filtro in più come riserva nel caso in cui un embrione si perde durante l&#39;espianto. </li></ol></li><li> Temperatura controllata bagno d&#39;olio (il giorno dell&#39;esperimento) <ol><li> Porre il becher a temperatura controllata nel centro del motorizzata xy fasi del microscopio zoom verticale e collegare il bicchiere al suo controllore di temperatura. </li><li> Mettere quattro anelli di grande acciaio inossidabile (diametro esterno 30 mm, 4 mm, spessore da 1,5 mm) in un 6 centimetri Petri di agire come pesi e posizionare il piatto in mezzo bicchiere temperatura controllata. NOTA: Questo piatto Petri serve solo come segnaposto per regolare la leve oliol. </li><li> Riempire il bicchiere a temperatura controllata con 130 ml di olio minerale leggero. Regolare il livello dell&#39;olio, se necessario, in modo che le estremità di circa 3 mm al di sotto del bordo superiore del 6 centimetri Petri. </li><li> Rimuovere il 6 centimetri Petri dal becher a temperatura controllata e impostare la temperatura a 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Filtro sommerso Sandwich produzione di carta <ol><li> Il terreno di coltura (il giorno dell&#39;esperimento) <ol><li> Versare 30 ml di PC-salina (come preparato in passi 1.1.1 a 1.1.2) in una provetta da centrifuga da 50 ml. Preparare tubo una centrifuga da 50 ml riempito con 30 ml di PC-salina per ogni due embrioni per essere espiantati. </li><li> rompere con attenzione un uovo non incubate in un 10 centimetri Petri. </li><li> Raccolto albume sottili spostando una pipetta di trasferimento di plastica lungo le pareti della scatola di Petri e succhiare l&#39;albume sottili. Raccogliere 30 ml albumina sottili in una provetta da centrifuga da 50 ml per ogni due embrioni per essere espiantati. Assicurati di ottenere solo il thin albume. NOTA: Di solito 3 - 4 uova permettono la raccolta di circa 30 ml di albume sottili. </li><li> Versare 20 ml di albume sottili in ogni PC-salino riempito 50 ml provetta da centrifuga (come preparato al punto 2.1.1). </li><li> Mescolare il PC-salina con l&#39;albume sottili invertendo delicatamente i tubi diverse volte. Lasciare riposare per alcuni minuti e verificare se la miscela, chiamato terreno di coltura da qui in poi, è chiaro. Se il terreno di coltura non è chiaro, preparare fresco PC-salina dalla soluzione madre e raccogliere albume fresco sottili. </li></ol></li><li> Inserire due anelli piccoli in acciaio inox (diametro esterno 20 mm, 4 mm di altezza, spessore da 1,5 mm, 6,5 millimetri divario sul ring) il più lontano possibile in un fresco 6 centimetri di plastica Petri e riempirlo con 22 ml di cultura medio (preparato come passaggi 1.4.1 a 1.4.4) utilizzando una pipetta di plastica da 25 ml (Figura 1-H). Assicurarsi che detriti accumulati sopra il terreno rimane nella provetta da centrifuga. </li><li> Rimuovere eventuali detriti or bolle dal supporto con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Riempire 10 cm capsula di Petri con 75 ml di PC-salino (da utilizzare nel passaggio 2.15). </li><li> Rimuovere un uovo dall&#39;incubatore e lasciare riposare in panchina su un lato per 1 minuti per consentire l&#39;embrione venire all&#39;inizio del tuorlo. </li><li> Rompere con attenzione l&#39;uovo in una capsula di Petri (Figura 1-A). Bagnare il bordo di un pezzo di carta velina bene in l&#39;albume spessi e centrare blastoderma tirando, se necessario. </li><li> Rimuovere la maggior parte delle albume sottili e spessi dalla piastra di Petri con una pipetta di trasferimento di plastica (con la punta tagliata per facilitare l&#39;assorbimento dei albume di spessore). </li><li> Creare una finestra l&#39;albume spessore intorno dell&#39;embrione delicatamente asciugando l&#39;albume di spessore con un pezzo di carta velina, allontanandosi dal centro (Figura 1-B). Evitare che la carta velina di attaccarsi alla membrana vitellina. </li><li> Usando le pinzette, posizionare accuratamente un vettore carta da filtro sulla vitelline membrana intorno dell&#39;embrione, con l&#39;asse maggiore dell&#39;apertura ellittica parallelo all&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione (Figura 1-C). </li><li> Pinch una punta delle forbici chiodo attraverso la membrana vitellina vicino al vettore carta da filtro e tagliare rapidamente intorno a tutto il carrier carta da filtro (Figura 1-D). </li><li> Usando pinzette, sollevare il vettore carta da filtro dal tuorlo in direzione obliqua parallela all&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione (Figura 1-E). </li><li> Girare il vettore carta da filtro in giro per avere il lato ventrale dell&#39;embrione sulla parte superiore e immergerlo nel PC-salino. Immergere il carrier carta da filtro lungo l&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione in una direzione obliqua. </li><li> Sbarazzarsi di tutto il tuorlo ancora attaccato alla membrana vitellina e la blastoderma da vampate di calore delicatamente con PC-salino da una pipetta di trasferimento di plastica. Mantenere la totalità del vettore carta filtro sommerso in unll volte (Figura 1-F). </li><li> Rimuovere il supporto di carta filtro dal PC-salina lungo l&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione in direzione obliqua e liberarsi del liquido in eccesso tamponando il bordo del supporto carta filtro su una carta velina. </li><li> Tenere la carta da filtro in orizzontale, con il lato ventrale dell&#39;embrione rivolta verso l&#39;alto, e posizionare un altro vettore carta da filtro in cima al primo, usando una seconda coppia di pinzette. I loro aperture devono corrispondere esattamente, sandwich così l&#39;embrione tra i due strati di carta filtro (Figura 1-G). </li><li> immergere immediatamente la carta da filtro panino vettore nel mezzo di coltura in una direzione obliqua lungo la antero-posteriore asse dell&#39;embrione. Posizionare nell&#39;area attraversa lo spazio tra i due anelli in acciaio (Figura 1-H). </li><li> Fissare il panino carta filtro posizionando due anelli in acciaio sopra degli altri due, facendo in modo che l&#39;apertura con la embryo rimane completamente scoperto (Figura 1-I). </li><li> Controllare il livello medio e assicurarsi che il distanziatore superiore è appena immerso nel mezzo. Se necessario, aggiungere o rimuovere le piccole quantità di mezzo. </li><li> posizionare accuratamente la piastra di Petri nel centro del bagno d&#39;olio a temperatura controllata e stabilizzare il piatto lateralmente disponendo tre grandi anelli in acciaio inossidabile (diametro di 30 mm esterno, 4 mm in altezza, mm di spessore della parete 1,5) prossimi al piatto nell&#39;olio . Assicurarsi che gli anelli di acciaio tocchino i lati del piatto (Figura 1-J). </li><li> Lentamente pipettare circa 6 ml di olio minerale leggero sulla parte superiore del mezzo con una pipetta di plastica trasferimento, in modo che il mezzo è ricoperto da uno strato continuo di olio minerale (Figura 1-K). </li><li> Impostare l&#39;acquisizione time-lapse. NOTA: Imaging gli embrioni come panorami orizzontali di cinque sotto-immagini sovrapposte (piastrelle) permette immagini dettagliate (obiettivo 5X), con un overvi generaleew della morfologia 29-30. Intervalli Imaging tra 3 e 10 min consentono il tracciamento dettagliata di morfologica cambia 31, e l&#39;acquisizione di piccole z-stack (da cinque a sette piani diversi, con una distanza di 30 micron) compensa gran parte l&#39;ispessimento e tornitura dell&#39;embrione 30 . Z-aerei con il più alto contrasto possono essere selezionati prima di ulteriori trasformazioni 32 di singoli fotogrammi in filmati time-lapse (vedere la sezione Risultati Rappresentante per informazioni dettagliate su acquisizione di immagini). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> Figura 1: Impostazione del sommerso Sandwich filtro di carta. (A) Un uovo è incrinato in una capsula di Petri. (B) La maggior parte dell&#39;albume spessi e sottili viene rimosso dalla piastra di Petri con una pipetta di plastica trasferimento (non mostrato). Poi, viene creata una finestra in dell&#39;albume spesse untondo l&#39;embrione delicatamente asciugandosi l&#39;albume di spessore con un fazzolettino di carta. Supporto di carta (C) Un filtro è disposto intorno alla blastoderm in cima al tuorlo. (D) Il vettore carta da filtro viene tagliato sciolto dal circostante membrana vitellina e (E) rimosso dalla parte superiore del tuorlo. (F) Il tuorlo rimanente viene accuratamente lavato via in un bagno di PC-salino. (G) L&#39;embrione viene inserita con un secondo vettore carta da filtro identici. (H) Il panino carta da filtro è sommerso nel mezzo e posizionato su due metallo anelli in acciaio inox (embrione rivolto dorsale o ventrale up). (I) Due anelli stabilizzano il sandwich dall&#39;alto. (J) Il piatto Petri contenente l&#39;embrione viene trasferito al bagno ad olio a temperatura controllata. anelli in acciaio inox stabilizzare la piastra di Petri lateralmente. (K) Il mezzo di coltura è coperto con uno strato di olio minerale.(L) Schema del sandwich filtro sommerso. (M) Dimensioni dei vettori di carta filtro utilizzate per il panino carta da filtro sommerso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come una nuova variante della cultura CE consolidata 1, il panino carta da filtro sommerso facilita l&#39;acquisizione di lungo termine campo chiaro e campo scuro time-lapse film del primo embrione di pollo ex ovo facendo una temperatura e umidità controllata incubatore intorno il microscopio superflua. Piuttosto che essere coltivati ​​su un fondo semi-solido agar-albumina, gli embrioni vengono mantenuti completamente immersi in un mezzo di coltura semplice che consiste di PC-salina e albume sottili. L&#39;evaporazione e la perdita di calore sono minimizzati da uno strato di olio minerale galleggia sopra il terreno di coltura. Gli embrioni possono essere coltivate facilmente, sia dorsale o ventrale rivolta verso l&#39;alto, senza differenze visibili in termini di qualità. Come mostrato qui, gli embrioni in sandwich carta da filtro sommerso sono accessibili agli interventi di microchirurgia, come l&#39;applicazione di perline morphogen-impregnati. Le applicazioni future includono fluorescenza vivo imaging, microiniezioni e elettroporazione, e silenziamento genico a MAnipulate e studiare una vasta gamma di eventi morfogenetici durante ventrale di sviluppo (ad esempio, il cuore presto e somitogenesis) e dorsale (per esempio, in ritardo gastrulazione, chiusura del tubo neurale, e il cervello in anticipo). Un tempo-dipendente trattamento farmacologico è fattibile se la piastra di Petri contenente il sandwich carta da filtro viene sostituito con una camera di perfusione, consentendo lo scambio del terreno di coltura sotto lo strato di olio minerale. Il filtro di carta del panino sommerso svilupperà il suo pieno potenziale di imaging in combinazione con l&#39;imaging basata sul laser (compresa la luce fogli microscopio) e gli obiettivi di immersione. Alcune difficoltà con la preparazione del sandwich carta filtro sommerso saranno affrontati nei paragrafi seguenti. Anche se richiede solo una moderata quantità di formazione per trasferire un embrione dal tuorlo nel panino carta da filtro, diversi passaggi possono ancora influenzare significativamente la qualità dell&#39;embrione in coltura. Prima il vettore carta da filtro ècollocato sul tuorlo, la membrana vitellina intorno l&#39;embrione deve essere liberato da ogni albume di spessore. Solo allora il collegamento tra la carta filtro e la membrana vitellina essere sufficientemente robusto da sopportare il lavaggio in PC-salino. La carta da filtro portando l&#39;embrione dovrebbe attraversare l&#39;interfaccia liquido / aria il meno possibile minimizzare la tensione sulle membrane. Una volta portato in PC-salina per il lavaggio, l&#39;intero vettore carta filtro deve rimanere completamente sommerso in ogni momento. Il tempo nel bagno PC-salina deve essere limitata a circa 30 - 60 a sec, come la membrana vitellina inizierà liberando dalla carta da filtro. Ancora, la pulizia della dell&#39;embrione deve essere eseguito in modo molto approfondito, come resti tuorlo saranno poi oscurare la vista dell&#39;embrione. Durante il lavaggio, non puntare mai il flusso dal pipetta di trasferimento direttamente sulla embrione, ma sempre radialmente lontano da esso. Dopo aver rimosso l&#39;embrione dal PC-salina, assicurarsi di tenere la carta da filtro in senso orizzontale per ridurre al minimotensione sulle membrane embrionali. Poi, stabilizzare l&#39;embrione con il secondo vettore carta da filtro. Una volta che il secondo vettore carta da filtro è posto, non creare alcuna tensione laterale, che potrebbe spostare i vettori di carta filtro rispetto all&#39;altra e strappare le membrane embrionali. Quando il sandwich carta da filtro viene portato nel mezzo di coltura, si deve anche attraversare l&#39;interfaccia aria / liquido sola volta per minimizzare la tensione sulle membrane. La seconda coppia di anelli in acciaio inossidabile utilizzati per stabilizzare il panino carta filtro dalla parte superiore deve essere posizionato molto lentamente e senza alcuna pressione per minimizzare la compressione delle membrane embrionali. Piccole rotture del opaca dell&#39;embrione zona di solito guariscono durante la prima ora di cultura, ma un embrione danneggiati possono e devono sempre essere sostituiti da un nuovo campione prima che lo strato olio è pipettati sulla parte superiore del mezzo di coltura. Per l&#39;immagine di un intero embrione o campioni multipli ad alta risoluzione filmati time-lapse, il microfonoROSCOPE deve essere dotato di una motorizzata xy stadi, controllato dal software microscopio. E &#39;di importanza fondamentale avere movimento xy stadi con una velocità minima per evitare danni agli embrioni e turbolenze nel terreno di coltura e l&#39;olio, che diminuirà la qualità dell&#39;immagine. Per l&#39;acquisizione dei filmati time-lapse qui presentati, il motorizzata xy stadi spostato con una velocità di circa 1,75 mm / sec. In futuro, imaging potrebbe essere ulteriormente migliorata prima spostando la fase nella posizione desiderata e l&#39;acquisizione dell&#39;immagine dopo un breve periodo di riposo per lasciare vibrazioni e turbolenze svaniscono. Come limitazione, i potenziali utenti dovrebbero essere consapevoli della distanza relativamente lunga di lavoro (circa 1 cm) necessario per questo metodo cultura, se viene utilizzato un microscopio in posizione verticale, senza obiettivi di immersione. Questa distanza di lavoro risultati dallo strato di supporto e di olio minerale in cima dell&#39;embrione. Nel 6 centimetri piatto Petri, lo strato di olio ha una thickness di circa 1 - 1,5 mm e l&#39;embrione viene immerso circa 4 mm di profondità nel terreno di coltura. A seconda del diametro dell&#39;obiettivo, il bordo superiore del 6 centimetri Petri potrebbe anche limitare l&#39;accesso per l&#39;embrione. Questo potrebbe essere aggirato utilizzando una parabola più grande. La distanza di lavoro dall&#39;alto potrebbe essere leggermente ridotta minimizzando gli spessori degli strati liquidi. Inoltre, la distanza di lavoro dal basso potrebbe essere minimizzata portando l&#39;embrione ulteriormente fino al fondo del piatto Petri e riducendo lo spessore della lastra di vetro del becher riscaldato. Mentre il protocollo è stato ottimizzato per funzionare con una lunga distanza di lavoro zoom microscopio verticale, potrebbe essere montato su un microscopio invertito pure. Gli utenti futuri dovrebbero tenere a mente che sommergendo l&#39;embrione troppo in profondità nel terreno di coltura potrebbe portare a O 2 -Diffusion problemi, anche se esperimenti preliminari suggeriscono che la limitata diffusione non sembra essere un problem, fintanto che l&#39;embrione è circondato da un sufficientemente-grande serbatoio di terreno di coltura e la carta da filtro sandwich non viene premuto al fondo del piatto Petri. Un altro limite è il controllo della temperatura. Regolando la temperatura del regolatore per il becher riscaldato a 40 ° C, la temperatura nel mezzo equilibra a 37,5 ° C circa gli embrioni quando il mezzo è coperto con olio minerale. Questo dimostra che una parte dell&#39;energia viene persa tra il fondo del bicchiere, in cui si trovano gli elementi riscaldanti e il sensore di temperatura, e la posizione degli embrioni. Il controllo della temperatura potrebbe essere ottimizzato spostando il sensore e ridistribuire gli elementi riscaldanti.

Embriogenesi ha affascinato l&#39;uomo fin dall&#39;inizio della storia. Come la struttura e la morfologia di un embrione sviluppano in modo temporale e spaziale come ben definito? L&#39;embrione di pollo è diventato uno dei classici modelli animali vertebrati per embriogenesi per diversi motivi: è facilmente disponibile, poco costoso, trasparente nelle sue fasi iniziali, e accessibile per le manipolazioni sperimentali, come si sviluppa al di fuori della madre. Inoltre, ha una geometria quasi piatta durante i primi eventi morfogenetici, come il cuore e la formazione del cervello, gastrulazione, neurulazione, e somitogenesis 15. processi morfogenetici possono essere compresi meglio se sono studiati in modo dinamico, come ad esempio attraverso l&#39;acquisizione di immagini time-lapse. L&#39;embrione di pollo può essere visualizzato in ovo 16, ma con scarsa accessibilità per le manipolazioni sperimentali e visibilità limitata per l&#39;imaging trasmissione della luce microscopia. Pertanto, severAl tecniche sono state proposte per embrioni di pulcino cultura ex ovo, in tutto sistemi di coltura tuorlo 13,17 - 19 o come le culture espianto 1,20 - 23. Nei sistemi interi coltura tuorlo, l&#39;embrione rimane sopra il tuorlo intatto, e l&#39;intero contenuto del uovo è trasferito in un altro contenitore per incubazione. Questo contenitore può essere un guscio d&#39;uovo surrogata 17, una capsula di Petri 19, o un&#39;amaca fatta di plastica trasparente involucro 13,18. Embrioni di intere culture tuorlo possono idealmente essere coltivato fino alla schiusa e sono accessibili a micromanipolazioni. Queste tecniche sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo degli embrioni dopo l&#39;inizio della circolazione sanguigna (che aumenta il contrasto), mentre embrioni giovani rimangono difficile da visualizzare. Questi primi embrioni possono essere esposte meglio se sono asportati dal tuorlo e colto come espianti in vitro. Gli espianti sono facilmente accessibili per esperimentoAl manipolazioni e richiedono meno spazio per la coltura. Per molti anni, una tecnica introdotta da Denis nuovo nel 1955 e le sue variazioni sono state le norme d&#39;oro di metodi di espianto di embrioni di pollo, rendendo in tal modo l&#39;embrione accessibile per time-lapse microscopia e interventi di microchirurgia 20,21. Nonostante il suo grande successo, la tecnica di Nuovo è relativamente impegnativo e richiede tempo. Il blastoderma spesso si stacca quando la membrana vitellina, portando il blastoderma, è teso intorno a un anello di vetro per ottenere la giusta tensione 1. Inoltre, l&#39;embrione può essere coltivato solo con il lato ventrale. La cultura CE (Early Chick), una tecnica più recente sviluppato da Chapman e Collignon 1, aggira l&#39;allungamento della membrana vitellina utilizzando un vettore carta da filtro con una apertura centrale. La carta da filtro si attacca alla membrana vitellina, mantenendo così la sua naturale tensione, e circonda l&#39;embrione come una cornice 1.Gli embrioni vengono poi coltivate su un fondo agar-albume, di solito con il loro lato ventrale. Coltura dorsale verso l&#39;alto sembra possibile solo per gli embrioni a HH8 15 anni e più. Molti gruppi hanno adattato il vettore carta da filtro alle loro esigenze, ad esempio sostituendo il fondo agar-albume con un supporto in fibre suture chirurgiche 24 o un collagene rivestito membrana 25. Spesso, gli embrioni coltivati con la tecnica del nuovo o con la cultura CE sono esposti, con la loro dorsale o superficie ventrale all&#39;aria per facilitare la diffusione di ossigeno 1,20. Queste culture espianto devono essere conservati in atmosfera umidificata per evitare l&#39;evaporazione del mezzo e per impedire l&#39;embrione si secchi. Ciò si ottiene incubando il piatto con l&#39;espianto in formato piatto Petri contenente carta velina inumidita 1. L&#39;acquisizione di immagini time-lapse di questi embrioni richiede o l&#39;uso di un incubatore clima controllato intorno all&#39;intera microscopio o un carattereature controllato contenitore con un coperchio riscaldato per impedire la condensazione nel percorso ottico 14. Tuttavia, embrioni di pollo possono anche sviluppare ex ovo completamente immersi in un terreno di coltura come le culture di carta filtro 25, inserita tra uno strato di olio minerale pesante e albume in adattamenti della tecnica di New 2,21, o come espianti blastoderma piegato a &quot;Cornish Pasty Cultura &quot;23,26, senza contatto diretto con l&#39;aria. Il panino carta da filtro sommerso è una nuova variante della tecnica del filtro portacarta. Combinando la conoscenza in precedenza su coltura di embrioni di pollo ex ovo, rende l&#39;incubatore clima controllato e il coperchio riscaldato superflua. L&#39;embrione è inserito tra due vettori di carta identici (laser-cut) di filtro 24 e colta completamente sommerso in un mezzo semplice cultura (Pannett-Compton salina 27,28 e albume sottili in un rapporto 3: 2) in temperatura controllata contenereER. Uno strato di olio minerale leggero che galleggia sulla parte superiore del mezzo impedisce l&#39;evaporazione 2,21 e riduce al minimo la perdita di calore verso l&#39;ambiente. Il fondo del contenitore ha una finestra di vetro, e l&#39;intera configurazione viene eseguita su una lunga distanza di lavoro zoom microscopio verticale. Questa configurazione permette l&#39;acquisizione di alta risoluzione campo chiaro e campo scuro filmati time-lapse di circa 30 ore di sviluppo embrionale, che vanno dalla prima fase primitiva striscia allo stadio 28-somite (equivalente a Hamburger Hamilton stadi da 5 a 16, HH5-16 ) 15. Gli embrioni possono essere coltivate altrettanto bene con loro ventrale o dorsale verso l&#39;alto. Pertanto, gli embrioni sono accessibili per l&#39;osservazione e la manipolazione di ventrale (ad esempio, il cuore presto 7,8 e somitogenesis 6) e dorsale (per esempio, in ritardo gastrulation 2, neurale chiusura del tubo 3-5, e il cervello precoce 9 - 13) di sviluppo. Il filtro sommerso panino carta provides un ambiente semplice e stabile per microchirurgia, perline impianto, microiniezione, silenziamento genico, e gli studi elettroporazione. Il suo potenziale di imaging può essere spinto molto più in là utilizzando l&#39;imaging basato su laser (tra cui la microscopia ottica fogli) e gli obiettivi di immersione.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&amp;nbsp;Reference Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&amp;nbsp;laboratory bottles, with caps, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution A&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution B&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-laser, 130&amp;nbsp;W, wavelength 10.6&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipette Controller</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Serological plastic pipettes, 25&amp;nbsp;ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Plastic document sleeves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue culture dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stainless steel rings, custom-made&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&amp;nbsp;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS Number&amp;nbsp;8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Agar bottoms for EC culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microbead implantation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &amp;micro;m beads were used)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30&amp;nbsp;mm</td><td>SEIRIN</td><td>&amp;nbsp;type J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature controlled beaker&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#039;s and Thermistors MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscope setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&amp;nbsp;mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Rotary Control MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transillumination top 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Insert plate S, glass 237x157x3&amp;nbsp;mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controller EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>System Control Panel SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&quot;</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN module Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/ Positions</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Experiment Designer</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>not available anymore</td></tr></tbody></table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

Grazie alla sua disponibilità, a basso costo, la geometria piana, e la trasparenza, l&#39;ex ovo embrione di pollo è diventata un importante modello animale vertebrato per lo studio di eventi morfogenetici, come gastrulation 2, neurulazione 3-5, somitogenesis 6, cuore piegatura 7, 8, e il cervello la formazione di 9 - 13, durante l&#39;embriogenesi precoce. Chiave di lettura dei processi morfogenetici è quello di seguirli in modo dinamico da time-lapse imaging. L&#39;acquisizione di filmati time-lapse di pulcino embriogenesi ex ovo è stato limitato sia per finestre di tempo breve o la necessità di un incubatore per controllare la temperatura e l&#39;umidità attorno all&#39;embrione 14. Qui, vi presentiamo una nuova tecnica per la cultura pulcino embrioni ex ovo per alta risoluzione time-lapse imaging mediante microscopia a luce trasmessa. Il panino carta da filtro sommerso è una variante del filtro portacarta techn consolidataique (CE-coltura) 1 e consente la coltura di embrioni di pollo, senza la necessità di una camera climatica. L&#39;embrione è inserito tra due vettori di carta filtro identici e viene mantenuta completamente sommerso in un semplice mezzo, a temperatura controllata coperto da uno strato di olio minerale leggero. A partire dalla fase primitiva striscia (Hamburger-Hamilton fase 5, HH5) 15 fino ad almeno la fase 28-somite (HH16) 15, gli embrioni possono essere coltivate sia con la loro ventrale o dorsale verso l&#39;alto. Questo permette l&#39;acquisizione di filmati time-lapse che coprono circa il 30 hr di sviluppo embrionale. Rappresentante frame time-lapse e film sono mostrati. Gli embrioni vengono confrontati morfologicamente ad un embrione coltivato nella CE-cultura standard. Il panino carta da filtro sommerso fornisce un ambiente stabile per studiare dorsale presto e processi morfogenetici ventrali. Essa consente anche di imaging di fluorescenza dal vivo e micromanipolazioni, come la microchirurgia, imp tallonelantation, microiniezione, silenziamento genico, ed elettroporazione, e ha un forte potenziale per essere combinati con obiettivi a immersione per l&#39;imaging basato su laser (compresa la luce fogli microscopio).

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A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.2K Views.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Ottimizzato<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

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Biologia dello sviluppo

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling.  In addition, it allows for molecular perturbations of several types, including placement of protein-coated beads and introduction of plasmid DNA using in ovo electroporation.  These experiments have yielded important data on the development of the central and peripheral nervous systems.  For many of these studies, it is necessary to open the eggshell and reclose it without perturbing the embryo's growth.  The embryo can be examined at successive developmental stages by re-opening the eggshell.  While there are several excellent methods for opening chicken eggs, in this article we demonstrate one method that has been optimized for long survival times.  In this method, the egg rests on its side and a small window is cut in the shell.  After the experimental procedure, the shell is used to cover the egg for the duration of its development.  Clear plastic tape overlying the eggshell protects the embryo and helps retain hydration during the remainder of the incubation period.  This method has been used beginning at two days of incubation and has allowed survival through mature embryonic ages.

The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling. In this article we demonstrate one egg preparation method that has been optimized for long survival times.

Le uova di pollo finestre di Studi sullo sviluppo

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Biologia

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis is becoming increasingly recognized. In particular, the embryonic chick heart and brain tube, which undergo drastic morphological changes as they develop, are among the prime candidates to study the role of physical forces in morphogenesis. Progressive ventral bending&#160;and rightward torsion of the tubular embryonic chick brain happen at the earliest stage of organ-level left-right asymmetry in chick embryonic development. The vitelline membrane (VM) constrains the dorsal side of the embryo and has been implicated in providing the force necessary to induce torsion of the developing brain. Here we present a combination of new ex-ovo experiments and physical modeling to identify the mechanics of brain torsion. At Hamburger-Hamilton stage 11, embryos are harvested and cultured ex ovo (in media). The VM is subsequently removed using a pulled capillary tube. By controlling the level of the fluid and subjecting the embryo to a fluid-air interface, the fluid surface tension of the media can be used to replace the mechanical role of the VM. Microsurgery experiments were also performed to alter the position of the heart to find the resultant change in the chirality of brain torsion. Results from this protocol illustrate the fundamental roles of mechanics in driving morphogenesis.

Here, we present a protocol introducing a set of new ex-ovo experiments and physical modeling approaches for studying the mechanics of morphogenesis during early chick embryonic brain torsion.

I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Bioingegneria

Monitoraggio longitudinale della meccanica delle placche neurali nello sviluppo dell'embrione di pollo

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

Autore in primo piano: Misurazione senza contatto della meccanica tissutale in embrioni di pollo vivi mediante microscopia Brillouin

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine

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Le uova di pollo finestre di Studi sullo sviluppo

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino

I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino