Name: a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

Yazarlar ZonMW-VICI hibe 918.11.635 (Hollanda) mali destek kabul. Yazarlar pratik öneriler ve mikroskopi yararlı tavsiyeler kurulum bileşenleri ve Carl Zeiss Hollanda Jarno Voortman üretimi için Vrije Universiteit Amsterdam aracı dükkanı teşekkür etmek istiyorum. Marjolein Blaauboer eleştirel yazının birkaç taslak üzerinde yorum büyük bir destek oldu.

Tüm deney prosedürleri Hayvanlar Yasası üzerinde Hollanda Deneyleri göre yapılmıştır. NOT: batık filtre kağıdı sandviç yöntemi 1&#39;den değiştirilir. 1. Batık Filtre Kağıdı Sandviç Hazırlama <ol><li> Pannett-Compton (PC) -tuz 27,28 <ol><li> Stok çözeltileri A hazırlayın (ultra saf H 1 L 2 O, NaCI 121 gr, KCl 15.5 gr, CaCI2 · H 2 O 10.42 gr ve 12.7 MgCl2 g · 6H 2 O) ve B (1 L ultra saf H2O, 2.365 gr Na 2 HPO 4 · 2H 2, O, ve NaH 2 PO 4 0.188 gr · 2H 2 O), temiz 1 L&#39;lik şişe. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (Çökelmesini önlemek için bu sırayla) stok çözeltisi B 40 stok çözeltisi ilave edildi ve 60 ml ultra saf H2O 900 ml karıştırılarak PC-salin 1 L hazırlayın. PC-tuzlu taze fr hazırlayınom stok solüsyonları A ve B her hafta. Not: Stok çözeltiler birkaç ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Otoklavlama ve / veya ekleme, antibiyotikler veya antimiyotikler gerekli değildir. </li></ol></li><li> Döllenmiş tavuk yumurtası kuluçka <ol><li> nemlendirilmiş bir inkübatör, kendi tarafında yumurtalarını ve istenilen yaşa gelinceye kadar 37.5 ° C onları kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Mağaza yumurta artık iki hafta daha (tercihen 12 yaşında - 15 ° C) kuluçka anlamlı, deney öncesinde azalacak olarak </li></ol></li><li> Filtre kağıdı taşıyıcıları (1 uyarlanmıştır) <ol><li> Varsa, kalın filtrasyon kağıt (28 mm x 22 mm) kum saati şeklindeki filtre kağıdı taşıyıcıları kesmek için lazer kesme makinesi kullanın. 22 mm ile 10.4 mm arasında, orta genişliği gelmez. Filtre kağıdı taşıyıcının büyük yan (Şekil 1-M elips yönelik paralel uzun ekseni ile, merkezi bir eliptik açıklık (x 5.5 mm 10.6 mm) kesip). <ol><li> İsteğe bağlı olarak, doğru boyutlara sahip bir karton şablon hazırlamak ve bir kalem kullanarak kalın filtrasyon kağıda merkezi deliğinin onun anahat ve aktarın. ince makas kullanarak filtre kağıdı taşıyıcı kesin. </li></ol></li><li> Her embriyo Eksplante edilecek için iki özdeş filtre kağıdı taşıyıcıları kesin. Bir embriyo eksplantasyonu sırasında kaybolması durumunda yedek olarak ekstra filtre kağıdı taşıyıcıları hazırlayın. </li></ol></li><li> Sıcaklık kontrollü (Deney gününde) yağ banyosu <ol><li> dik zoom mikroskop motorlu xy-sahnenin merkezinde sıcaklık kontrollü behere koyun ve sıcaklık kontrol için beher bağlayın. </li><li> ağırlık olarak hareket ve sıcaklık kontrollü beherin ortasına çanak yerleştirmek için 6 cm Petri kabı içine dört büyük paslanmaz çelikten halkalar (30 mm dış çapa, yüksekliği 4 mm, 1,5 mm duvar kalınlığı) koyun. NOT: Bu Petri kabı sadece petrol leve ayarlamak için bir yer tutucu olarak hizmet vermektedirl. </li><li> hafif mineral yağ, 130 ml ısı kontrollü beher. Gerekirse, 6 cm Petri kabı üst kenarının altına yaklaşık 3 mm biter böylece eğer yağ seviyesini ayarlayın. </li><li> sıcaklık kontrollü beher 6 santimetrelik bir petri tabağına çıkarın ve 40 ° C sıcaklığı ayarlamak. </li></ol></li></ol> 2. Batık Filtre Kağıdı Sandwich Üretimi <ol><li> (Deney günü) kültür ortamı <ol><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne (adım 1.1.2 1.1.1 gibi hazırlanan), PC-salin 30 mi dökün. Her iki embriyo eksplante edilecek PC-salin, 30 ml ile doldurulmuş bir 50 ml santrifüj tüpü hazırlayın. </li><li> Dikkatlice 10 cm Petri kabı içine olmayan inkübe yumurta çatlak. </li><li> Petri kabı duvarlar boyunca plastik bir transfer pipet hareket ve ince albümin de emerek ince albümin hasat. Her iki embriyo eksplante edilecek bir 50 ml santrifüj tüpü içinde 30 mi, ince albümin toplayın. Sadece t elde etmek için emin olunalbümin hin. NOT: Genellikle 3-4 yumurta, ince albümin yaklaşık 30 ml hasat verir. </li><li> (Adım 2.1.1 gibi hazırlanan) her PC-tuzlu su içine ince bir albümin 20 ml dökün 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doldurulmuş. </li><li> nazikçe boruları birkaç kez ters yüz edilerek ince albümin PC-tuzlu su karıştırın. birkaç dakika yerleşmek ve burada itibaren kültür ortamı denilen karışım, berrak olup olmadığını kontrol edelim. Kültür ortamı değil açık ise, stok solüsyonu taze PC-tuzlu su hazırlamak ve taze ince albümin hasat. </li></ol></li><li> taze 6 cm&#39;lik plastik Petri kabındaki kadar birbirlerinden mümkün iki küçük paslanmaz çelik halkalar (20 mm dış çapa, yüksekliği 4 mm, 1.5 mm duvar kalınlığı, halka içerisinde 6,5 mm boşluk) yerleştirin ve kültür 22 ml ile doldurun ortam, 25 ml plastik pipet (Şekil 1-H) kullanılarak (adım 1.4.4 1.4.1 gibi hazırlanan). orta üstünde biriken enkaz santrifüj tüpüne kalır emin olun. </li><li> Herhangi bir enkaz o kaldırınr plastik transfer pipet kullanarak ortamdan kabarcıklar. </li><li> PC-tuz 75 ml ile 10 santimetrelik bir petri tabağına doldurun (adım 2.15 kullanılmak üzere). </li><li> inkübatör bir yumurta çıkarın ve embriyo sarısı üstüne gelmesine izin 1 dakika boyunca yan bankta dinlensin. </li><li> Dikkatli bir şekilde Petri kabı içine yumurta (Şekil 1-A) çatlak. Kalın akı ince dokulu kağıt parçasının kenarı daldırın ve gerektiğinde, çekerek blastodermin merkezi. </li><li> (Kalın albümin alımını kolaylaştırmak için kesilmiş ucu ile) plastik transfer pipet kullanarak Petri kabı ince ve kalın albümin en çıkarmak. </li><li> Yavaşça, doku kağıt parçası ile kalın albümin silerek merkezine (Şekil 1-B) uzaklaşarak embriyo etrafında kalın akı bir pencere oluşturun. vitellin membran takılarak gelen kağıt mendil önleyin. </li><li> cımbız kullanarak, dikkatle Vite bir filtre kağıdı taşıyıcı yerleştirinEmbriyo (Şekil 1-C) ön-arka eksenine eliptik diyafram paralel uzun ekseni ile embriyo yaklaşık lline membran. </li><li> Filtre kağıdı taşıyıcıya yakın ve hızlı bir şekilde tüm filtre kağıdı taşıyıcı (Şekil 1-D) etrafında kesilmiş vitellin zarından tırnak makası bir ucu sıkıştırın. </li><li> Cımbız kullanarak, embriyo (Şekil 1-E) ön-arka eksene eğik bir doğrultuda paralel olarak kaldı sarısından filtre kağıdı taşıyıcı kaldırın. </li><li> üst embriyonun ventral tarafı var ve PC-tuzlu su içinde daldırın etrafında filtre kağıdı taşıyıcı çevirin. eğik bir doğrultuda embriyo ön-arka eksen boyunca filtre kağıdı taşıyıcı bırakın. </li><li> tüm sarısı kurtulun hala vitellin membran ve yavaşça plastik bir transfer pipet PC-tuzlu su ile yıkayarak blastoderm bağlı. bir de batık filtre kağıdı taşıyıcı tamamını tutmakll kez (Şekil 1-F). </li><li> eğik bir yönde embriyonun ön-arka eksen boyunca PC-tuzlu filtre kağıdı taşıyıcısını çıkarın ve bir kağıt mendil üzerine filtre kağıdı taşıyıcı kenarına dabbing aşırı sıvı kurtulmak. </li><li> cımbız, ikinci bir çifti kullanılarak, yukarı bakacak şekilde embriyonun ventral yüzü yatay filtre kağıdı tutun ve birincinin üstüne başka bir filtre kağıdı taşıyıcısını yerleştirin. Bunların delikler ve böylece de filtre kağıdı, iki katman (Şekil 1-G) arasındaki embriyo sandviç, tam olarak aynı olmalıdır. </li><li> Hemen embriyo ön-arka ekseni boyunca eğik bir doğrultuda kültür ortamına filtre kağıdı taşıyıcı sandviç daldırın. Iki çelik halkaları (Şekil 1 -H) arasındaki boşluğu saran alanına yerleştirin. </li><li> emin olun, diğer ikisinin üstünde iki tane daha çelik halkalar koyarak filtre kağıdı sandviç düzeltmek o e diyaframmbryo tamamen (Şekil 1-I) ortaya kalır. </li><li> orta seviyesini kontrol edin ve üst boşluk sadece orta batık olduğundan emin olun. Gerekirse, ekleme ya da ortam ile az miktardaki. </li><li> Dikkatle sıcaklık kontrollü yağ banyosu merkezinde Petri kabı koyun ve yağ yemeğin yanında üç büyük paslanmaz çelik halkalar (30 mm dış çapı, yüksekliği 4 mm, 1,5 mm et kalınlığı) koyarak çanak yanal stabilize . Çelik halkalar çanak (Şekil 1-J) kenarlarına dokunduğundan emin olun. </li><li> Orta mineral yağ sürekli bir tabaka (Şekil 1-K) ile kaplanmış, böylece yavaşça, plastik bir transfer pipeti ile ortam üzerine hafif mineral yağ, yaklaşık 6 ml pipetle. </li><li> Time-lapse edinimi ayarlayın. NOT: Beş örtüşen alt görüntüleri (fayans) yatay manzaraları olarak embriyolar Görüntüleme genel overvi ile ayrıntılı görüntüleme (5X hedefi) izin verirmorfoloji 29-30 arasında ew. 3 ve 10 dakika arasında görüntüleme periyotları morfolojik ayrıntılı izleme için 31 ve küçük z yığınlarının elde etme (30 um&#39;lik bir mesafe ile, beş ila yedi farklı uçak) embriyo 30 kalınlaşma ve dönme çok telafi sağlamak . En yüksek kontrasta sahip Z-uçakları (görüntü alımı ile ilgili detaylı bilgi için Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakınız) time-lapse film içine tek kare daha fazla işlem öncesi 32 seçilebilir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> Şekil 1: Batık Filtre Kağıdı Sandviç kurma. (A), bir yumurta, bir Petri kabı içerisine termal olarak ayrılmaktadır. (B), kalın ve ince albümin çoğu plastik bir transfer pipeti ile Petri kabı çıkarılır (gösterilmiyor). Ardından, kalın ak bir pencere oluşturulan biryavaşça bir kağıt mendil ile kalın albümin uzakta silerek embriyo yuvarlak. (C) bir filtre kağıdı, taşıyıcı sarısı üstüne blastodermin etrafına yerleştirilir. (D), filtre kağıdı, taşıyıcı sarısı üstünden kaldırıldı Çevre vitellin membran ve (E) gevşek kesilir. (F) Kalan yumurta sarısı özenle PC-tuzlu su uzakta yıkanır. (G), embriyo, bir ikinci denk filtre kağıdı taşıyıcı ile sıkıştırılır. (H) filtre kağıdı sandviç ortamında batık ve (yukarı embriyo bakan dorsal veya ventral yüzü) iki metal paslanmaz çelik halkalar üzerinde konumlandırılmıştır. (I) İki yüzük üstten sandviç stabilize. (J), sıcaklık kontrollü yağ banyosuna aktarılır embriyolu Petri kabı. Paslanmaz çelik halkalar yanal Petri kabı stabilize. (K) kültür ortamına mineral yağ tabakası ile kaplanmıştır.Batık filtre sandviç (L) şematik. (M) batık filtre kağıdı sandviç için kullanılan filtre kağıdı taşıyıcıların boyutları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Köklü AK kültürü 1 yeni varyantı olarak, batık filtre kağıdı sandviç etrafında bir ısıya ve nem kontrollü inkübatör yaparak erken civciv embriyosu ex uzun vadeli aydınlık ve karanlık alan time-lapse film satın ovo kolaylaştırır vazgeçilebilir mikroskop. Daha ziyade, bir yan-katı agar ak alt kültüre edildikten daha embriyolar tam PC-tuzlu su ve ince albümin oluşan basit kültür ortamı içine daldırılmış olarak saklanmaktadır. Buharlaştırma ve ısı kaybı kültür ortamının üstte yüzen bir mineral yağ tabakası ile en aza indirgenmiştir. Embriyolar kalitesinde gözle görülür farklılıklar olmadan, kolayca dorsal veya ventral yüzü yukarı ya yetiştirilebilir. Burada gösterildiği gibi, batık filtre kağıdı sandviç embriyolar morfojen batırılmış boncuklar uygulaması gibi, mikrocerrahi girişimlere erişilebilir. Gelecekteki uygulamalar ma susturma canlı floresan görüntüleme, microinjections ve elektroporasyon ve geni içerennipulate ve ventral (örneğin, erken kalp ve somitogenesis) ve dorsal (örneğin, geç gastrulasyon, nöral tüp kapanma ve erken beyin) gelişimi sırasında morfogenetik olaylar geniş bir yelpazede çalışma. Filtre kağıdı sandviç içeren Petri kabı madeni yağ tabakasının altında kültür ortamının değişimi sağlayan bir perfüzyon odasının değiştirilmesi durumunda bir zamana bağlı ilaç tedavisi uygulanabilir. batık filtre kağıdı sandviç ve daldırma hedefleri (ışık sayfalık mikroskobu dahil) lazer tabanlı görüntüleme ile birlikte tam görüntüleme potansiyelini geliştirecek. batık filtre kağıdı sandviç hazırlama ile bazı güçlükler aşağıdaki paragraflarda ele alınacaktır. bu filtre kağıdı sandviç sarısından bir embriyo transfer eğitim sadece ılımlı bir miktar gerektirmekle birlikte, birkaç adım hala önemli ölçüde kültüründe embriyo kalitesini etkileyebilir. Filtre kağıdı taşıyıcı öncesarısı üzerine yerleştirilir, embriyo etrafında Vitellin zar herhangi bir kalın akı kurtulmuş olmalıdır. Ancak o zaman filtre kağıdı ve vitellin membran arasındaki bağlantı PC-tuzlu su içinde yıkamaya dayanacak kadar güçlü olacaktır. Mümkün olduğunca az sıvı / hava arayüzü geçmelidir embriyo taşıyan filtre kağıdı zarlar üzerinde gerginliği en aza indirmek için. Yıkama PC-tuzlu getirilen kez, tüm filtre kağıdı taşıyıcı tamamen her zaman batık kalmak zorundadır. Vitellin membran filtre kağıdı serbest başlayacak şekilde, 60 saniye - PC-tuz banyosu içinde süresi yaklaşık 30 ile sınırlı olmalıdır. sarısı kalıntıları daha sonra embriyonun görünümü belirsiz gibi hala, embriyonun temizleme, çok iyice idam edilmelidir. yıkama sırasında, radyal ondan her zaman doğrudan embriyo üzerine transfer pipeti akışı işaret ama olmadı. PC-tuzlu embriyo çıkardıktan sonra, en aza indirmek için yatay filtre kağıdı tutmak emin olunembriyonik zarlar üzerinde gerginlik. Sonra, ikinci filtre kağıdı taşıyıcı ile embriyo stabilize. İkinci filtre kağıdı taşıyıcı yerleştirilir sonra, birbirlerine göre filtre kağıdı taşıyıcıları vardiya ve embriyonik membranlar gözyaşı herhangi bir yanal gerginlik, oluşturmaktan kaçının. Filtre kağıdı sandviç kültür ortamına getirildiğinde, membranların gerilimi en aza indirmek için, sadece bir kez hava / su ara-yüzünün geçmelidir. Üstten filtre kağıdı sandviç stabilize etmek için kullanılan paslanmaz çelik halkalar ikinci çift çok yavaş yerleştirilir ve embriyonik zarların sıkıştırma en aza indirmek için herhangi bir baskı olmadan yapılmalıdır. Embriyonun alan Opaca Küçük yırtıkları genellikle kültürün ilk saat içinde iyileşir, ancak yağ tabakası kültür ortamının üstüne pipetle önce hasarlı embriyo ve her zaman yeni bir numune ile değiştirilmesi gerektiğini olabilir. Resme bir bütün embriyo ya da yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmleri için çoklu numuneler, mikrofonroscope mikroskop yazılımı tarafından kontrol edilen bir motorlu xy sahne, ile donatılmış olmalıdır. Bu görüntü kalitesini azaltacaktır kültür ortamında ve yağda embriyolar ve çalkantılar, zarar görmesini önlemek için bir asgari hız ile xy aşamalı hareket olması büyük önem taşımaktadır. Burada sunulan time-lapse film alımı için, motorlu xy aşamalı yaklaşık 1.75 mm / sn hızında taşındı. Gelecekte, görüntüleme ayrıca birinci istenen pozisyona sahne hareketli ve titreşimler ve türbülanslar kaybolup izin kısa dinlenme süresinden sonra görüntüyü alarak geliştirilebilir. daldırma hedefleri olmadan dik mikroskop kullanılması durumunda bir sınırlama olarak, potansiyel kullanıcılar bu kültür yöntemi için gerekli nispeten uzun çalışma mesafesi (yaklaşık 1 cm) farkında olmalıdır. Embriyonun üzerine orta tabakası ve mineral yağ bu çalışma mesafesi oluşur. 6 santimetrelik bir petri tabağına, yağ tabakası kalınlıkta olanYaklaşık 1 S - 1.5 mm, ve embriyo kültür ortamında derinliği yaklaşık 4 mm batırıldı. objektif çapına bağlı olarak, 6 cm Petri kabı üst kenarı da embriyo erişimi sınırlayabilir. Bu daha büyük bir çanak kullanılarak aşılabilir. üst çalışma mesafesi hafif sıvı tabakaların kalınlıkları en aza indirerek azaltılabilir. Buna ek olarak, aşağıdaki çalışma mesafesi daha aşağı Petri kabı alt embriyo getiren ve ısıtılmış beher camın kalınlığının azaltılması ile minimize edilebilir. protokol dik uzun çalışma mesafesi zoom mikroskop ile çalışmak üzere optimize edilmiş olsa da, aynı zamanda ters bir mikroskop monte edilebilir. Ön deneyler sınırlı difüzyon bir prob olarak görünmüyor düşündürmektedir rağmen gelecek kullanıcılar, kültür ortamı içinde çok derinden embriyo daldırarak O 2 -diffusion sorunları yol açabileceği akılda tutulmalıdırlem sürece embriyo kültür ortamı ve sıkıştırılmış filtre kağıdı yeterince geniş rezervuar tarafından çevrelenmiş olarak Petri kabı alt basılı değildir. Başka bir sınırlama sıcaklık kontrolü. 40 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı beher için kontrol sıcaklığının ayarlanması ile, orta sıcaklık ortamı mineral yağ ile kaplanmıştır embriyoların yaklaşık 37.5 ° C dengeler. Bu, bazı enerji ısıtma elemanları ve sıcaklık sensörü bulunan beher, alt ve embriyo arasında yer kayıp olduğunu gösterir. sıcaklık kontrol sensörü taşındıktan ve ısıtma elemanları dağıtarak optimize edilebilir.

Embriyogenezis tarihinin başlangıcından bu yana adam hayran oldu. Nasıl bir embriyo yapısı ve morfolojisi böyle bir iyi tanımlanmış zamansal ve mekansal bir şekilde gelişiyor? civciv embriyo çeşitli nedenlerle embriyogenezin klasik omurgalı hayvan modellerinden biri haline gelmiştir: anne dışında gelişen gibi, deneysel manipülasyonlar için kolayca ucuz, mevcut erken aşamalarında şeffaf ve erişilebilir. Ayrıca, bu tür kalp ve beyin oluşumu, gastrulasyon, nörülasyon ve somitogenesis 15 gibi erken morfogenetik olaylar sırasında neredeyse düz bir geometriye sahiptir. bu tür time-lapse görüntüleri satın alma yoluyla olduğu gibi, dinamik okudu eğer morfogenetik süreçler iyi anlaşılabilir. Civciv embriyo ovo 16 ama deneysel manipülasyonlar ve iletim ışık mikroskobu görüntüleme için sınırlı görüş için kötü erişilebilirlik ile görüntülendi olabilir. Bu nedenle, sever19 veya eksplant kültürleri 1,20 olarak - - 23 el teknikleri ex ovo, ya bütün sarısı kültür sistemlerinde 13,17 kültür civciv embriyolar öne sürülmüştür. Bütün sarısı kültür sistemlerinde, embriyo sağlam sarısı üzerinde kalır ve yumurta tüm içeriği inkübasyon için başka bir kaba aktarılır. Bu kap bir taşıyıcı yumurta kabuk 17, bir petri çanağı 19, ya da plastik sarılmak sargı 13,18 yapılmış bir hamak olabilir. Bütün sarısı kültürlerinde Embriyolar ideal kuluçka kadar kültüre ve micromanipulations erişilebilir olabilir. Bu teknikler, genç embriyo görselleştirmek için sabit kalırken, (kontrastını arttırır) kan dolaşımının başlandıktan sonra embriyo gelişimini incelemek için özellikle yararlıdır. Onlar sarısından çıkarıldı ve in vitro eksplant olarak kültüre eğer bu erken dönem embriyolarının en iyi görüntülü olabilir. eksplantlar deney için kolayca erişilebilirEl manipülasyonlar ve kültür için daha az yer gerektirir. Uzun yıllar boyunca, 1955 ve varyasyonları Denis Yeni öncülük ettiği bir tekniktir ve böylece time-lapse mikroskopi ve mikrocerrahi müdahalelerde 20,21 embriyo erişilebilir hale civciv embriyoları için eksplant kültürü yöntemleri altın standartları vardı. onun büyük başarısına rağmen, New&#39;in teknik nispeten zorlu ve zaman alıcıdır. Blastodermin taşıyan Vitellin membran, uygun gerilimi 1 elde etmek için, bir cam halka etrafında gerildiğinde blastoderm genellikle ayırır. Dahası, embriyo ventral yüzü yukarı bakacak şekilde sadece kültüre edilebilir. AT (Erken civciv) kültürü, Chapman ve Collignon 1 tarafından geliştirilen daha yeni bir teknik, merkezi bir açıklığı olan bir filtre kağıdı taşıyıcı kullanılarak Vitellin zarın gerilmesi aşılmaktadır. Filtre kağıdı ve böylece doğal gerilimi muhafaza, vitellin membran bağlanır ve bir resim çerçevesi 1 gibi embriyo çevreler.Embriyolar genellikle ventral yüzü yukarı gelecek şekilde, bir agar-ak alt kültürlenir. Sırt tarafı yukarı Kültürleme HH8 15 yaş ve üstü embriyo için sadece mümkün görünmektedir. Birçok grup bu tür cerrahi dikiş lifleri 24 veya zar 25 kaplanmış bir kollajen yapılmış bir destek ile agar-ak dibe değiştirerek olarak ihtiyaçlarına filtre kağıdı taşıyıcı adapte var. Genellikle, New&#39;in tekniği ile veya EC kültürü ile kültür embriyolar oksijen difüzyonunu 1,20 kolaylaştırmak için havaya onların dorsal veya ventral yüzeyi ile, maruz kalmaktadır. Bu eksplant kültürleri, ortam buharlaşmasını önlemek ve kurumasını embriyo önlemek için nemli bir atmosferde muhafaza edilmesi gerekir. Bu nemli kağıt mendil 1 ihtiva eden daha büyük bir Petri kabındaki eksplant kültürü ile çanak inkübe edilmesi ile elde edilir. Bu embriyoların zaman atlamalı görüntülerin elde edilmesi, tüm mikroskop ya da bir kıvama etrafında iklim kontrollü inkübatör kullanılmasını da gerektirirçalıçtırdıgınızda kontrollü ışık yolu 14 yoğunlaşmayı önlemek için ısıtılmış bir kapaklı konteyner. Tamamen, filtre kağıdı kültürleri 25 olarak kültür ortamında batık New&#39;in tekniği 2,21 arasında adaptions ağır mineral yağ ve albümin bir tabaka arasında sıkışmış, ya da &quot;Cornish Pasty Kültür katlanmış blastoderm eksplant olarak ovo Ancak civciv embriyolar da eski gelişebilir &quot;23,26, hava ile doğrudan temas olmadan. batık filtre kağıdı sandviç filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin yeni bir çeşididir. Civciv embriyolar ex ovo kültüre daha erken bilgi birleştirerek, iklim kontrollü inkübatör ve vazgeçilebilir ısıtmalı kapak yapar. Içeren kontrollü bir sıcaklıkta Embriyo iki aynı (lazer kesim) filtre kağıdı taşıyıcılar 24 ve kültürlendi, tam (2 oranında bir 3 Pannett-Compton tuzlu su 27,28 ince albümin) basit bir kültür ortamı içinde su altı arasında sandviçer. Ortamın üstünde yüzen hafif mineral yağ tabakası buharlaşma 2,21 önler ve çevreye ısı kaybını en aza indirir. kabın alt cam pencere vardır ve tüm kurulum dik uzun çalışma mesafesi zum mikroskop üzerinde gerçekleştirilir. Hamburger Hamilton bu kurulum 28-hücre gruplarının sahne erken ilkel çizgi aşamasından değişen embriyonik gelişim yaklaşık 30 saat yüksek çözünürlüklü aydınlık ve karanlık alan time-lapse film edinilmesini izin verir (eşdeğer 16, HH5-16 için 5 aşamalarını ) 15. Embriyolar kendi ventral ya da dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde eşit derecede iyi kültüre edilebilir. (- 5, ve erken beynin 9-13, örneğin geç gastrulasyon 2, nöral tüp kapanma 3) geliştirme nedenle, embriyolar gözlem ve ventral (örneğin, erken kalp 7,8 ve somitogenesis 6) ve dorsal manipülasyonu için erişilebilir. batık filtre kağıdı sandviç pmikro boncuk implantasyonu, mikro enjeksiyon, gen susturma ve elektroporasyon çalışmaları için basit ve kararlı bir ortam rovides. Onun görüntüleme potansiyeli ve daldırma hedefleri (ışık-sac mikroskopi dahil) lazer tabanlı görüntüleme kullanarak çok daha fazla itilebilir.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&amp;nbsp;Reference Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&amp;nbsp;laboratory bottles, with caps, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution A&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution B&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-laser, 130&amp;nbsp;W, wavelength 10.6&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipette Controller</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Serological plastic pipettes, 25&amp;nbsp;ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Plastic document sleeves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue culture dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stainless steel rings, custom-made&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&amp;nbsp;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS Number&amp;nbsp;8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Agar bottoms for EC culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microbead implantation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &amp;micro;m beads were used)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30&amp;nbsp;mm</td><td>SEIRIN</td><td>&amp;nbsp;type J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature controlled beaker&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#039;s and Thermistors MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscope setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&amp;nbsp;mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Rotary Control MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transillumination top 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Insert plate S, glass 237x157x3&amp;nbsp;mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controller EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>System Control Panel SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&quot;</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN module Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/ Positions</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Experiment Designer</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>not available anymore</td></tr></tbody></table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

Kalp 7 bükme, 5, somitogenesis 6 - nedeniyle doluluk durumuna, düşük maliyetli, düz geometri ve şeffaflık, civciv embriyo ex ovo gibi gastrulasyon 2 olarak morfogenetik olayların çalışma için önemli bir omurgalı hayvan modeli, nörülasyon 3 haline gelmiştir erken embriyogenez sırasında 13 - 8, ve beyin oluşumu 9. morfogenetik süreçlerinin anlaşılması için anahtar time-lapse görüntüleme ile dinamik olarak takip etmektir. Civciv embriyogenez eski ovo zaman atlamalı filmleri toplama embriyo yaklaşık 14 sıcaklık ve nemi kontrol etmek için bir inkübatör kısa süre pencereleri veya ihtiyaca ya sınırlı kalmıştır. Burada, kültür civciv için yeni bir teknik iletilen ışık mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için ex ovo embriyolar sunuyoruz. batık filtre kağıdı sandviç köklü filtre kağıdı taşıyıcı techn bir çeşididiriQue (AT-kültür) 1 ve klima kabini gerek kalmadan piliç embriyoları kültür sağlar. Embriyo iki aynı filtre kağıdı taşıyıcılar arasında sandviç ve tam hafif mineral yağ tabakası ile kaplı basit, sıcaklık kontrollü bir ortam içinde daldırılmış tutulur. En az 28-hücre gruplarının evre (HH16) 15 kadar ilkel çizgi aşamasında (Hamburger-Hamilton aşamada 5 HH5) 15 dan başlayarak, embriyolar ya da ventral ya da dorsal yüzü yukarı bakacak kültüre olabilir. Bu embriyonik gelişim yaklaşık 30 saat kapsayan time-lapse film edinilmesini sağlar. Temsili time-lapse çerçeveleri ve filmler gösterilmektedir. Embriyolar standart AT-kültürde kültüre bir embriyo morfolojik karşılaştırılır. batık filtre kağıdı sandviç erken dorsal ve ventral morfojenetik süreçleri incelemek için istikrarlı bir ortam sağlar. Aynı zamanda, mikro, boncuk imp olarak, canlı flüoresan görüntüleme ve micromanipulations sağlarlantation, mikroenjeksiyon, gen susturma ve elektroporasyon ve güçlü bir potansiyele sahip (ışık sayfalık mikroskobu dahil) lazer tabanlı görüntüleme için daldırma hedefleri ile kombine edilecek.

<img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig2.jpg" /> Şekil 2: AK Kültür 1 ve Dalgıç Filtre Kağıdı Sandviç Kültür Embriyolar arasındaki morfolojik karşılaştırılması. Seçilen zaman atlamalı çerçeveler 3 saat aralıklarla embriyolar göstermektedir. Çerçeveler tam embriyo morfolojisi genel bir bakış vermek için yeniden boyutlandırılır. Embriyolar 7-hücre gruplarının evre (HH9) 15 yaş uyumlu bulundu. 0 saat, her deney başlangıcını gösterir. Ön sol her zaman. Görüntüler karanlık alan aydınlatma kullanılarak elde edildi. 1,33 alt agar-albümin EC kültürü 1, kültürlü ventral yüzü yukarı (A) Embriyo. Embriyo z-yönünde sınırlı olarak yüksek kaliteli görüntü, elde edilebilir. (B ve C) batık filtre kağıdı sandviç kültüre İki embriyolar: (B) yukarı ventral tarafı ve (C) sırt tarafı yukarı.Filtre kağıdı sandviç Embriyolar en az 27 saat süreyle nitel farklılıklar olmadan gelişebilir. Onlar fonksiyonel kan dolaşımı ve kranial ve servikal bükülmesine geliştirmek ve başarılı bir şekilde çevirin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Time-lapse edinimi mevcut mikroskop sistemine bağlıdır. Bu çalışmada, uzun bir çalışma mesafesi içinde, dik zoom mikroskop kullanıldı. yakınlaştırma faktörü 5X için kuruldu. Mercek 16X büyütme ile birlikte, bu (mikroskop yazılımı belirtildiği gibi) 1.3 mm / piksel teorik çözünürlüğü 30, 80X toplam büyütme sonuçlandı. alan-view arttırmak için, embriyolar beş alt görüntüleri (fayans) yatay manzaraları olarak görüntülendi. Bu nedenle, beş örtüşen çini oluşan bir çini bölgesi, 29 tanımlandı. Bu karo bölgesitam olarak yatay uzantı (- 0 saat Şekil 2B) filtre kağıdı taşıyıcının eliptik açıklığı kapsayacak şekilde yerleştirilmiştir. Her kiremit yaklaşık 2.7 mm&#39;lik bir alan-of-view kapsayan 2.048 x 2.048 piksel boyutu vardı ve fayans sonuçlanan% 10 örtüşme ile elde edildi saha-view yaklaşık 12 mm x 2.7 mm toplam panorama. Motorlu xy aşamalı ayrı karoların 29 edinimi arasında yaklaşık 1.75 mm / sn hızında amaca göre hareket. Canlı görüntü ön presomitic mezoderm ve en yakın zamanda oluşmuş Somitlerin (Grubumuzun araştırma odağı) üzerinde duruldu. Z-doğrultusunda embriyoların kalınlaşma ve kıvırma telafi etmek için, küçük bir Z-yığınlarının (30 um&#39;lik bir mesafe ile, beş ila yedi farklı uçak), her bir zaman noktasında 30 elde edildi. Bunlar presomitic mezodermin ön ucu odak düzlemi etrafında seçildi. Zaman atlamalı ACQ süresiuisition 50 saat için ayarlandı ve 3, 4, veya 10 dakika görüntüleme periyotları 31 seçilmiştir. 10 saat ve yeni optimum odak düzlemi etrafında z-yığını yeniden tanımlıyor - time-lapse edinimi kalitesi her 5 refocusing ile geliştirilebilir. Deney sonunda, bütün zaman serisi elle düzenlendi ve en iyi odak z-düzlemi içeren görüntülerin alt grupları oluşturulur ve ayrı bir klasöre 32 kaydedildi. Görüntülerin Bu alt kümeler zaman dikişli optimum odak görüntülerin tam bir zaman serisi oluşturmak için vardı. Bu tam bir zaman serisi her görüntünün fayans dikişli ve gölgeleme düzeltme 30 olmadan kaynaşarak ve zaman atlamalı çerçeveleri% 100 büyüklüğü ve% 95 sıkıştırma 32 JPEG görüntüleri olarak ihraç edildi bulundu. Time-lapse çerçeveleri profesyonel video düzenleme yazılımı içine bir görüntü dizisi olarak ithal edildi. Ayrıntılı% 100 yakınlaştırır stabilize edilmiş ve genel kontrast bizim sevme ayarlandı. Nihai zaman ihmaller kodlamak vardıH.264 codec d ve MPEG-4 konteyner ihraç etti. Filmler 15 kare / sn (fps) ve 1.920 x 1.080 piksel çözünürlükte bir kare hızında görüntülenir. Şekil 2 EC kültür 1 (Şekil 2A) embriyo ve batık filtre kağıdı sandviç kültürü iki embriyolar, bir varlık kültürlü ventral yüzü yukarı (Şekil 2B) ve diğeri dorsal tarafına kadar (Şekil 2C) arasında bir karşılaştırma gösterir. Tüm embriyo aynı yaştaki yedi hücre gruplarının aşama (HH9) 15 ve 4 dakika (Şekil 2A ve B) ya da 10 dakika (Şekil 2C) bir zamansal çözünürlüğü ile görüntülendi. 3 saat aralıklarla seçilen kareler tasvir edilmektedir. AK kültürü (Şekil 2A) nedeniyle 1,33 alt istikrarlı bir agar-albümin dayanan embriyo çok kararlı görüntüleme izin verdi. Tüm embriyo t boyunca bir odak düzlemi kaldıo bütün zaman atlamalı. Bu kısa deneyler (birkaç saat) ve çok erken embriyolar için yararlı olabilir, ama muhtemelen uzun vadede başarılı üç boyutlu gelişimini engelleyen z-yönünde embriyo, güçlü bir hapis ile birlikte geliyor. Başlangıçta, hapsetme sadece ventral yüzü yukarı (0 saatte Şekil 2A ve 2B karşılaştırın) ile batık filtre kağıdı sandviç kültüre bir embriyo ile karşılaştırıldığında embriyonun kafasının hafif yanal düzleşme sonuçlandı. Daha sonra, baş dönüm (Şekil 2A - 21 saat) engelli ve kalp atışları yavaşladı. Kan dolaşımı neredeyse durdu. AK kültüründe embriyonun tam time-lapse için ek Movie 1 Bkz. sol alt paneli tam çözünürlükte kalp gelişimini görüntüler ise bu filmde üst panel, embriyo tam bir özetini göstermektedir. Somitlerin içine presomitic mezodermin segmentasyon se olabilirAlt sağdaki ayrıntılı olarak tr. batırılmış filtre kağıdı sandviç Embriyolar, diğer yandan, sadece bunları çevreleyen zarların doğal gerilim ile, üç boyutlu bir genişleme sınırlıydı. Bunlar ventral (Şekil 2B) ya da dorsal tarafına kadar (Şekil 2C) ile ya da kültür olabilir. Her iki durumda da, embriyolar sürekli somitogenesis gösterdi ve onların başları döndü. Bu kafa ve boyun eğme ve fonksiyonel kan dolaşımını geliştirdi. Başın parçaları yavaş yavaş mezodermin segmentlere kısmı odak kalırken embriyolar, büyüdü kalınlaşmış ve dönmeye başladı olarak odak dışına böylece filtre kağıdı sandviç Her iki embriyolar, bölümleme mezodermin odaklanarak görüntülendi (21 saat 27 saatte Şekil 2B ve 2C karşılaştırın). Ek Film 2 tasvir embriyonun tam time-lapse film gösterirŞekil 2B. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Bu filmin üst panel embriyo tam bir bakış gösterir. Embriyonun gelişimi nedeniyle genel kalınlaşma ve embriyonik doku dönüm ardışık üzerinde 46 saat görüntülendi, ama yaklaşık 30 saat sonra, bölümleme mezodermin odak kayboldu. Sol alt panel edinilen time-lapse kare tam çözünürlükte kalbin erken gelişim gösterir. orta hatta her iki tarafında eşleştirilmiş kardiyak primordia füzyonu ile, hemen hemen düz bir boru biçimindeki bir yapı, daha sonra dayak ve sağa doğru eğilmeye başlar ki, meydana getirilir. Sağ alt paneli en son oluşmuş somitler ve tam çözünürlükte presomitic mezodermin ön ucu gösterir ve zamanla yeni Somitlerin oluşumunu izler. Ek Film 3 kültüre başka embriyo gösterir ve batık filtre kağıdı sandviç yukarı ventral tarafı görüntülenmiş. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Film th kapsarevre HH5-6 yaklaşık embriyonun e gelişimi, HH14 15 kültür süresi boyunca yaklaşık 27 saat sahne. Baş formları kat ve posterior ilerler. ikili primordiasında kalp şekilleri, dayak ve sağa eğilir başlar. ilk üç ile dört Somitlerin eş zamanlı olarak oluşturur. Ek Somitlerin presomitic mezodermin ön ucundan sırayla kapalı tomurcuk. alt panel yüksek detaylı baş kat ve erken kalp oluşumu gözlem izin tam çözünürlükte embriyonun baş bölgesini göstermektedir. Nedeniyle embriyonun şeffaflık, nöral tüpün kapanması gelecek kafa bölgesinde görülebilir. Alt panelde tam görüntüleme zamanla tam çözünürlükte aynı embriyoda Ek Film 4 görüntüler hücre gruplarının oluşumu. Ek Film 5 embriyo kültüre sırt tarafı yukarı (Şekil 2C) tam time-lapse gösterir. Görüntüleme aralığı 10 dk oldu. upp ikener paneli yaklaşık sahneye HH16-17 yedi hücre gruplarının aşamada (HH9) embriyo gelişimini gösterir, alt panel tam çözünürlükte bu aşamada erken beyinde morfolojik değişiklikleri görüntülemek için kırpılır. Nöral tüpün yerel şişlik daha sonra 13 aşamaları embriyonik beyin beş alt bölgelere bölmek olacaktır ön beyin, orta beyin ve Beyin ve bölgeselleşme, yol izlenebilir. Buna ek olarak, optik veziküllerin büyümesi açıkça görülebilir. kültüründe yaklaşık 30 saat sonra, embriyo ölüyor. mikrocerrahi manipülasyonlar ile su altında filtre kağıdı sandviç uyumluluk birkaç polistiren mikro-göstermek için (~ çapı 40 um) içine veya daldırılmış filtre kağıdı sandviç kültürünün bir tavuk embriyo presomitic mezoderm yakın yerleştirildi. mikro-saklama tamponu ve implan uzaklaştırmak için PBS içinde yıkandıted önce hafif mineral yağ tabakası ile kültür ortamının kapsayan (protokol bölümünün 2.18 adıma karşılaştırın). Bir cam Pasteur pipet mikroskop göz mercekleri ile gözlem altında, embriyo yüzeyine boncuk transferi için kullanılmıştır. Beş delik yavaşça bir akupunktur iğnesi ile kazıyarak endoderm yaratılmıştır. germe ve bir alev bir cam Pasteur pipeti bükme tarafından oluşturulan bir ısmarlama J-şekilli araç, boncuk işlemek ve onlar hareketsiz hale gelene kadar deliklere dikkatle itmek için kullanılmıştır. Üç delikli bir tanesi, her bir ile doldurulmuştur (Şekil 3A - 0 saat ve 3B *) ve iki boncuk her biri için (Şekil 3A - 0 saat), iki delik açın. Şekil 3a, seçilen zaman atlamalı dilimlerinde, tanelerin mikro implantasyondan sonra civciv embriyo gelişimi. Üç takviye kanadının başarılı bir şekilde istenen konuma dokusuna dahil edilmiştir, ve hareketleri boyunca görüntülenmiştiryüksek detay (Şekil 3B) deney ders. Embriyonun gelişimi manipülasyon ya da boncukların varlığı ile değer düşüklüğüne görünmüyordu. Tam time-lapse film için Yan Sinema 6&#39;ya bakınız. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54636/54636fig3.jpg" /> Şekil 3: microbead İmplantasyonu sonra Time-lapse Görüntüleme. Proof-of-prensibi deney microbead implantasyonu ile batık filtre kağıdı sandviç uyumluluk gösteren. Embriyonun başı solunda, ancak, bu deney sırasında görüntüsü değildi. Görüntüler karanlık alan aydınlatma kullanılarak elde edildi. (A) Seçilen time-lapse yedi mikroboncuk implantasyonu sonrası 3 saat aralıklarla manipüle embriyo gösteren çerçeveleri (~ 40 mikron çapında). Sürekli uzatılmış ve embriyo ilave somit oluşturulanes. Üç boncuk düzgün bağlanmış ve kültür 18 saat içinde doku akışı ile medial taşınmış gibi görünüyor. Diğer dört boncuk 6 ila 9 deliklerinden dışarı kültürünün hr attı ve posterior sürüklendi. Deneyin başında (0 saat, B *) ve inkübasyon 12 saat sonra (B **) de presomitic mezoderm içine implante (B) üç tek boncuk Ayrıntılı görünüm (B3 B1). Sadece oluşturan Somitlerin sayısı (B B * daki S9 ve S18 **) belirtilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie1.jpg" /> Ek Film 1: AT-kültür ventral Side Up. Yedi hücre gruplarının sahneye itibaren bir agar-ak botto üzerinde (HH9) 15 1, kültürlü ventral yüzü yukarı AK kültüründe Embriyo,m 1,33. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman sol üst köşesinde görüntülenir. Embriyo z-doğrultusunda sınırlı olduğu gibi yüksek kaliteli görüntüler, kazanılmış olabilir. 21 saat sonra, kalp atışı ve kan akımı neredeyse tutuklandı ve embriyo parçalamak başlamıştı. alt paneller tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) &#39;de presomitic mezoderm (sağ panel) kalp gelişimini (sol panel) ve segmentasyon görselleştirmek ederken üst panel, embriyo bir yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_1_EC_culture-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie2.jpg" /> Ek Film 2: Batık Filtre Kağıdı Sandviç ventral Side Up. Yedi hücre gruplarının aşamasında (HH9) 15 itibaren, ventral sid gelen batık kağıt sandviç kültüre embriyoe yukarı bakacak. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel arka arkaya, 46 saat boyunca embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. Sol alt panel tam çözünürlükte (% 100 zoom) görüntü alımı ilk 10 saat boyunca erken kalp gelişimini görüntüler. Sağ alt paneli odak nedeniyle genel kalınlaşma ve embriyonik doku dönüm kaybetti kadar tam çözünürlükte (% 100 zoom) gelişme yaklaşık 30 saat boyunca mezoderm segmentlere betimlediği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_2_Sandwich-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie3.jpg" /> Ek Film 3: Baş Katlama oluşumu. dan batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı oreklam süreç / kafa kat aşaması (HH5-6) 15 yaklaşık 22 hücre gruplarının sahne (HH14) kültür süresi 15 yılı aşkın kabaca 27 saat. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 zoom) embriyonun baş bölgesini göstermektedir. Baş kat ve erken kalp ve nöral tüp kapanması oluşumu görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_3_Sandwich-Ventral_up-Head.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 4" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie4.jpg" /> Ek Film 4: Somitogenesis. Baş-işlem / kafa kat aşamada (HH5-6) den batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı 15Yaklaşık 22-hücre gruplarının evre (HH14) kültür süresi 15 yılı aşkın kabaca 27 saat için. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) &#39;de segmentlere paraxial mezoderm göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_4_Sandwich-Ventral_up-Somitogenesis.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie5.jpg" /> Ek Film 5: Batık Filtre Kağıdı Sandviç Sırt Side Up. Yaklaşık HH16-17 sahneye 15 yedi hücre gruplarının aşamada (HH9) 15 dan batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür dorsal yüzü yukarı. Görüntüleme aralığı 10 dk oldu. göreli zaman görüntülenirsaat ve dakika içinde sol üst köşesinde, 24 saat sonra yeniden başlatmayı. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) erken beyinde morfolojik değişiklikler göstermektedir. embriyo kültüründe yaklaşık 30 saat sonra öldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_5_Sandwich-Dorsal_up-Head.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 6" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie6.jpg" /> Ek Film 6: microbeads İmplante. Dokuz hücre gruplarının aşamada (HH9-10) 15 başlayarak yaklaşık 19 saat için batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman h ve min sol üst köşesinde görüntülenir. Yedi mikroboncuklarının pr içine implante ile üst panel kuyruk bölgenin yeniden boyutlandırılmış genel bakışını gösteriresomitic mezoderm. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) implante mikro boncuklar ile bölgeyi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_6_Sandwich-Ventral_up-Microbeads.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.2K Görüntüleme.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gelişim Biyolojisi

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling.  In addition, it allows for molecular perturbations of several types, including placement of protein-coated beads and introduction of plasmid DNA using in ovo electroporation.  These experiments have yielded important data on the development of the central and peripheral nervous systems.  For many of these studies, it is necessary to open the eggshell and reclose it without perturbing the embryo's growth.  The embryo can be examined at successive developmental stages by re-opening the eggshell.  While there are several excellent methods for opening chicken eggs, in this article we demonstrate one method that has been optimized for long survival times.  In this method, the egg rests on its side and a small window is cut in the shell.  After the experimental procedure, the shell is used to cover the egg for the duration of its development.  Clear plastic tape overlying the eggshell protects the embryo and helps retain hydration during the remainder of the incubation period.  This method has been used beginning at two days of incubation and has allowed survival through mature embryonic ages.

The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling. In this article we demonstrate one egg preparation method that has been optimized for long survival times.

Gelişim Araştırmaları Pencereleme Tavuk Yumurta

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Biyoloji

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis is becoming increasingly recognized. In particular, the embryonic chick heart and brain tube, which undergo drastic morphological changes as they develop, are among the prime candidates to study the role of physical forces in morphogenesis. Progressive ventral bending&#160;and rightward torsion of the tubular embryonic chick brain happen at the earliest stage of organ-level left-right asymmetry in chick embryonic development. The vitelline membrane (VM) constrains the dorsal side of the embryo and has been implicated in providing the force necessary to induce torsion of the developing brain. Here we present a combination of new ex-ovo experiments and physical modeling to identify the mechanics of brain torsion. At Hamburger-Hamilton stage 11, embryos are harvested and cultured ex ovo (in media). The VM is subsequently removed using a pulled capillary tube. By controlling the level of the fluid and subjecting the embryo to a fluid-air interface, the fluid surface tension of the media can be used to replace the mechanical role of the VM. Microsurgery experiments were also performed to alter the position of the heart to find the resultant change in the chirality of brain torsion. Results from this protocol illustrate the fundamental roles of mechanics in driving morphogenesis.

Here, we present a protocol introducing a set of new ex-ovo experiments and physical modeling approaches for studying the mechanics of morphogenesis during early chick embryonic brain torsion.

Roller erken piliç embriyonik morfogenez fiziksel güçlerinin sondalama

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Biyomühendislik

Civciv Embriyo Gelişiminde Nöral Plaka Mekaniğinin Boylamsal İzlenmesi

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

Yazar Spotlight: Brillouin Mikroskobu Kullanılarak Canlı Civciv Embriyolarında Doku Mekaniğinin Temassız Ölçümü

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Optimize

Gelişim Araştırmaları Pencereleme Tavuk Yumurta

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Bir Eski-ovo Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Roller erken piliç embriyonik morfogenez fiziksel güçlerinin sondalama

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi