Name: a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung von einem ZonMW-VICI Zuschuss 918.11.635 (Niederlande). Die Autoren möchten sich das Werkzeug-Shop von der Vrije Universiteit Amsterdam für ihre praktische Vorschläge zu danken und für die Herstellung der Setup-Komponenten und Jarno Voortman von Carl Zeiss Niederlande für hilfreiche Ratschläge zum Mikroskopie. Marjolein Blaauboer war eine große Unterstützung bei kritisch auf mehrere Entwürfe des Manuskripts zu kommentieren.

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Niederlanden Tierversuche Act durchgeführt. HINWEIS: Die untergetauchten Filterpapier Sandwich - Verfahren wird aus 1 geändert. 1. Abgetaucht Filterpapier Sandwich Vorbereitung <ol><li> Pannett-Compton (PC) -saline 27,28 <ol><li> Vorbereitung Stammlösungen A (1 l ultrareines H 2 O, 121 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,42 g CaCl 2 · H 2 O und 12,7 g MgCl 2 · 6H 2 O) und B (1 l ultrareines H 2 O, 2,365 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O und 0,188 g von NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) in sauberen 1 l - Flaschen. Lagern Sie sie bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie 1 l PC-Salzlösung durch Mischen von 900 ml ultrareinem H 2 O mit 40 ml Stammlösung A und 60 ml der Stammlösung B (in dieser Reihenfolge Fällung zu vermeiden). Bereiten Sie PC-saline frisch from Stammlösungen A und B jede Woche. HINWEIS: Die Stammlösungen können bei 4 ° C mehrere Monate gelagert werden. Autoklavieren und / oder das Hinzufügen von Antibiotika oder Antimykotika sind nicht erforderlich. </li></ol></li><li> Die Inkubation von befruchteten Hühnereiern <ol><li> In einem befeuchteten Inkubator, die Eier legen auf ihrer Seite und brüten sie bei 37,5 ° C, bis sie das gewünschte Alter erreichen. Hinweis: Bewahren Eier nicht mehr als zwei Wochen (vorzugsweise bei 12 bis 15 ° C) vor dem Experiment, da die Schlüpffähigkeit deutlich sinken </li></ol></li><li> Filterpapier Träger (angepasst von 1) <ol><li> Falls vorhanden, verwenden Sie eine Laser-Schneidemaschine sanduhrförmigen Filterpapierträger aus dicken Filterpapier (28 mm x 22 mm) zu schneiden. Verjüngen sich die Breite in der Mitte von 22 mm auf 10,4 mm. Schnitten eine zentrale elliptische Öffnung (10,6 mm x 5,5 mm), mit der längeren Achse der Ellipse ausgerichtet parallel zu der größeren Seite des Filterpapierträger (1-M). <ol><li> Optional können Sie eine Kartonschablone mit den richtigen Dimensionen vorzubereiten und ihre Umrisse und der zentralen Öffnung zu dick Filterpapier mit einem Bleistift übertragen. Schneiden Sie den Filterpapierträger mit einer feinen Schere aus. </li></ol></li><li> Schneiden Sie zwei identische Filterpapierträger für jeden Embryo explantiert werden. Bereiten Sie zusätzliche Filterpapierträger als Backup, falls ein Embryo während der Explantation verloren geht. </li></ol></li><li> Temperaturgeregelten Ölbad (am Tag des Experiments) <ol><li> Legen Sie die temperaturgesteuerte Becher in der Mitte des motorisierten XY-Tisch des aufrechten Zoom-Mikroskop und verbinden Sie den Becher auf die Temperaturregler. </li><li> Setzen Sie vier große Edelstahlringe (30 mm Außendurchmesser, 4 mm in der Höhe, 1,5 mm Wandstärke) in eine 6 cm Petrischale als Gewichte zu wirken und die Schale in der Mitte des temperaturgesteuerten Becher platzieren. HINWEIS: Diese Petrischale dient nur als Platzhalter das Öl leve einzustellenl. </li><li> Füllen Sie den temperaturgesteuerten Becher mit 130 ml leichtem Mineralöl. Stellen Sie die Ölstand gegebenenfalls so, dass es etwa 3 mm unterhalb der Oberkante des Tellers 6 cm Petri endet. </li><li> Entfernen Sie die 6 cm Petrischale aus dem temperaturgesteuerten Becher und die Temperatur auf 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Abgetaucht Filterpapier Sandwich Produktion <ol><li> Kulturmedium (am Tag des Experiments) <ol><li> Pour 30 ml PC-Salzlösung (1.1.1 bis 1.1.2 in Schritten hergestellt) in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Bereiten einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 30 ml PC-Kochsalzlösung gefüllt für alle zwei Embryonen explantiert werden. </li><li> knacken Sie vorsichtig eine unbebrüteten Ei in eine 10 cm Petrischale. </li><li> Ernte dünnen Eiklar durch eine Plastiktransferpipette an den Wänden der Petrischale zu bewegen und in dünnen Eiklar zu saugen. Sammle 30 ml dünnen Eiklars in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen für jeweils zwei Embryos explantiert werden. Achten Sie darauf, nur die t zu erhaltenHin Eiweiss. HINWEIS: In der Regel 3 bis 4 Eier, die Ernte von etwa 30 ml dünnen Eiklar ermöglichen. </li><li> Gießen 20 ml dünnen Eiklars in jeden PC-Kochsalzlösung gefüllten 50 ml Zentrifugenröhrchen (wie in Schritt 2.1.1) hergestellt. </li><li> Mischen Sie die PC-Kochsalzlösung mit dünnen Eiklar durch sanft die Rohre mehrmals umgekehrt wird. Lassen Sie es für einige Minuten absetzen und prüfen, ob die Mischung, die so genannte Kulturmedium von hier an, ist klar. Wenn das Kulturmedium nicht klar ist, bereiten Sie frisches PC-Kochsalzlösung aus der Stammlösung und ernten frisch dünnen Eiklar. </li></ol></li><li> Legen Sie zwei kleine Edelstahlringe (20 mm Außendurchmesser, 4 mm in der Höhe, 1,5 mm Wandstärke 6,5 mm Lücke im Ring) so weit wie möglich voneinander entfernt in einem frischen 6 cm Petrischale aus Kunststoff und füllen es mit 22 ml Kultur Medium unter Verwendung einer 25 ml Kunststoffpipette (1-H) (wie in den Schritten 1.4.1 bis 1.4.4) hergestellt. Stellen Sie sicher, dass Ablagerungen auf dem Medium angesammelt bleibt in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Entfernen Sie die Verschmutzungen or Blasen aus dem Medium eine Plastiktransferpipette. </li><li> Füllen Sie eine 10 cm-Petrischale mit 75 ml PC-Salzlösung (im Schritt 2.15 verwendet werden). </li><li> Entfernen Sie ein Ei aus dem Inkubator und lassen Sie es für 1 Minute auf der Bank auf seiner Seite ruhen der Embryo kommen an die Spitze des Eigelbs zu lassen. </li><li> Knacken Sie vorsichtig das Ei in eine Petrischale (Abbildung 1-A). Genießen Sie die Kante eines Stückes von feinen Seidenpapier in den dicken Eiweiss und die blastoderm Zentrum durch Ziehen, falls erforderlich. </li><li> Entfernen Sie die meisten der dünnen und dicken Eiweiss aus der Petrischale eine Plastiktransferpipette (mit der Spitze abgeschnitten, die Aufnahme der dicken Eiklars zu erleichtern). </li><li> Erstellen Sie ein Fenster in den dicken Eiklars um den Embryo durch leichtes Abwischen der dicken Eiklars mit einem Stück Seidenpapier, bewegt sich weg von der Mitte (Abbildung 1-B) entfernt. Verhindern, dass das Seidenpapier von der Befestigung an der Vitellinmembran. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie vorsichtig mit einem Filterpapierträger auf der vitelline Membran um den Embryo, mit der längeren Achse der elliptischen Öffnung parallel zur Anterior-Posterior - Achse des Embryos (1-C). </li><li> Pinch eine Spitze der Nagelschere durch die Dotterhaut nahe dem Filterpapierträger und schnell um den gesamten Filterpapierträger geschnitten (Abbildung 1-D). </li><li> Mit einer Pinzette, Anheben der Filterpapierträger weg von dem Eigelb in einer schrägen Richtung parallel zur Anterior-Posterior - Achse des Embryos (1-E). </li><li> Drehen Sie den Filterpapierträger um die Bauchseite des Embryos an der Spitze zu haben und tauchen Sie es in der PC-Kochsalzlösung. Tauchen die Filterpapierträger entlang der anterior-posterioren Achse des Embryos in einer schrägen Richtung. </li><li> Befreien Sie sich von all dem Eigelb gebunden noch die Dotterhaut und die blastoderm indem Sie es vorsichtig mit PC-Kochsalzlösung aus einem Kunststoff Transferpipette Spülung. Halten Sie die Gesamtheit des Filterpapierträger auf ein unter Wasserll Zeiten (1-F). </li><li> Entfernen der Filterpapierträger von der PC-saline entlang der anterior-posterioren Achse des Embryos in einer schrägen Richtung und erhalten von der überschüssigen Flüssigkeit zu befreien, indem der Rand des Filterpapierträger auf einem Seidenpapier Abtupfen. </li><li> Halten Sie das Filterpapier horizontal, mit der Bauchseite des Embryos nach oben und legen Sie eine weitere Filterpapierträger auf dem ersten, ein zweites Paar mit einer Pinzette. Ihre Öffnungen sollten genau übereinstimmen, um dadurch zwischen sich den Embryo zwischen den beiden Lagen aus Filterpapier (1-G). </li><li> Unmittelbar unterzutauchen den Filterpapierträger Sandwich in das Kulturmedium in einer schrägen Richtung entlang der Anterior-Posterior-Achse des Embryos. Legen Sie sie in den Bereich überspannt den Raum zwischen den beiden Stahlringen (Abbildung 1-H). </li><li> Befestigen Sie das Filterpapier Sandwich von zwei auf der Oberseite des anderen zwei Stahlringe platzieren, um sicherzustellen, dass die Öffnung mit dem embryo bleibt vollständig freigelegt (Abbildung 1-I). </li><li> Überprüfen Sie die mittlere Ebene und stellen Sie sicher, dass der obere Abstandshalter nur im Medium eingetaucht ist. Falls erforderlich, oder kleine Mengen von Medium zu entfernen. </li><li> Legen Sie das Petrischale in der Mitte der temperaturgesteuerten Ölbad und stabilisieren die Schale seitlich drei große Edelstahlringe, indem (30 mm Außendurchmesser, 4 mm in der Höhe, 1,5 mm Wandstärke) neben dem Gericht im Öl . Stellen Sie sicher , dass die Stahlringe an den Seiten der Schale (Abbildung 1-J) berühren. </li><li> Langsam pipettieren etwa 6 ml leichtem Mineralöl auf die Oberseite des Mediums mit einem Kunststofftransferpipette, so dass das Medium mit einer kontinuierlichen Schicht aus Mineralöl (1-K) bedeckt ist. </li><li> Stellen Sie die Zeitraffer-Akquisition auf. HINWEIS: Die Abbildung der Embryonen als horizontale Panoramen von fünf überlappende Teilbilder (Fliesen) ermöglicht eine detaillierte Bildgebung (5X Objektiv), mit einer allgemeinen overview der Morphologie 29-30. Abbildungs Intervallen zwischen 3 und 10 min ermöglichen die detaillierte Verfolgung von morphologischen 31 ändert, und die Erfassung von kleinen z-Stapel (fünf zu sieben verschiedene Ebenen mit einem Abstand von 30 &amp; mgr; m) kompensiert , ein Großteil der Verdickung und Drehen des Embryos 30 . (Siehe Abschnitt den Repräsentative Ergebnisse für detaillierte Informationen über die Bildaufnahme) Z-Ebenen mit dem höchsten Kontrast kann vor der weiteren Verarbeitung 32 von Einzelbildern in Zeitraffer-Filmen ausgewählt werden. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die getauchten Filterpapier Sandwich einrichten. (A) Ein Ei wird in eine Petrischale geknackt. (B) Die meisten der dicken und dünnen Eiklar wird aus der Petrischale entfernt mit einer Plastiktransferpipette (nicht dargestellt). Dann wird ein Fenster in den dicken Eiweiss entsteht einum den Embryo durch leichtes Abwischen der dicken Eiklars mit einem Seidenpapier entfernt. (C) Ein Filterpapierträger ist um das Blastoderm auf der Oberseite des Dotters angeordnet. (D) Der Filterpapierträger wird geschnitten lose von der umgebenden Vitellinmembran und (E) von der Oberseite des Dotters entfernt. (F) Der verbleibende Dotter wird sorgfältig in einem PC-Solebad weggespült. (G) Der Embryo wird mit einem zweiten identischen Filterpapierträger eingelegt. (H) Das Filterpapier Sandwich wird in das Medium eingetaucht und positioniert auf zwei Metalledelstahlringe (Embryogegenüber dorsalen oder ventralen Seite nach oben). (I) Zwei Ringe stabilisieren das Sandwich von oben. (J) Die Petrischale den Embryo enthält , zu dem temperaturgeregelten Ölbad überführt wird. Edelstahlringe stabilisieren die Petrischale seitlich. (K) Das Kulturmedium wird mit einer Schicht Mineralöl bedeckt.(L) Schematische Darstellung des untergetauchten Filter - Sandwich. (M) Abmessungen der Filterpapierträger für das Tauchfilterpapier Sandwich verwendet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Als neue Variante des etablierten EG Kultur 1 erleichtert die untergetauchten Filterpapier Sandwich den Erwerb von langfristigen Hell- und Dunkelfeld Zeitrafferfilme der frühen Hühnerembryo ex ovo durch eine temperatur- und feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator machen um das Mikroskop entbehrlich. Anstatt sich auf einem halbfesten agar-Eiweiss Boden kultiviert werden, werden die Embryonen gehalten vollständig in einem einfachen Kulturmedium eingetaucht, bestehend aus PC-Kochsalzlösung und dünnen Eiklar. Verdampfung und Wärmeverluste werden durch eine Schicht aus Mineralöl minimiert schwimmend auf dem Kulturmedium. Die Embryonen können leicht kultiviert werden, entweder Rücken- oder Bauchseite nach oben, ohne sichtbare Unterschiede in der Qualität. Wie hier gezeigt, Embryonen im Tauchfilterpapier Sandwich zugänglich sind mikro Interventionen, wie die Anwendung von Morphogen-getränkten Perlen. Zukünftige Anwendungen gehören Live-Fluoreszenz-Bildgebung, Mikroinjektionen und Elektroporation und Gen zu ma-Silencingnipulate und studieren ein breites Spektrum von morphogenetischen Ereignisse während der ventralen (zB frühe Herz und Somitogenese) und dorsalen (zB spät Gastrulation Neuralrohrschlusses und frühen Gehirn) Entwicklung. Eine zeitabhängige medikamentöse Behandlung ist möglich, wenn die Petrischale, die Filterpapier-Sandwich enthält, mit einer Perfusionskammer ersetzt wird, so dass der Austausch des Kulturmediums unter der Mineralölschicht. Das Tauchfilterpapier Sandwich wird seine volle Abbildungspotenzial in Kombination mit laserbasierten Bildgebung (einschließlich Lichtbogen-Mikroskopie) und Tauchziele zu entwickeln. Einige Schwierigkeiten bei der Herstellung des Tauchfilterpapier-Sandwich wird in den nachfolgenden Absätzen behandelt. Obwohl es nur eine moderate Menge an Ausbildung benötigt, kann einen Embryo aus dem Eigelb in das Filterpapier Sandwich, mehrere Schritte, um die Qualität des Embryos in der Kultur beeinflussen immer noch deutlich zu übertragen. Vor der Filterpapierträgerplatziert auf den Dotter, sollte die Dotterhaut um den Embryo von irgendwelchen dicken Eiklars befreit werden. Erst dann wird die Verbindung zwischen dem Filterpapier und der Dottermembran stark genug sein, das Waschen in PC-Kochsalzlösung zu widerstehen. Das Filterpapier des Embryos verbunden sind, sollten Sie die Flüssigkeit / Luft-Grenzfläche so wenig wie möglich überqueren die Spannung auf den Membranen zu minimieren. Einmal zum Waschen in die PC-Kochsalzlösung gebracht wird, muss der gesamte Filterpapierträger jederzeit vollständig untergetaucht bleiben. Die Zeit, in der PC-Salzbad muss auf etwa 30 begrenzt - 60 sec, wenn die Dottermembran aus dem Filterpapier Freigabe beginnt. Dennoch sollte die Reinigung des Embryos sehr sorgfältig ausgeführt werden, wie Eigelb Reste später die Ansicht des Embryos verdunkeln. Während des Waschens, weisen niemals den Strom von der Transferpipette direkt auf den Embryo, sondern immer radial von ihr entfernt. Nach der Embryo aus der PC-Kochsalzlösung zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das Filterpapier horizontal zu halten, zu minimierenSpannung auf den Eihüllen. Dann stabilisieren den Embryo mit dem zweiten Filterpapierträger. Sobald der zweite Filterpapierträger platziert ist, vermeiden jegliche seitliche Spannung zu schaffen, die die Filterpapierträger relativ zueinander und reißen die Eihüllen verschieben könnte. Wenn das Filterpapier-Sandwich in das Kulturmedium gebracht wird, sollte sie auch die Luft / Flüssigkeitsgrenzfläche kreuzen nur einmal Spannung auf die Membranen zu minimieren. Das zweite Paar von Edelstahlringe verwendet, um die Filterpapier-Sandwich von der Spitze zu stabilisieren, sollte sehr langsam gesetzt und ohne Druck Kompression der embryonalen Membranen zu minimieren. Kleine Brüche des Bereichs opaca des Embryos in der Regel während der ersten Stunde der Kultur heilen, aber ein beschädigter Embryo kann und sollte immer durch eine neue Probe ersetzt werden, bevor die Ölschicht oben auf dem Kulturmedium pipettiert. Um das Bild ein ganzer Embryo oder mehrere Proben für hochauflösende Zeitraffer-Filme, die micROSCOPE muss mit einem motorisierten XY-Tisch ausgestattet sein, durch das Mikroskop Software gesteuert. Es ist von entscheidender Bedeutung, die xy-Bühne bewegen sich mit einer minimalen Geschwindigkeit zu haben Schäden an den Embryonen und Turbulenzen in dem Kulturmedium und das Öl zu vermeiden, was die Bildqualität verringert. Für den Erwerb der Zeitraffer-Filme, die hier dargestellt, bewegt die motorisierte XY-Tisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,75 mm / sec. In Zukunft Bildgebung weiter, indem zuerst die Bühne in die gewünschte Position verbessert werden könnte und das Bild nach einer kurzen Ruhezeit zu erwerben Schwingungen und Turbulenzen ausklingen zu lassen. Als Einschränkung sollten potenzielle Nutzer des relativ großen Arbeitsabstand bewusst sein (ca. 1 cm), die für dieses Kulturverfahren, wenn ein aufrechtes Mikroskop ohne Tauchziele verwendet wird. Diese Arbeitsabstand ergibt sich aus der Schicht des Mediums und von Mineralöl auf der Oberseite des Embryos. In der 6 cm Petrischale, hat die Ölschicht ein thickness von etwa 1 bis 1,5 mm, und der Embryo eingetaucht ist etwa 4 mm tief in das Kulturmedium. Je nach Durchmesser des Objektives, könnte die obere Kante der 6 cm-Petrischale auch Zugriff auf den Embryo begrenzen. Dies könnte durch die Verwendung eines größeren Gericht umgangen werden. Der Arbeitsabstand von der Spitze leicht durch die Minimierung der Dicken der Flüssigkeitsschichten reduziert werden. Darüber hinaus könnte der Arbeitsabstand von unten, indem der Embryo weiter nach unten auf den Boden der Petrischale und die Verringerung der Dicke der Glasscheibe des erwärmten Becher minimiert werden. Während das Protokoll optimiert wurde mit einem aufrechten Arbeitsabstand Zoom-Mikroskop arbeiten, könnte es auch zu einem inversen Mikroskop angebracht werden. Künftige Nutzer sollten bedenken , dass zu tief in das Kulturmedium des Embryos Untertauchen könnte zu O 2 -Diffusion Problemen führen, wenn auch vorläufige Experimente deuten darauf hin , dass begrenzte Diffusion scheint kein prob seinlem, solange der Embryo von einem ausreichend großen Reservoir von Kulturmedium und das Filterpapier umgeben sandwichartig ist nicht auf den Boden der Petrischale gedrückt. Eine weitere Einschränkung ist die Temperaturregelung. Durch Einstellen der Temperatur des Reglers für den erwärmten Becherglas auf 40 ° C, die Temperatur im Medium äquilibriert bis 37,5 ° C um die Embryonen, wenn das Medium mit Mineralöl bedeckt ist. Dies zeigt, dass ein Teil der Energie zwischen dem Boden des Bechers verloren geht, in dem die Heizelemente und der Temperatursensor angeordnet sind, und die Lage der Embryonen. Die Temperaturregelung kann durch die Verlagerung des Sensors und die Neuverteilung der Heizelemente optimiert werden.

Embryonalentwicklung hat der Mensch seit Anbeginn der Geschichte fasziniert. Wie entwickeln sich die Struktur und Morphologie eines Embryos in einem solchen wohldefinierten räumlichen und zeitlichen Art und Weise? Der Hühnerembryo hat aus mehreren Gründen eine der klassischen Wirbeltiermodelle für Embryonalentwicklung werden: Es ist leicht verfügbar, kostengünstig, transparent in einem frühen Stadium, und zugänglich für experimentelle Manipulationen, da es außerhalb der Mutter entwickelt. Darüber hinaus hat es eine fast flache Geometrie während der frühen morphogenetischen Ereignisse, wie Herz und Gehirn Bildung, Gastrulation, Neurulation und Somitogenese 15. Morphogenetische Prozesse kann am besten verstanden werden, wenn sie dynamisch, wie durch den Erwerb von Zeitraffer-Bilder untersucht werden. Der Hühnerembryo kann 16 in ovo sichtbar gemacht werden , aber mit schlechten Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen und eingeschränkte Sicht für die Übertragung der Lichtmikroskopie Bildgebung. Daher trennen19 oder als Explantatkulturen 1,20 - - 23 Al - Techniken wurden zur Kultur Hühnerembryonen ex ovo entweder ganz yolk Kultursysteme 13,17 vorgeschlagen. Ganz yolk Kultursystemen bleibt der Embryo auf der Oberseite des intakten Eidotter, und der gesamte Inhalt des Ei wird in einen anderen Behälter zur Inkubation überführt. Dieser Behälter kann ein Surrogat Eierschale 17, eine Petrischale 19, oder eine Hängematte aus Kunststoff Haftverpackungs 13,18 gemacht. Die Embryonen in ganzen Dotter Kulturen lassen sich ideal kultiviert werden bis zum Schlüpfen und zugänglich sind Mikromanipulationen. Diese Techniken sind besonders nützlich für die Untersuchung der Entwicklung von Embryonen nach der Initiierung der Blutzirkulation (was den Kontrast erhöht), während jüngere Embryos hart bleiben sichtbar zu machen. Diese frühen Embryonen können am besten abgebildet werden , wenn sie aus dem Eigelb ausgeschnitten werden und kultiviert , wie in vitro - Explantate. Die Explantate sind leicht zugänglich für Experimental-Manipulationen und benötigen weniger Platz für die Kultivierung. Seit vielen Jahren von Denis Neue Technik im Jahr 1955 Pionierarbeit geleistet und seine Variationen waren die goldenen Standards der Explantation Kultur Methoden für die Hühnerembryonen, wodurch der Embryo bei Zeitraffermikroskopie und mikro Interventionen 20,21 zugänglich zu machen. Trotz des großen Erfolges ist neu Technik relativ aufwendig und zeitraubend. Die blastoderm löst oft , wenn die Dotterhaut, die Durchführung der blastoderm, um einen Glasring gestreckt wird , um die richtige Spannung 1 zu erzielen. Darüber hinaus kann der Embryo nur mit seiner Bauchseite nach oben kultiviert werden. Der EC (Early - Küken) Kultur, eine neuere Technik , entwickelt von Chapman und Collignon 1, umgeht die Dehnung der Vitellinmembran durch einen Filterpapierträger mit einer zentralen Öffnung verwendet wird . Das Filterpapier wird an der Dotterhaut, wodurch seine natürliche Spannung gehalten wird , und umgibt den Embryo wie ein Bilderrahmen 1.Die Embryonen werden dann kultiviert auf einem Agar-Eiweiss Boden, in der Regel mit ihrer Bauchseite nach oben. Rückenseite nach oben Kultivierung scheint nur möglich , Embryonen bei HH8 15 und älter. Viele Gruppen haben die Filterpapierträger auf ihre Bedürfnisse, beispielsweise durch Ersetzen des Agar-Eiweiss Boden mit einem Träger aus chirurgischem Nahtfasern 24 oder einer Membran 25 beschichtet Kollagen angepasst. Oft Embryonen kultiviert mit Neue Technik oder mit dem EG - Kultur ausgesetzt sind, mit ihren dorsalen oder ventralen Boden - Luft - Sauerstoffdiffusion 1,20 zu erleichtern. Diese Explantatkulturen haben in einer befeuchteten Atmosphäre gehalten werden, die Verdampfung des Mediums zu vermeiden und den Embryo vor dem Austrocknen zu verhindern. Dies wird durch Inkubieren der Schale mit dem Explantat - Kultur in einem größeren Petrischale mit angefeuchtetem Tissue - Papier 1 gelöst. Der Erwerb von Zeitraffer-Bilder dieser Embryonen erfordert entweder die Verwendung eines klimakontrollierten Inkubator um das ganze Mikroskop oder ein TemperamentAture gesteuerten Behälter mit einem beheizten Deckel Kondensation in dem Lichtweg 14 zu verhindern. Hühnerembryonen können jedoch auch ex ovo entwickeln vollständig in Kulturmedium als Filterpapierkulturen 25, die zwischen einer Schicht aus schwerem Mineralöl und Eiweiss in Adaptionen von New sprühte 2,21 oder als gefaltete blastoderm Explantate in der &quot;Cornish Pasty Kultur untergetaucht &quot;23,26, ohne direkten Kontakt mit der Luft. Das Tauchfilterpapier Sandwich ist eine neue Variante des Filterpapiers Trägertechnik. Durch frühere Wissen kombiniert Hühnerembryonen ex ovo auf das Züchten, macht es das Klima gesteuerten Inkubator und den beheizten Deckel entbehrlich. Der Embryo wird 24 zwischen zwei identischen (Laser-cut) Filterpapierträger sandwichartig angeordnet und kultiviert vollständig in einem einfachen Kulturmedium (Pannett Compton-saline 27,28 und dünnes Albumen in einem Verhältnis 3: 2) unter Wasser in einem Temperatur enthalten gesteuerter. Eine Schicht aus leichtem Mineralöl auf der Oberseite des Mediums Floating verhindert die Verdunstung 2,21 und minimiert den Wärmeverlust an die Umgebung. Der Boden des Behälters hat ein Glasfenster, und die ganze Einrichtung ist an einem aufrechten Arbeitsabstand Zoom-Mikroskop durchgeführt. Dieser Aufbau ermöglicht die Erfassung von hochauflösenden Hell- und Dunkelfeld Zeitrafferfilme von etwa 30 Stunden der embryonalen Entwicklung, die von der frühen Primitive Streak Stufe in die 28-somite Stufe (entspricht Hamburger Hamilton Stufen 5 bis 16, HH5-16 ) 15. Die Embryonen können genauso gut mit ihren ventralen oder dorsalen Seite nach oben kultiviert werden. Daher sind Embryonen zugänglich Beobachtung und Manipulation von ventralen (zB frühen Herz 7,8 und Somitogenese 6) und dorsalen (zB spät gastrulation 2, Neuralrohrschlusses 3. - 5. und frühen Gehirn 9 bis 13) Entwicklung. Der Tauchfilterpapier Sandwich provides eine einfache und stabile Umgebung für die Mikrochirurgie, Perl- Implantation, Mikroinjektion, Gen-Silencing und Elektroporation Studien. Seine Abbildungs ​​Potential kann durch die Verwendung laserbasierten Bildgebung (einschließlich Lichtbogen-Mikroskopie) und Tauchziele viel weiter vorangetrieben werden.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&amp;nbsp;Reference Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&amp;nbsp;laboratory bottles, with caps, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution A&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution B&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-laser, 130&amp;nbsp;W, wavelength 10.6&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipette Controller</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Serological plastic pipettes, 25&amp;nbsp;ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Plastic document sleeves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue culture dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stainless steel rings, custom-made&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&amp;nbsp;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS Number&amp;nbsp;8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Agar bottoms for EC culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microbead implantation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &amp;micro;m beads were used)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30&amp;nbsp;mm</td><td>SEIRIN</td><td>&amp;nbsp;type J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature controlled beaker&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#039;s and Thermistors MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscope setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&amp;nbsp;mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Rotary Control MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transillumination top 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Insert plate S, glass 237x157x3&amp;nbsp;mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controller EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>System Control Panel SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&quot;</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN module Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/ Positions</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Experiment Designer</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>not available anymore</td></tr></tbody></table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

Aufgrund seiner Verfügbarkeit, niedrige Kosten, flache Geometrie und Transparenz hat die ex ovo Hühnerembryo ein großer Wirbeltiermodell für die Untersuchung von morphogenetischen Ereignisse geworden, wie gastrulation 2, Neurulation 3 bis 5, Somitogenese 6, Herz 7 Biegen, 8 und Gehirnbildung 9 bis 13, während der frühen Embryonalentwicklung. Schlüssel zum morphogenetischen Prozesse zu verstehen, ist sie durch Zeitraffer-Bildgebung dynamisch zu folgen. Der Erwerb von Zeitrafferfilme von Küken Embryonalentwicklung ex ovo hat für einen Inkubator entweder zu kurze Zeitfenster oder auf die Notwendigkeit begrenzt worden zu steuern Temperatur und Feuchtigkeit rund um den Embryo 14. Hier präsentieren wir eine neue Technik zur Kultur Hühnerembryonen ex ovo für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung Durchlichtmikroskopie verwendet wird . Das Tauchfilterpapier Sandwich ist eine Variante des gut etablierten Filterpapierträger technique (EC-Kultur) 1 und ermöglicht die Kultivierung von Hühnerembryonen , ohne die Notwendigkeit für eine Klimakammer. Der Embryo wird zwischen zwei identischen Filterpapierträgern eingeklemmt und gehalten wird vollständig in einer einfachen, temperaturgesteuerten Mediums durch eine Schicht aus leichtem Mineralöl bedeckt getaucht. Ausgehend von der Primitivstreifen Stufe (Hamburger-Hamilton Stufe 5, HH5) 15 bis mindestens 28-somite Stufe (HH16) 15, Embryonen können entweder mit ihren ventralen oder dorsalen Seite nach oben kultiviert werden. Dies ermöglicht die Erfassung von Zeitraffer-Filmen über 30 h der Embryonalentwicklung abdeckt. Repräsentative Zeitraffer-Frames und Filme werden gezeigt. Embryos werden verglichen morphologisch zu einem Embryo kultiviert in der Standard-EC-Kultur. Das Tauchfilterpapier Sandwich bietet eine stabile Umgebung frühen dorsalen und ventralen morphogenetischen Prozesse zu untersuchen. Es ermöglicht auch die Live-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikromanipulationen, wie Mikrochirurgie, Perl- implantation, Mikroinjektion, Gen-Silencing, und Elektroporation und verfügt über ein großes Potenzial für laserbasierte Bildgebung mit Tauchziele kombiniert werden (einschließlich Lichtbogen-Mikroskopie).

<img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig2.jpg" /> Abbildung 2: Morphologische Vergleich von Embryonen in der EG - Kultur 1 und in Versenkte Filterpapier Sandwich Kultur. Ausgewählte Zeitraffer-Frames zeigen die Embryonen in 3 Stunden-Intervallen. Frames werden der Größe verändert sich einen Überblick über volle Embryo Morphologie zu geben. Die Embryonen wurden alters abgestimmt auf die 7-somite Stufe (HH9) 15. 0 h zeigt den Beginn jedes Experiments. Anterior ist immer links. Die Bilder wurden mit Dunkelfeldbeleuchtung erworben. (A) Embryo in der EG - Kultur 1, kultiviert Bauchseite nach oben auf einem Agar-Eiweiss Boden 1,33. Bilder hoher Qualität können erworben werden, da der Embryo in der z-Richtung beschränkt ist. (B und C) Zwei Embryonen kultiviert in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich: (B) ventrale Seite nach oben und (C) Rückenseite nach oben.Embry in dem Filterpapier Sandwich entwickeln, ohne qualitative Unterschiede für 27 Stunden mindestens. Sie entwickeln funktionelle Blutzirkulation und Schädel- und Nackenbeuge und drehen erfolgreich. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Zeitraffer-Akquisition ist abhängig von der Mikroskopsystem zur Verfügung. In dieser Studie wurde eine lange Arbeitsabstand wurde aufrecht Zoom-Mikroskop verwendet. Der Zoomfaktor wurde auf 5X eingestellt. In Kombination mit dem 16 - facher Vergrößerung des Okulars führte dies zu 80X Gesamtvergrößerung, mit einer theoretischen Auflösung von 1,3 &amp; mgr; m / Pixel (wie in der Mikroskop - Software angegeben) 30. Um das Feld-of-view erhöhen, Embryonen wurden als horizontale Panoramen von fünf Teilbilder (Fliesen) abgebildet. Daher wurde ein Fliesenbereich, bestehend aus fünf überlappenden Fliesen, 29 definiert. Diese Fliese Regionpositioniert wurde , um vollständig die elliptische Öffnung des Filterpapierträger in seiner horizontalen Ausdehnung (2B - 0 hr) abzudecken. Jede Kachel hatte eine Größe von 2.048 x 2.048 Pixel, Bedecken eines field-of-view von ca. 2,7 mm und Fliesen wurden mit einer Überlappung von 10% gewonnen, was zu einer Gesamtfeld-of-view von etwa 12 mm x 2,7 mm für das Panorama. Die motorisierte XY-Tisch bewegt relativ zu dem Ziel mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,75 mm / sec zwischen Erfassung der getrennten Kacheln 29. Das Live-Bild wurde auf der vorderen präsomitischen Mesoderm konzentriert und die zuletzt gebildeten Somiten (der Forschungsschwerpunkt unserer Gruppe). Um sich für die Verdickung und Kräuseln der Embryonen in der z-Richtung, kleine z-Stapel (fünf zu sieben verschiedene Ebenen mit einem Abstand von 30 &amp; mgr; m) zu kompensieren wurden zu jedem Zeitpunkt 30 erfasst. Diese wurden um die Brennebene der vorderen Spitze des präsomitischen Mesoderm ausgewählt. Die Dauer der Zeitraffer-ACQuisition wurde auf 50 h eingestellt, und Imaging - Intervallen von 3, 4 oder 10 Minuten wurden 31 ausgewählt. 10 Stunden und die z-Stapel um den neuen optimalen Fokusebene neu zu definieren - Die Qualität der Zeitraffer-Akquisition konnten alle 5 durch Refokussierung verbessert werden. Am Ende des Experiments wurde die gesamte Zeitreihe manuell bearbeitet, und Teilmengen der Bilder der z-Ebene mit dem besten Fokus enthielten , wurden erstellt und gespeichert in einen separaten Ordner 32. Diese Teilmengen der Bilder waren zeit genäht, um eine vollständige Zeit-Serie von Bildern mit optimalen Fokus erstellen. Die Fliesen jedes Bild dieser vollständigen Zeitreihen wurden genäht und miteinander verschmolzen , ohne Shading - Korrektur 30 und Zeitraffer-Rahmen wurden als JPEG-Bilder von 100% Größe und 95% Kompression 32 exportiert. Die Zeitraffer-Rahmen wurden als Bildsequenz in die professionelle Video-Editing-Software importiert. Die detaillierten 100% zoomt wurden stabilisiert, und der Gesamtkontrast wurde nach unserem Geschmack angepasst. Die Endzeit-Verfehlungen waren kodierend mit dem H.264-Codec und in MPEG-4-Container exportiert. Filme werden mit einer Bildrate von 15 Bildern / s (fps) und einer Auflösung von 1.920 x 1.080 Pixeln angezeigt. Abbildung 2 zeigt einen Vergleich zwischen einem Embryo in der EG - Kultur 1 (2A) und zwei Embryonen in dem untergetauchten Filterpapier Sandwichkultur, von denen eines kultivierten Bauchseite nach oben (2B) und die andere Rückenseite nach oben (Abbildung 2C). Alle Embryonen wurden alters abgestimmt auf die sieben somite Stufe (HH9) 15 und mit einer zeitlichen Auflösung von 4 min (2A und B) oder 10 min (2C) abgebildet. Ausgewählte Rahmen von 3 Stunden Intervallen dargestellt. Die EG - Kultur (2A) erlaubt sehr stabile Bildgebung aufgrund der Embryo auf einem stabilen Agar-Eiweiss Boden 1,33 ruht. Der gesamte Embryo blieb in einer Fokusebene im gesamten ter ganze Zeitraffer. Dies könnte für kürzere Experimente (mehrere Stunden) und sehr frühen Embryonen von Vorteil sein, aber es wird mit einer starken Begrenzung des Embryos in der z-Richtung, möglicherweise seine erfolgreiche dreidimensionale Entwicklung langfristig zu behindern. Am Anfang führte die Confinement nur in einem geringen seitlichen Abflachung des Kopfes des Embryos im Vergleich zu einem Embryo kultiviert in dem untergetauchten Filterpapier - Sandwich mit seiner Bauchseite nach oben (2A und 2B bei 0 hr vergleichen). Später wurde die Drehung des Kopfes beeinträchtigt (2A - 21 h) und der Herzschlag verlangsamt. Die Blutzirkulation fast gestoppt. Siehe Supplemental Film 1 für den kompletten Zeitraffer des Embryos in der EG - Kultur. Die obere Platte in diesem Film zeigt einen vollständigen Überblick über den Embryo, während die Platte auf der unteren linken die Herzentwicklung in voller Auflösung visualisiert. Die Segmentierung des präsomitischen Mesoderm in Somiten kann sich seinen im Detail auf der unteren rechten Seite. Embryos im Tauchfilterpapier-Sandwich, auf der anderen Seite, wurden nur durch die natürliche Spannung der Membranen umgeben sie in ihrer dreidimensionalen Ausdehnung begrenzt. Sie konnten kultiviert entweder mit ihren ventralen (2B) oder dorsalen Seite nach oben (Abbildung 2C) sein. So oder so, zeigten die Embryonen kontinuierlich Somitogenese, und ihre Köpfe gedreht. Sie entwickelten Schädel- und Nackenbeuge und funktionellen Blutzirkulation. Beide Embryonen in das Filterpapier Sandwich wurden mit dem Fokus auf das Segmentieren Mesoderm abgebildet, so dass Teile des Kopfes nach und nach aus dem Fokus bewegt, wie die Embryonen wuchsen, verdickt, und fing an zu drehen, während das Segmentieren Teil des Mesoderm im Fokus blieb (2B und 2C bei 21 h bis 27 h vergleichen). Supplemental Movie 2 zeigt die komplette Zeitraffer-Film des Embryos dargestelltin 2B. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die obere Platte des Films zeigt einen vollständigen Überblick über den Embryo. Die Entwicklung des Embryos wurde nacheinander über 46 h abgebildet wird, aber nach etwa 30 Stunden, wurde der Fokus auf die Segmentierungs Mesoderm aufgrund der allgemeinen Verdickung und Drehen des embryonalen Gewebes verloren. Die untere linke Tafel zeigt die frühe Entwicklung des Herzens in voller Auflösung aus den akquirierten Zeitraffer Frames. Durch Fusion der paarigen Herz primordia auf beiden Seiten der Mittellinie wird eine nahezu gerade röhrenförmige Struktur gebildet, die auf der rechten Seite später beginnt Schlagen und Biegen. Die untere rechte Bild zeigt die zuletzt gebildeten Somiten und die vordere Spitze des präsomitischen Mesoderm in voller Auflösung und verfolgt die Bildung neuer Somiten im Laufe der Zeit. Supplemental Movie 3 zeigt eine andere Embryo kultiviert und Bauchseite nach oben in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich abgebildet. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Der Film deckt the Entwicklung des Embryos von Stufe HH5-6 auf etwa Stufe 15 HH14, über etwa 27 h Kulturzeit. Der Kopf falten Formen und schreitet nach hinten. Die Herzformen von ihren bilateralen primordia, beginnt zu schlagen, und biegt nach rechts ab. Die ersten drei bis vier Somiten gleichzeitig bilden. Zusätzliche Somiten Knospe der Reihe nach von der vorderen Spitze des präsomitischen Mesoderm ab. Das untere Feld zeigt den Kopfbereich des Embryos in voller Auflösung, so dass die Beobachtung der Kopffalte und frühen Herzbildung in hoher Detailstufe. Aufgrund der Transparenz des Embryos kann der Verschluss des Neuralrohrs in Zukunft Kopfbereich zu beobachten. Supplemental Film 4 Displays somite Bildung im gleichen Embryo in voller Auflösung über den gesamten Belichtungszeit in der unteren Platte. Supplemental Film 5 zeigt den kompletten Zeitraffer des Embryos kultiviert dorsalen Seite nach oben (Abbildung 2C). Das Abbildungs ​​Intervall betrug 10 min. Während der upper Tafel zeigt die Entwicklung des Embryos von der sieben somite Stufe (HH9) auf etwa Stufe HH16-17 wird die untere Platte, die morphologischen Veränderungen in der frühen Gehirn in dieser Phase in voller Auflösung angezeigt werden abgeschnitten. Die lokale Schwellung des Neuralrohr beobachtet werden kann, auf die Regionalisierung des Vorderhirns, des Mittelhirns führt, und Rautenhirns, die in den fünf Teilbereiche des embryonalen Gehirn teilen , werden an 13 Stufen. Außerdem kann das Wachstum der Augenblasen deutlich zu erkennen. Nach etwa 30 Stunden in der Kultur, stirbt der Embryo. Um die Kompatibilität des Tauchfilterpapier-Sandwich mit mikro Manipulationen mehrere Polystyrolmikrokügelchen (~ 40 &amp; mgr; m im Durchmesser) zeigen, wurden in den oder in der Nähe des präsomitischen Mesoderm eines Hühnerembryo in dem untergetauchten Filterpapier Sandwichkultur implantiert. Die Mikrokügelchen wurden in PBS gewaschen Aufbewahrungspuffer zu entfernen und IMPLANted, bevor sie mit der Schicht aus leichtem Mineralöl das Kulturmedium zur Deckung (vergleiche 2.18 des Protokolls Abschnitt zu Schritt). Eine Glaspasteurpipette wurde verwendet, um die Perlen zu den Embryo Oberfläche zu übertragen, unter Beobachtung durch die Okulare des Mikroskops. Fünf Löcher wurden in der endoderm erstellt indem Sie es vorsichtig mit einer Akupunktur-Nadel Schaben. Eine maßgeschneiderte J-förmigen Werkzeug, geschaffen durch Strecken und ein Glas Pasteur Pipette in einer Flamme Biegen, wurde verwendet, um die Perlen zu manipulieren und schieben Sie sie vorsichtig in die Löcher, bis sie unbeweglich geworden ist. Drei Bohrungen wurden mit einem Wulst jeweils gefüllt (3A - 0 h und 3B *) und zwei Löcher mit zwei Perlen jeder (3A - 0 h). 3A zeigt, in ausgewählten Zeitraffer-Frames, die Entwicklung des Hühnerembryos nach der mikro Implantation der Perlen. Drei Perlen wurden erfolgreich in das Gewebe an der gewünschten Stelle eingebracht, und ihre Bewegung wurde über die abzubildendeVerlauf des Experiments in hoher Detailstufe (3B). Die Entwicklung des Embryos schien nicht durch die Manipulation oder das Vorhandensein der Kugeln beeinträchtigt. Siehe Supplemental Film 6 für die volle Zeitraffer-Film. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig3.jpg" /> Abbildung 3: Zeitraffer-Imaging nach Microbead Implantation. Proof-of-Prinzip Experiment, um die Kompatibilität des Tauchfilterpapier Sandwich mit Mikrobead Implantation zeigt. Der Kopf des Embryos ist auf der linken Seite, aber es wurde während dieses Experiments abgebildet. Die Bilder wurden mit Dunkelfeldbeleuchtung erworben. (A) Ausgewählte Zeitraffer-Frames der manipulierten Embryos in 3 Stunden Intervallen nach der Implantation von sieben Mikrokügelchen zeigt (~ 40 &amp; mgr; m im Durchmesser). Der Embryo verlängert und kontinuierlich zusätzliche SOMIT gebildetes. Drei Perlen scheinen wurden ordnungsgemäß angebracht und medial mit dem Gewebe fließen über 18 Stunden der Kultur bewegt. Die anderen vier Perlen tauchte aus ihren Löchern zwischen 6 und 9 h der Kultur und posterior trieb. (B) Detailansicht der drei einzelnen Kügelchen (B1 bis B3) implantiert in die präsomitischen Mesoderm zu Beginn des Experiments (0 h, B *) und nach 12 Stunden Inkubation (B **). Die Anzahl der gerade bildenden Somiten angezeigt (S9 in B * und S18 in B **). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie1.jpg" /> Supplemental Film 1: EC-Kultur ventralen Seite nach oben. Embryo in der EG - Kultur 1, kultiviert Bauchseite nach oben, von der sieben somite Stufe (HH9) 15 weiter auf einem Agar-Eiweiss bottom 1,33. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der linken oberen Ecke angezeigt. Qualitativ hochwertige Bilder konnten erworben werden, wie der Embryo in der z-Richtung beschränkt war. Nach 21 Stunden wurden die Herzschlag und den Blutfluss fast verhaftet und der Embryo zu zerfallen begonnen hatte. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über den Embryo, während die unteren Platten der Herzentwicklung (linkes Bild) und Segmentierung des präsomitischen Mesoderm (rechtes Bild) in voller Auflösung (100% Zoom) zu visualisieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_1_EC_culture-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie2.jpg" /> Supplemental Movie 2: Abgetaucht Filterpapier Sandwich ventralen Seite nach oben. Embryo in dem untergetauchten Papier Sandwich kultiviert aus der sieben somite Stufe (HH9) 15 ab, ventralen side nach oben zeigt. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt, nach 24 Stunden neu gestartet wird. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos über 46 h, nacheinander. Die untere linke Tafel visualisiert frühen Herzentwicklung während der ersten 10 Stunden der Bildaufnahme in voller Auflösung (100% Zoom). Die untere rechte Tafel zeigt Segmentieren Mesoderm über ca. 30 h Entwicklung in voller Auflösung (100% Zoom) bis Fokus aufgrund der allgemeinen Verdickung und Drehen von embryonalem Gewebe verloren geht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_2_Sandwich-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie3.jpg" /> Supplemental Movie 3: Kopf Faltenbildung. Embryo kultiviert Bauchseite nach oben in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich aus der erAd-Prozess / Kopf-fach Stufe (HH5-6) 15 bis etwa dem 22 somite Stufe (HH14) 15 über etwa 27 h Kulturzeit. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt, nach 24 h erneut gestartet wird. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos. Das untere Feld zeigt den Kopfbereich des Embryos in voller Auflösung (100% Zoom). Die Bildung der Kopffalte und frühen Herz und die Schließung des Neuralrohrs beobachtet werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_3_Sandwich-Ventral_up-Head.mp4" target="_blank">(Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Film 4" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie4.jpg" /> Supplemental Film 4: Somitogenese. Embryo kultiviert Bauchseite nach oben in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich aus dem Kopf-Prozess / Kopf-fach Stufe (HH5-6) 15auf etwa die 22-somite Stufe (HH14) 15 über etwa 27 h Kulturzeit. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt, nach 24 h erneut gestartet wird. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos. Das untere Feld zeigt das Segmentieren paraxialen Mesoderm in voller Auflösung (100% Zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_4_Sandwich-Ventral_up-Somitogenesis.mp4" target="_blank">(Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie5.jpg" /> Supplemental Film 5: Unterfilterpapier Sandwich dorsalen Seite nach oben. Embryo kultiviert dorsale Seite der sieben somite Stufe (HH9) 15 bis etwa zur HH16-17 Stufe 15 in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich nach oben. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 10 min. Die relative Zeit angezeigt wirdin der linken oberen Ecke in h und min, einen Neustart nach 24 Stunden. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos. Das untere Feld zeigt morphologische Veränderungen im frühen Gehirn in voller Auflösung (100% Zoom). Der Embryo starb nach etwa 30 Stunden in der Kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_5_Sandwich-Dorsal_up-Head.mp4" target="_blank">(Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Film 6" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie6.jpg" /> Supplemental Film 6: Microbeads Implantierte. Embryo kultiviert Bauchseite für etwa 19 Stunden in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich nach oben, von der neun somite Stufe beginnend (HH9-10) 15. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über den Heckbereich mit sieben Mikrokügelchen in die pr implantiertesomitic Mesoderm. Das untere Feld zeigt den Bereich mit implantierten Mikrokügelchen in voller Auflösung (100% Zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_6_Sandwich-Ventral_up-Microbeads.mp4" target="_blank">(Rechtsklick zum Download).</a>

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A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

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Serie: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling.  In addition, it allows for molecular perturbations of several types, including placement of protein-coated beads and introduction of plasmid DNA using in ovo electroporation.  These experiments have yielded important data on the development of the central and peripheral nervous systems.  For many of these studies, it is necessary to open the eggshell and reclose it without perturbing the embryo's growth.  The embryo can be examined at successive developmental stages by re-opening the eggshell.  While there are several excellent methods for opening chicken eggs, in this article we demonstrate one method that has been optimized for long survival times.  In this method, the egg rests on its side and a small window is cut in the shell.  After the experimental procedure, the shell is used to cover the egg for the duration of its development.  Clear plastic tape overlying the eggshell protects the embryo and helps retain hydration during the remainder of the incubation period.  This method has been used beginning at two days of incubation and has allowed survival through mature embryonic ages.

The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling. In this article we demonstrate one egg preparation method that has been optimized for long survival times.

Windowing Chicken Eggs für Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Biologie

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis is becoming increasingly recognized. In particular, the embryonic chick heart and brain tube, which undergo drastic morphological changes as they develop, are among the prime candidates to study the role of physical forces in morphogenesis. Progressive ventral bending&#160;and rightward torsion of the tubular embryonic chick brain happen at the earliest stage of organ-level left-right asymmetry in chick embryonic development. The vitelline membrane (VM) constrains the dorsal side of the embryo and has been implicated in providing the force necessary to induce torsion of the developing brain. Here we present a combination of new ex-ovo experiments and physical modeling to identify the mechanics of brain torsion. At Hamburger-Hamilton stage 11, embryos are harvested and cultured ex ovo (in media). The VM is subsequently removed using a pulled capillary tube. By controlling the level of the fluid and subjecting the embryo to a fluid-air interface, the fluid surface tension of the media can be used to replace the mechanical role of the VM. Microsurgery experiments were also performed to alter the position of the heart to find the resultant change in the chirality of brain torsion. Results from this protocol illustrate the fundamental roles of mechanics in driving morphogenesis.

Here, we present a protocol introducing a set of new ex-ovo experiments and physical modeling approaches for studying the mechanics of morphogenesis during early chick embryonic brain torsion.

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Biotechnik

Längsschnittüberwachung der Mechanik der Neuralplatte in der Entwicklung des Hühnerembryos

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

Autor im Rampenlicht: Berührungslose Messung der Gewebemechanik in lebenden Kükenembryonen mittels Brillouin-Mikroskopie

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit

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Optimierte

Windowing Chicken Eggs für Developmental Studies

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos