Name: a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

המחברים מודים תמיכה כספית ממענק ZonMW-Vici 918.11.635 (הולנד). המחברים מבקשים להודות חנות כלי של אמסטרדם Vrije Universiteit לעצות מעשיות שלהם לייצור הרכיבים להתקנה Jarno Voortman של Carl Zeiss הולנד עבור עצות מועילות על מיקרוסקופיה. Marjolein Blaauboer היה תמיכה גדולה עוד להתייחס באופן ביקורתי על מספר טיוטות של כתב היד.

כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם ניסויי הולנד על בעלי חי חוק. הערה: שיטת כריך נייר הסינון השקועה היא שונה מ -1. 1. הכנת מסנן שקוע סנדוויץ נייר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pannett-קומפטון (PC) -saline 27,28 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין פתרונות מניות (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 121 גרם של NaCl, 15.5 גרם של KCl, 10.42 גר &#39;CaCl 2 · H 2 O, ו -12.7 גרם של MgCl 2 · 6H 2 O) ו- B (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 2.365 גרם של Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, ו 0.188 גרם של 2 לאא PO 4 · 2H 2 O) בבקבוקים 1-L נקי. ולאחסן אותם ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מלוחים PC ידי ערבוב 900 מ&quot;ל של ultrapure H 2 O עם 40 מ&quot;ל של פתרון המניות ו -60 מ&quot;ל של B פתרון המניות (לפי סדר זה, כדי למנוע משקעים). כן fr PC-מלוח הטריפתרונות המניות אום א &#39;וב&#39; כל שבוע. הערה: פתרונות מניות יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. מעוקר ו / או הוספת אנטיביוטיקה או antimycotics אינה נחוצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של ביצי תרנגולת מופרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה humidified, מטילים את הביצים בצד שלהם דגירה אותם על 37.5 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל הרצוי. הערה: חנות ללא ביצים יותר משבועיים (רצוי 12 - 15 ° C) לפני הניסוי, כמו hatchability יקטן באופן משמעותי </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקי נייר סינון (מותאם מ 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זמין, להשתמש במכונת חיתוך ליזר לחתוך ספקי נייר פילטר בצורת שעון חול מנייר סינון עבה (28 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ). להתחדד רוחב באמצע מ -22 מ&quot;מ עד 10.4 מ&quot;מ. לגזור צמצם אליפטי מרכזי (10.6 מ&quot;מ x 5.5 מ&quot;מ), עם הציר כבר המקבילי חוקי האליפסה לצד הגדול של מוביל נייר סינון (איור 1-M). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להכין שבלונה מקרטון עם הממדים הנכונים ולהעביר מתאר שלה וכי של הצמצם המרכזי נייר סינון עבה בעפרון. לגזור מוביל נייר סינון באמצעות מספריים בסדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך שתי נושאות נייר סינון זהות עבור כל עובר להיות explanted. כן ספקי נייר סינון נוספים כגיבוי למקרה עובר הולך לאיבוד במהלך explanting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטית בקרת טמפרטורת שמן (ביום של הניסוי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את כוס בקרת הטמפרטורה במרכז של XY-הבמה הממונע של המיקרוסקופ זום זקוף ולחבר את הכוס אל בקר הטמפרטורה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ארבע טבעות נירוסטה גדול (30 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 4 מ&quot;מ גובה, 1.5 עובי דופן מ&quot;מ) לתוך צלחת 6 ס&quot;מ פטרי לפעול כמו משקולות במקום צלחת באמצע כוס בקרת טמפרטורה. הערה: צלחת פטרי זה רק משמש כמציין מיקום להתאים את leve שמןl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את כוס בקרת טמפרטורה עם 130 מ&quot;ל של שמן מינרלי אור. התאם את מפלס השמן במידת הצורך, כך שהוא יסתיים כ -3 מ&quot;מ מתחת לקצה העליון של המנה 6 ס&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את המאפה 6 ס&quot;מ פטרי מקנקן בקרת טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה ל 40 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. הפקת סנדוויץ נייר סינון שקוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני תרבות (ביום של הניסוי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 30 מ&quot;ל של תמיסת מלח PC (כפי שהוכנו בצעדים 1.1.1 1.1.2) לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הכן צינור צנטריפוגות אחד 50 מ&quot;ל מלא 30 מ&quot;ל של תמיסת מלח מחשב לכל שני עוברים להיות explanted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לפצח ביצה הלא מודגרות לתוך צלחת 10 ס&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר חלבון רזה על ידי העברת פיפטה העברת פלסטיק לאורך הקירות של צלחת פטרי ולהכניס פנימה את החלבון דק. אסוף 30 מ&quot;ל חלבון רזה צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל לכל שני עוברים להיות explanted. הקפד לקבל רק את tין חלבון. הערה: בדרך כלל 3 - 4 ביצים לאפשר את המסיק של כ -30 מ&quot;ל של חלבון רזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 20 מ&quot;ל של חלבון רזה לתוך כל-מלוחים PC מלא 50 מ&quot;ל צינור צנטריפוגות (כפי מוכן בשלב 2.1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את-מלוחים PC עם חלבון רזה על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. תן לו להתיישב במשך כמה דקות ולבדוק אם התערובת, שנקראה בינוני תרבות מכאן ואילך, ברורה. אם מדיום התרבות אינו ברור, להכין PC-מלוח טרי מפתרון המניות ולמסוק חלבון רזה טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שתי טבעות נירוסטה קטנות (20 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 4 מ&quot;מ גובה, עובי דופן 1.5 מ&quot;מ, 6.5 פער מ&quot;מ הטבעת) רחוק ככל האפשר בצלחת פטרי 6 סנטימטרי פלסטיק טריה ולמלא אותו עם 22 מיליליטר של תרבות בינוני (כפי שהוכנו בצעדים 1.4.1 כדי 1.4.4) בעזרת פיפטה פלסטיק 25 מ&quot;ל (איור 1-H). ודא כי הפסולת שהצטברו על גבי המדיום נשאר בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר o פסולתr בועות מהמדיום בעזרת פיפטה העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת 10 ס&quot;מ פטרי עם 75 מ&quot;ל של תמיסת מלח PC (לשמש בשלב 2.15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביצה מן החממה ולתת לו לנוח על הספסל על צידו דקות 1 לתת העובר לבוא העליון של החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסדוק את הביצה לתוך צלחת פטרי (איור 1-A). משרה את הקצה של פיסת נייר טישו משובח החלבון העבה ומרכז את blastoderm ידי משייכת, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של החלבון הדק בעובי מצלחת פטרי בעזרת פיפטה פלסטיק העברה (עם הקצה לחתוך כדי להקל על הספיגה של החלבון העבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור חלון החלבון העבה סביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם פיסת נייר טישו, מתרחק מהמרכז (איור 1-B). למנוע את נייר האריזה מן נלוות קרום vitelline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, בזהירות למקם נשאית נייר סינון על Viteקרום lline סביב העובר, עם ציר כבר המקבילי הצמצם אליפטי לציר האחורי-הקדמי של העובר (איור 1-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט קצה אחד של מספריים לציפורניים דרך הממברנה vitelline הקרובה למוביל נייר הסינון לחתוך במהירות ברחבי מוביל נייר סינון כולה (איור 1-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, הרם את המוביל נייר סינון מן החלמון הקבלה בכיוון אלכסוני לציר הקדמי, האחורי של העובר (איור 1-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את הספק נייר סינון סביב להיות בצד הגחון של העובר על גבי להשקיע אותה-מלוחים PC. לטבול מוביל נייר הסינון לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפטר כל החלמון עדיין מחוברת הממברנה vitelline ואת blastoderm ידי שטיפתו בעדינות עם מי מלח מחשב מפני פיפטה פלסטיק העברה. שמור את המכלול המוביל נייר סינון שקוע בכלפעמים LL (איור 1-F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר המוביל נייר סינון מן-המלוח PC לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני ו להיפטר הנוזל העודף בטופחו הקצה המוביל נייר הסינון על ממחטת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את נייר הסינון אופקי, עם הצד הגחוני של העובר פונה כלפי מעלה, ומניח אחר המובילים נייר פילטר על גבי הראשון, באמצעות זוג נוסף של פינצטה. הפתחים שלהם צריכים להתאים בדיוק, ובכך רבדה העובר בין שתי השכבות של נייר סינון (איור 1-G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להטביע את הכריך המוביל נייר סינון לתוך מדיום התרבות בכיוון אלכסוני לאורך ציר ה- הקדמי, האחורי של העובר. מניח אותו באזור מחלק את המרחב בין שתי טבעות הפלדה (איור 1-H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כריך נייר פילטר על ידי הצבת שתי טבעות פלדה יותר על גבי שני אחרים, ולוודא כי הצמצם עם הדוארmbryo השרידים שנתגלו לחלוטין (איור 1-I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרמה הבינונית לוודא כי spacer העליון רק הוא שקוע בתוך המדיום. במידת הצורך, להוסיף או להסיר כמויות קטנות של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום צלחת פטרי במרכז באמבטיה שמן בקרת טמפרטורה ולייצב את המנה רוחבית על ידי הצבת שלוש טבעות נירוסטה גדול (30 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 4 מ&quot;מ גובה, 1.5 עובי דופן מ&quot;מ) לצד המנה בשמן . ודא כי טבעות פלדה לגעת בדפנות של המנה (איור 1-J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט פיפטה כ -6 מ&quot;ל של שמן מינרלי אור על גבי המדיום עם טפטפת העברת פלסטיק, כך המדיום מכוסה שכבה רציפה של שמן מינרלי (איור 1-K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רכישת זמן לשגות. הערה: הדמיה העוברים כמו פנורמות אופקיות של חמש תמונות תת חופפים (אריחים) מאפשרת הדמיה מפורטת (אובייקטיבית 5X), עם overvi כלליEW של מורפולוגיה 29-30. במרווחי הדמיה בין 3 ל 10 דק &#39;לאפשר המעקב המפורט של מורפולוגיים משנה 31, ורכישת Z- ערימות קטנות (חמישה עד שבעה מטוסים שונים, תוך שמירת מרחק של 30 מיקרומטר) מפצים על הרבה של עיבוי המפנה של העובר 30 . ניתן לבחור Z-מטוסים עם הניגוד הגבוה ביותר לפני עיבוד נוסף 32 של מסגרות יחידה לתוך סרטי הזמן לשגות (ראה סעיף נציג תוצאות לקבלת מידע מפורט על רכישת תמונה). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> איור 1: הגדרת סנדוויץ נייר סינון השקוע. (א) ביצה סדוקה לתוך צלחת פטרי. (ב) רוב החלבון באש ובמים יוסרו צלחת פטרי עם טפטף פלסטיק העברה (לא מוצג). לאחר מכן, חלון החלבון העבה הוא יצרסביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם נייר טישו. (C) מנשא נייר הסינון ממוקם סביב blastoderm על גבי החלמון. (ד) המוביל נייר המסנן להתנתק מן הקרום vitelline שמסביב (E) הוסרו מהחלק העליון של החלמון. (ו) חלמון הנותרים הוא נשטף בזהירות באמבט PC-מלוח. (ז) עובר הוא דחוק עם מנשא נייר סינון זהה שני. (ע) כריך נייר פילטר טבול בתוך המדיום ואת מיקומו על שתי טבעות נירוסטה מתכת פלדה (הגבי פונה העובר או בצד הגחון למעלה). (אני) שתי טבעות לייצב את הכריך מלמעלה. (י) את צלחת פטרי שמכילה את העובר מועבר אמבט שמנים עם בקרת טמפרטורה. טבעות פלדת אל-חלד לייצב את צלחת פטרי רוחבית. (יא) בינוני התרבות מכוסה בשכבה של שמן מינרלי.(L) סכמטי של הכריך המסנן השקוע. (M) מידות של ספקי נייר פילטר המשמשים את כריך נייר פילטר השקוע. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כתוצאת גרסה חדשה של תרבות 1 והמבוססת EC, כריך נייר פילטר השקוע מקל על רכישת סרטי brightfield ו הזמן לשגות darkfield לטווח ארוך של האקס עובר אפרוח מוקדם אובו ידי ביצוע חממה בטמפרטורה ו-לחות מבוקרות סביב המיקרוסקופ אפשר לוותר עליהן. במקום להיות מתורבת על התחתונה חצי מוצקה אגר-חלבון, העוברים מוחזקים שקועים לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוט המורכבת-מלוח PC ו חלבון רזה. אידוי איבוד חום הם מזעריים על ידי שכבה של שמן מינרלים צפה על גבי המדיום לתרבות. עובר יכול להיות מתורבת בקלות, או הגבו או למעלה בצד גחון, ללא הבדלים גלויים באיכות. כפי שניתן לראות כאן, עוברים את הכריך נייר פילטר שקוע נגישים להתערבויות מיקרו, כמו יישום של חרוזים ספוג מורפוגן. יישומים עתידיים כוללים דימות פלואורסצנטי חיים, microinjections ו electroporation, ואת גן השתקה לאמאnipulate וללמוד מגוון רחב של אירועים המוךפו&quot;גנטי שהולכים במהלך הגחון (למשל, לב somitogenesis מוקדם) ועל גב (למשל, gastrulation מאוחר, סגירת צינור עצבית, והמוח מוקדם) פיתוח. טיפול תרופתי תלוי זמן אינו ריאלי אם צלחת פטרי המכילה את כריך נייר פילטר מוחלפת בתא זלוף, המאפשר החלפת בינוני התרבות מתחת לשכבת שמן מינרלים. כריך נייר פילטר השקוע יפתח פוטנציאל ההדמיה המלא שלה בשילוב עם הדמיה מבוססת ליזר (כוללים מיקרוסקופ אור גיליון) ויעדי טבילה. כמה קשיים עם הכנת כריך נייר פילטר השקוע יטופלו בפסקאות הבאות. למרות שזה דורש כמות של אימון מתונה בלבד להעביר עובר מן החלמון לתוך כריך נייר פילטר, כמה צעדים עדיין יכולים להשפיע על האיכות עובר באופן משמעותי בתרבות. לפני מוביל נייר סינון הואהניח על החלמון, קרום vitelline סביב העובר צריך להיות משוחרר מכל חלבון עבה. רק אז יהיה הקשר בין נייר הסינון ואת קרום vitelline להיות חזק מספיק כדי לעמוד הכביסה ב-מלוח PC. העיתון המסנן נושא את העובר צריך לחצות את הממשק הנוזל / אוויר כמה שפחות כדי למזער את המתח על ממברנות. לאחר שהובא אל-מלוח PC לשטיפה, המוביל נייר הסינון כולה צריך להישאר שקוע לחלוטין בכל העת. השעה באמבטית PC-מלוח חייבת להיות מוגבלת לכ 30 - 60 שניות, כמו קרום vitelline יתחיל שחרור מעיתון הסינון. ובכל זאת, ניקוי של העובר צריך להיות מוצא להורג באופן יסודי ביותר, כמו שאריות חלמון יהיה מאוחר לטשטש את התצוגה של העובר. במהלך הכביסה, לא להצביע הנחל מן פיפטה העברת ישירות על העובר, אבל תמיד רדיאלית ממנו. לאחר הסרת העובר מן-המלוח PC, הקפד להחזיק את נייר הסינון אופקי כדי למזערמתח על ממברנות העובריים. לאחר מכן, לייצב את העובר עם מוביל נייר הסינון השני. ברגע מוביל נייר הסינון השני מושם, להימנע מיצירת מתח לרוחב, אשר יכול להעביר את נושאי נייר סינון ביחס לזה ולקרוע את הקרומים העובריים. כאשר כריך נייר הסינון מובא לתוך מדיום התרבות, הוא צריך גם לחצות את ממשק האוויר / נוזל רק פעם אחת כדי למזער מתח על ממברנות. הזוג השני של טבעות נירוסטה המשמשות לייצב את כריך נייר פילטר מלמעלה צריך להיות ממוקם מאוד לאט לאט ובלי שום לחץ לצמצם דחיסה של הקרומים העובריים. קרעים קטנים של האזור opaca של העובר בדרך כלל לרפא במהלך השעה הראשונה של תרבות, אבל עובר פגום יכול ותמיד צריך להיות מוחלף על ידי מדגם חדש לפני שכבת שמן הוא pipetted על גבי המדיום לתרבות. כדי לקלוט תמונה של עובר כולו או דגימות מרובות עבור ברזולוציה גבוהה זמן לשגות סרטים, המיקרופוןroscope חייב להיות מצויד XY-הבמה ממונע, שבשליטת תוכנת מיקרוסקופ. זה הוא בעל חשיבות מכרעת כדי לקבל את מהלך XY הבמה עם מהירות מינימאלית, כדי למנוע פגיעה את העוברים ואת המערבולות במדיום התרבות והשמן, אשר יקטינו את איכות התמונה. לרכישה בסרטי הזמן לשגות שהוצגו כאן, xy-הבמה הממונע עבר עם מהירות של כ 1.75 מ&quot;מ / sec. בעתיד, הדמיה יכולה להשתפר עוד יותר על ידי ההעברה הראשונה בשלב למיקום הרצוי והרכישה את התמונה לאחר תקופת מנוחה קצרה לתת תנודות מערבולות להתפוגג. כהגבלה, משתמשים פוטנציאליים צריכים להיות מודעים של מרחק העבודה הארוך יחסית (כ 1 סנטימטר) דרושי שיטת התרבות הזאת אם מיקרוסקופ זקוף ללא מטרות טבילה משמש. תוצאות מרחק עבודה זו מהשכבה של בינוניות של שמן מינרלי על גבי העובר. בצלחת 6 ס&quot;מ פטרי, שכבת שמן יש thicknesים של כ 1 - 1.5 מ&quot;מ, ואת העובר הוא שקוע כ 4 מ&quot;מ עמוק בתוך המדיום לתרבות. תלוי בקוטר של המטרה, בקצה העליון של המנה 6 ס&quot;מ פטרי יכול גם להגביל את הגישה העובר. זה אפשר לעקוף באמצעות מנה גדולה יותר. מרחק העבודה מלמעלה יכול להיות מופחת מעט על ידי מזעור העוביים של השכבות הנוזלות. בנוסף, מרחק העבודה מלמטה יכול להיות ממוזער על ידי הביא את העובר בהמשך לחלק התחתון של צלחת פטרי הקטנת העובי של חלון הזכוכית של הכוס המחוממת. בעוד פרוטוקול מותאם לעבודה עם מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוך, זקוף, זה יכול להיות מצויד מיקרוסקופ הפוכה גם כן. משתמשים עתידיים צריכים לזכור כי השריית העובר עמוקה מדי במדיום התרבות עלולה להוביל O 2 -diffusion בעיות, למרות מציעים ניסויים ראשוניים כי דיפוזיה מוגבלת לא נראית להיות probלם, כל עוד העובר מוקף מאגר מספיק גדול של מדיום תרבות נייר הסינון הדחוק לא נלחץ אל החלק התחתון של צלחת פטרי. מגבלה נוספת היא בקרת הטמפרטורה. על ידי התאמת הטמפרטורה של הבקר עבור הכוס המחוממת ל -40 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה בטווח הבינוני equilibrates 37.5 ° C ברחבי עובר כאשר המדיום מכוסה שמן מינרלים. זה מראה כי כמה אנרגיה הולכת לאיבוד בין החלק התחתון של הכוס, שבו גופי החימום ואת חיישן הטמפרטורה ממוקמות, ואת המיקום של העוברים. בקרת הטמפרטורה יכולה להיות מותאמת על ידי העברת חיישן הפיזור מחדש של גופי החימום.

העובר בשלב ריתק אדם מאז תחילת ההיסטוריה. איך המבנה והמורפולוגיה של עובר להתפתח בצורה של זמן ומרחב מוגדר היטב כל כך? העובר החומוס הפך לאחד הדגמים בעלי החיים בעלי חוליות הקלסיים עבור עובר מכמה סיבות: זה זמין בקלות, זול, שקוף בשלביה הראשונים, ונגיש מניפולציות ניסיון, כפי שהוא מתפתח מחוץ אמא. יתר על כן, יש לו גיאומטריה שטוחה כמעט במהלך אירועי המוךפו&quot;גנטי שהולכים מוקדם, כגון לב היווצרות המוח, gastrulation, neurulation, ו somitogenesis 15. ניתן להבין בצורה הטובה ביותר תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולכים אם הם נלמדים באופן דינמי, כגון באמצעות רכישת זמן לשגות תמונות. העובר חומוס ניתן דמיינו ב אובו 16 אבל עם נגישות נמוכה מניפולציות ניסיוני וראות מוגבלת הדמיה מיקרוסקופ אור ההולכה. לכן, לנתקטכניקות אל הוצעו על מנת אובו לשעבר חומוס עוברים תרבות, גם במערכות תרבות חלמון כולה 13,17 - 19 או תרבויות explant 1,20 - 23. במערכות תרבות חלמון כולו, העובר נשאר על גבי החלמון שלם, ואת התוכן כולו של הביצה מועברת למיכל אחר לאינקובטורים. מיכל זה יכול להיות מעטפת ביצית פונדקאית 17, בצלחת פטרי 19, או ערסל עשוי בניילון נצמד 13,18. עוברים בתרבויות חלמון כולו באופן אידיאלי יכול להיות מתורבת עד הבקיעה והם נגישים micromanipulations. שיטות אלה יעילות במיוחד ללימוד פיתוח של עוברים לאחר תחילתו של מחזור הדם (דבר המגדיל את הניגוד), בעוד עוברי הצעיר להישאר קשה לדמיין. עוברי מוקדם אלה יכולים להיות צילמו הכי טוב אם הם נכרת מן החלמון מתורבת כמו explants במבחנה. Explants הם נגישים בקלות עבור הניסוימניפולציות אל ודורשים פחות מקום עבור culturing. במשך שנים רבות, טכניקת החלוץ ידי דניס החדש ב -1955 הווריאציות שלה היו סטנדרטי זהב של שיטות תרבות explant עבור עבר חומוס, ובכך להפוך את העובר נגיש עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות והתערבויות microsurgical 20,21. למרות ההצלחה הגדולה שלו, הטכניקה החדשה היא יחסית תובענית זמן רב. Blastoderm לעתים קרובות מנתק כאשר קרום vitelline, נושאת את blastoderm, נמתח סביב טבעת זכוכית כדי להשיג את המתח הנכון 1. יתר על כן, העובר יכול להיות מתורבת רק עם למעלה בצד הגחון שלה. הנציבות האירופיות התרבות (מוקדם צ&#39;יק), טכניקה חדשה יותר פותחה על ידי צ&#39;פמן Collignon 1, עוקפת את המתיחה של קרום vitelline באמצעות הספק נייר פילטר עם צמצם מרכזי. העיתון המסנן מייחס את קרום vitelline, ובכך שמירת המתח הטבעי שלה, והיא מקיפה את העובר כמו מסגרת תמונה 1.הם עוברים בתרבית על התחתונה אגרה-חלבון, בדרך כלל עם למעלה בצד הגחון שלהם. Culturing כלפי מעלה הגבי נראה אפשרי רק עבור העוברים HH8 15 ומעלה. קבוצות רבות יש להתאים את הספק נייר סינון לצרכים שלהם, כגון על ידי החלפת התחתונה אגר-חלבון עם תמיכה מסיבים תפר כירורגי 24 או קולגן מצופה קרום 25. לעתים קרובות, עוברים תרבותי עם הטכניקה החדשה או עם תרבות EC נחשפים, עם הגב שלהם או משטח הגחון לאוויר כדי להקל דיפוזיה חמצן 1,20. יש תרבויות explant אלה כדי להישמר באווירה humidified כדי למנוע אידוי של המדיום וכדי למנוע את העובר מפני התייבשות. זו מושגת על ידי דוגר את המנה עם תרבות explant בצלחת פטרי גדולה המכילה רקמות לחלחו נייר 1. רכישת זמן לשגות תמונות של עוברים אלה דורש גם את השימוש של חממה אקלים מבוקר סביב המיקרוסקופ כולו או מזגature שבשליטת מיכל עם מכסה מחומם כדי למנוע התעבות של נתיב האור 14. עם זאת, עוברים חומוס יכול גם לפתח לשעבר אובו שקוע לחלוטין במדיום תרבות כמו תרבויות נייר פילטר 25, בסנדוויץ &#39;בין שכבה של שמן מינרלי כבד חלבון ב adaptions של הטכניקה החדשה 2,21, או כמו explants blastoderm מקופל &quot;קורניש בצקי תרבות &quot;23,26, ללא מגע ישיר עם האוויר. כריך נייר פילטר השקוע הוא גרסה חדשה של הטכניקה המובילה נייר סינון. על ידי שילוב של ידע מוקדם על culturing עובר חומוס אובו לשעבר, זה הופך את חממת האקלים מבוקרת ואת המכסה המחומם אפשר לוותר עליהן. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות נייר סינון זהה (בחיתוך ליזר) 24 ותרבותי שקוע לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוטה (Pannett-קומפטון מלוח 27,28 ו חלבון רזה לייחס 3: 2) ב בטמפרטורה המבוקרת מכיליםאה. שכבת שמן מינרלי אור צף על גבי המדיום מונעת 2,21 אידוי וממזער אובדן חום לסביבה. תחתית המכל יש חלון זכוכית, ואת ההתקנה כולה מתבצעת על מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוכה זקוף. התקנה זו מאפשרת רכישת סרטים זמן לשגות brightfield ו darkfield ברזולוציה גבוהה של כ -30 שעות של ההתפתחות העוברית, החל משלב פס פרימיטיבי מוקדם לשלב 28-somite (שווה ערך ל המבורגר המילטון בשלבים 5 עד 16, HH5-16 15). עוברים יכול להיות מתורבת באותה מידה עם למעלה בצד הגחון או הגב שלהם. לכן, עוברים נגישים תצפית ומניפולציה של הגחון (למשל, לב מוקדם 7,8 ו somitogenesis 6) ו הגבי (למשל, בסוף gastrulation 2, סגירת הצינור העצבי 3 - 5, ובתחילת המוח 9 - 13) פיתוח. את p כריך נייר סינון שקועrovides סביבה פשוטה ויציבה עבור המיקרו-כירורגיה, השתלת חרוז, microinjection, להשתקת גנים, ומחקרים electroporation. פוטנציאל הדמיה שלה יכול להיות דחף הרבה יותר על ידי שימוש הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גליון) ויעדים טבילה.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&amp;nbsp;Reference Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&amp;nbsp;laboratory bottles, with caps, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution A&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution B&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-laser, 130&amp;nbsp;W, wavelength 10.6&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipette Controller</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Serological plastic pipettes, 25&amp;nbsp;ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Plastic document sleeves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue culture dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stainless steel rings, custom-made&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&amp;nbsp;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS Number&amp;nbsp;8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Agar bottoms for EC culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microbead implantation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &amp;micro;m beads were used)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30&amp;nbsp;mm</td><td>SEIRIN</td><td>&amp;nbsp;type J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature controlled beaker&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#039;s and Thermistors MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscope setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&amp;nbsp;mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Rotary Control MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transillumination top 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Insert plate S, glass 237x157x3&amp;nbsp;mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controller EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>System Control Panel SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&quot;</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>not available anymore</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN module Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/ Positions</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Module Experiment Designer</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>not available anymore</td></tr></tbody></table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

בשל זמינותו, בעלות נמוכה, גיאומטריה שטוחה, ושקיפות, לשעבר אובו עובר אפרוח הפכה מודל בעלי חיים בעלי חוליות גדול לחקר אירועי המוךפו&quot;גנטי שהולכים, כגון gastrulation 2, neurulation 3 - 5, somitogenesis 6, לב כיפוף 7, היווצרות 8, והמוח 9 - 13, במהלך העובר מוקדם. מפתח להבנת תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך הוא לעקוב אחריהם באופן דינמי על ידי זמן לשגות הדמיה. רכישת זמן לשגות סרטים של אובו לשעבר חומוס העובר הוגבלה או חלונות זמן קצרות או על הצורך באינקובטור לשלוט בטמפרטורה ולחה סביב העובר 14. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה כדי חומוס התרבות עוברת אובו לשעבר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. כריך נייר פילטר השקוע הנו נגזר של techn נייר המוביל והמבוסס המסנןique (תרבות EC) 1 ומאפשר של עוברים חומוס ללא צורך בתא האקלים. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות בנייר זהה מסנן והוא כל זמן שקוע לחלוטין בתווך פשוט, בקרת טמפרטורה מכוסית בשכבה של שמן מינרלי אור. החל משלב פס פרימיטיבי (המבורגר, המילטון בשלב 5, HH5) 15 עד לפחות בשלב 28-somite (HH16) 15, עוברים יכול להיות מתורבת עם עד משני הצדדים הגחון או הגב שלהם. זה מאפשר רכישת זמן לשגות סרטים ומכסים כ 30 שעות של התפתחות עוברית. מסגרות זמן לשגות סרטים נציג מוצגים. עובר מושווים מורפולוגית לעובר בתרבית EC-התרבות הסטנדרטית. כריך נייר פילטר השקוע מספק סביבה יציבה ללמוד הגבו מוקדם ותהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולכים גחון. זה גם מאפשר דימות פלואורסצנטי חיים micromanipulations, כגון המיקרו-כירורגיה, שד חרוזlantation, microinjection, להשתקת גנים, ואת electroporation, ויש לו פוטנציאל חזק כדי להיות משולב עם מטרות טבילה הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גיליון).

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.2K Views.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling.  In addition, it allows for molecular perturbations of several types, including placement of protein-coated beads and introduction of plasmid DNA using in ovo electroporation.  These experiments have yielded important data on the development of the central and peripheral nervous systems.  For many of these studies, it is necessary to open the eggshell and reclose it without perturbing the embryo's growth.  The embryo can be examined at successive developmental stages by re-opening the eggshell.  While there are several excellent methods for opening chicken eggs, in this article we demonstrate one method that has been optimized for long survival times.  In this method, the egg rests on its side and a small window is cut in the shell.  After the experimental procedure, the shell is used to cover the egg for the duration of its development.  Clear plastic tape overlying the eggshell protects the embryo and helps retain hydration during the remainder of the incubation period.  This method has been used beginning at two days of incubation and has allowed survival through mature embryonic ages.

The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling. In this article we demonstrate one egg preparation method that has been optimized for long survival times.

עוף Windowing ביצים למחקרים התפתחותיים

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Biology

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis is becoming increasingly recognized. In particular, the embryonic chick heart and brain tube, which undergo drastic morphological changes as they develop, are among the prime candidates to study the role of physical forces in morphogenesis. Progressive ventral bending&#160;and rightward torsion of the tubular embryonic chick brain happen at the earliest stage of organ-level left-right asymmetry in chick embryonic development. The vitelline membrane (VM) constrains the dorsal side of the embryo and has been implicated in providing the force necessary to induce torsion of the developing brain. Here we present a combination of new ex-ovo experiments and physical modeling to identify the mechanics of brain torsion. At Hamburger-Hamilton stage 11, embryos are harvested and cultured ex ovo (in media). The VM is subsequently removed using a pulled capillary tube. By controlling the level of the fluid and subjecting the embryo to a fluid-air interface, the fluid surface tension of the media can be used to replace the mechanical role of the VM. Microsurgery experiments were also performed to alter the position of the heart to find the resultant change in the chirality of brain torsion. Results from this protocol illustrate the fundamental roles of mechanics in driving morphogenesis.

Here, we present a protocol introducing a set of new ex-ovo experiments and physical modeling approaches for studying the mechanics of morphogenesis during early chick embryonic brain torsion.

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Bioengineering

ניטור אורכי של מכניקת הלוחות העצביים בהתפתחות עוברי אפרוחים

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

מחבר זרקור: מדידה ללא מגע של מכניקת רקמות בעוברי אפרוחים חיים באמצעות מיקרוסקופ ברילואין

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מותאם באופן מיטבי

עוף Windowing ביצים למחקרים התפתחותיים

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח