The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

1.化学物質<ol><li> 500mMのCEPA（144.49グラム/モル）、及び500mMのNaCl（58.44グラム/モル）と500 mMののNaH 2 PO 4・H 2 O（137.99グラム/モル）酸性化（pHの両方からなる溶液の溶液を調製します2.5）超純水又は0.1NのHClです。解決策が明確になるまでボルテックスを用いて混合します。 </li><li>直列5 mMのと50mMのストックを得るために、同じ溶媒中で（10倍）の500mM溶液を希釈します。 </li><li>超純水に、1 - アミノシクロプロパンカルボン酸（101.1グラム/モルACC）の10mM溶液を準備します。 </li><li> -20℃でストック溶液とストアのアリコートをフィルター滅菌します。 </li><li>フィルター滅菌セルラーゼを。 4°Cで保存のアリコート。 </li></ol> 2 - クロロエチルホスホン酸分解2.検証エチレン生成：トリプル応答アッセイ<ol><li>気相法を用いたシロイヌナズナ生態型コロンビアの種子を表面殺菌： 注意：次のステップはトンを生産有酸素塩素ガス。ドラフト内で種子消毒を実施します。 <ol><li>種子消毒用の250ミリリットルのガラスビーカーに対応し、ヒュームフードに置くのに十分な深密閉可能な容器を得ます。 </li><li> A.を追加シロイヌナズナの種子マイクロチューブに、ラックにチューブを配置します。密閉可能な容器に開いたチューブを含むラックを配置します。 注：塩素ガスが低く、種子に浸透することを可能にするのに半分を完全に個々のチューブを埋めないでください。 </li><li>シール可能な容器の中で、市販の漂白剤の100ミリリットルを含む250ミリリットルのビーカーを置きます。慎重に漂白剤に濃HClの3ミリリットルを追加し、すぐにその蓋で容器を密閉。 注意：漂白剤およびHClを表面滅菌種子に作用する毒性塩素ガスを生成するように反応します。 </li><li>換気フードで4時間塩素ガスの存在下で種子をインキュベートします。 注：長い殺菌時間が発芽効率が低下します。 </li><li>滅菌後、Cを許容しますhlorineガスは、次いで、微小遠心管を封止し、少なくとも1時間、ドラフト内で発散します。廃棄する前に、少なくとも24時間換気フードに漂白剤とHClの混合物を残します。 注：滅菌種子をすぐに使用するために室温で保存してもよいです。 </li><li>長期保存のために4℃で種子を保管してください。結露を防止するために、マイクロチューブを開ける前に室温に種子を持参してください。暗闇の中の種子を保管してください。 </li></ol></li><li> 4セクターのペトリ皿（90×15ミリメートル）に寒天プレートを準備します。 <ol><li> A.の成長培地110 mlで調製シロイヌナズナの苗：1×ムラシゲ・スクーグ（MS）基本培地15（4.33グラム/ L）（w / v）のスクロース、0.8％（w / v）の寒天1％を含有します。 NaOHでpHを6にMS培地を調整します。 </li><li> CEPA分解のための細菌増殖培地の100ミリリットルを準備します。シュラムとHestrin（SH）媒体16は、1.5％を含有する寒天（w / v）の。 NaOHでpHを7にSH培地を調整します。 </li><li>オートクレーブ処理とテンペによってメディアを殺菌55℃の水浴中、R。 </li><li> MS寒天を鍛えた後、滅菌フラスコに40ミリリットルを追加します。 A.の陽性対照増殖培地を調製するためにシロイヌナズナの苗は、10μMのACCの最終濃度を得るために、10 mMのACCの40μlのMS寒天40mlのアリコートを補います。 </li><li>セクター化ペトリ皿（ 図1）の適切な象限に培地の5ミリリットルを加え、寒天を固化することができます。三連ですべてのプレートを準備します。 注：CEPAは、後のプロトコルでまで増殖培地に添加されていません。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> 図1：CEPA トリプル応答アッセイのために使用される寒天プレートのセットアップ概略図（陰性対照（A）、陽性対照（B）のための特定の象限、実験プレートを示していますC）。この図は、Augimeriとストラップ9から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="3"><li>階層化A.同期発芽を確認するためのシロイヌナズナの種子： <ol><li>約50 A.を追加MSまたはMS + ACC寒天を含む各象限へのシロイヌナズナの種子。確保種子を均一に苗除去および分析を容易にするために配布されます。 </li><li> 4で暗所で種を含むプレートをインキュベート 3-4日間Cを°。 </li></ol></li><li>細菌の増殖培地上のCEPA（SH）を分解し、トリプル応答アッセイを実行します。 <ol><li>層化した後、2時間蛍光灯に種を公開します。 </li><li>最終CEPA濃度を得るために、SH寒天（ 図1のpH 7）を含む実験的なプレートの象限に500 mMのCEPAストック溶液10μlを広めます1 mMになります。 </li><li>実験用フィルムでプレートをシールし、種子のための暗い環境を作成するためにホイルでカバーしています。 </li><li>寒天側を下にして3日間23℃の暗所でプレートをインキュベートすることにより、種子を発芽。 プレートを積層することができるが、エチレンは空気より軽いので、陰性対照は、底部に配置する必要があります注意してください。 </li></ol></li><li>トリプル応答アッセイデータの分析： <ol><li>火炎滅菌鉗子で、解剖やデジタルUSB顕微鏡下での各治療やビューに対応するプレートから単一の苗を削除します。苗の底整列さをし、写真を確認してください。 </li><li>各象限（生物学的複製あたり60苗と処理当たり180本の苗木）から30本の苗木を削除します。定規と黒の背景と写真で表面に合わせます。 </li><li> ImageJソフトウェア17を使用して複製苗の胚軸長（mm）を測定します。 * *ストレートをクリックしてドラッグすることでスケールを設定します10ミリメートルの長さを選択するためのツール。 「分析」タブの下に &quot;設定スケール」を選択し、* *セグメント化されたツールを使用して10に既知の距離を設定し、クリック＆ドラッグして距離を測定する胚軸とプレスMの長さを選択します。 Tukeyの多重比較検定で一方向ANOVAを使用して、生物学的複製の平均を比較。 p &lt;0.05 の場合には差は有意であると考えています。 </li></ol></li></ol>細菌増殖を通じてのpHの3解析<ol><li>成長し、三連で定量化Komagataeibacter xylinusスターター文化： <ol><li> Kの単一コロニーを接種しますxylinus 0.2％（v / v）のろ過滅菌セルラーゼを補充したSH培地5ml液（pH 5）に変換します。 0.4から0.3のOD 600が （約72時間）に達するまで、150rpmで攪拌しながら30℃で培養をインキュベートします。 </li><li>遠心分離により収穫スターター培養物（2,000×gで、4℃、10分）。無菌の0.85％NAC（w / v）の5mLでL溶液は、細胞を2回洗浄し、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を氷上に保管してください。 </li><li> Petroff-Hausser計数チャンバーを用いて細胞を定量化します。 </li></ol></li><li> pH値の分析のための培養を接種します： <ol><li>箔の蓋付き12 500ミリリットルのフラスコに0.2％（v / v）のフィルター滅菌セルラーゼを補っSHブロス（pHは7）の150ミリリットルを追加します。 K.とのフラスコに接種10 5細胞/ mlの濃度でxylinusスターター培養物。 3スターター培養物を使用して、処理当たり3つの生物学的複製物を準備します。 </li><li>それぞれ5300μlの、50、または500 mMのCEPA原液0.01の最終CEPA濃度を得るために、0.1、および1.0 mMの、と補足培養。 CEPAを溶解するために使用される溶剤の300μlの未処理対照培養物を補足。 </li><li>しっかりフラスコに箔の蓋をテーピングすることにより、フラスコを密封し、150rpmで攪拌しながら30℃で14日間培養をインキュベートします。 </li></ol></li><li>毎日、asepticaLLY（10分; 4℃で2000×gで）遠心分離によって各フラスコ、ペレット細胞から5ミリリットルのサンプルを削除します。きれいなチューブに上清を移し、pHメーターを使用して、各生物学的複製のpHを測定します。 </li><li>生物学的複製の平均pH値をグラフによって経時的データを分析します。 注：培養pHが3.5以下に低下しないことが重要です。 5の培養pHは大幅にCEPAからのエチレン放出を減少させ、そして3.5以下のpHは完全にエチレン放出を阻害します。 </li><li> 、塩素及びリン酸のレベルをコントロール0.01、0.1を使用して同一の実験を行い、それぞれ、5、50、および500 mMのストックを使用してのNaCl-のNaH 2 PO 4溶液の1.0 mmまで。 </li></ol> 4.コロニー形態<ol><li> K.を育てます三重でxylinusスターター培養物： <ol><li> Kの単一コロニーを接種しますxylinus 0.2％（v / v）のろ過滅菌セルラーゼを補充したSH培地5ml液（pH 5）に変換します。 Incuba0.4から0.3のOD 600まで150rpmで撹拌しながら30℃でのテ培養物を（約72時間）に達します。 </li><li>遠心分離により収穫スターター培養物（2,000×gで、4℃、10分）。滅菌生理食塩水5mlで、細胞を洗浄した後、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を氷上に保管してください。 </li></ol></li><li> SHの25ミリリットル、1.5％（w / v）の寒天で（pHが7）培地を含む24寒天プレートを準備します。 </li><li>寒天が固化した後は、それぞれ、0.01、0.1、および1.0 mMの最終的なCEPA濃度を得るために、5、50、50μlの、および寒天上で500mMのCEPAの原液を広げます。無修正で構成され、溶媒を50μlの広がりを設定し、未処理、溶媒対照プレートは、試験化合物を溶解するために使用されます。 </li><li> Kのループフル（〜5μl）を有する単離コロニーのためのストリークプレートスターターカルチャーxylinus、パラフィンフィルムでそれらを封印。三連ですべてのプレートを接種します。 30℃で5日間培養します。 </li><li> Phot定性的デジタルUSB顕微鏡を使用し、20X倍率でographコロニーは、固体培地上でコロニーの形態とセルロースの生産を評価します。 注：セルロースは、コロニーのマージンに沿って濁った物質として表示されます。 </li><li> 、塩素及びリン酸のレベルをコントロール0.01、0.1を使用して同一の実験を行い、それぞれ、5、50、および500 mMのストックを使用してのNaCl-のNaH 2 PO 4溶液の1.0 mmまで。 </li></ol> 5.ペリクルアッセイ<ol><li>成長し、定量化K.三重でxylinusスターター培養物： <ol><li>三連では、Kの単一コロニーを接種xylinus 0.2％（v / v）のろ過滅菌セルラーゼを補充したSH培地5ml液（pH 5）に変換します。 0.4から0.3のOD 600が （約72時間）に達するまで、150rpmで攪拌しながら30℃で培養をインキュベートします。 </li><li>遠心分離により収穫スターター培養物（2,000×gで、4℃、10分）。滅菌生理食塩水5mlで、Tを洗います彼細胞を2回、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を氷上に保管してください。 </li><li> Petroff-Hausser計数チャンバーを用いて細胞を定量化します。 </li></ol></li><li> 24ウェルプレートに接種し、マスターミックスを準備します。 <ol><li>それぞれ、0.01の最終CEPA濃度を得るために、5の120μlを、50、および500 mMのCEPAの株式とSH培地（pHは7）の60ミリリットルを補足0.1、および1.0 mMの。 CEPAを溶解するために使用される溶剤の120μlのSH培地（pHは7）の別の60ミリリットルを補足。ミックスする渦。 </li><li> 4 14ミリリットルのアリコートにCEPA含有培地の各60ミリリットルを分割します。 10 5細胞/ mlの濃度で、スターター培養物の生物学的反復、14 mlのアリコートのうち3つを接種します。セルロースの生産を防止するために、氷上で細胞とチューブを保管してください。 注：残りの14ミリリットルのアリコートを無菌の対照ウェルのために使用されます。 </li></ol></li><li> 24ウェルプレートに接種します。 <ol><li>生物学的反復の3行を持つ独自のプレートに、各処理をテストし、無菌コントロールの行（ 図2）。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> 図2：ペリクルアッセイおよび分析の株式CEPA補充pHが7 SH培地（60ミリリットル） に使用されるプロトコルを示すフローチャートは、3つの別々の生物学的複製接種および滅菌コントロール（14ミリリットルずつ）のために分注します。これらの培養物を24ウェルプレートに6テクニカルレプリケート（2ml）中に分注し、次いでパラフィンフィルムで封止されています。 30℃で7日間インキュベートした後、ペリクルを回収し、FT-IRにより湿重量、厚み、乾燥重量、および結晶化度を決定することを特徴とする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 14ミリリットルマスターミックスを使用して、EACに2ミリリットルを追加します。滅菌した24ウェルプレートの6ウェルのH。 3つの生物学的複製物および滅菌コントロール（ 図2）のために完了します。各治療のために繰り返します。 </li><li>パラフィンフィルムでシールプレートし、30℃で7日間、静的にインキュベートします。 </li></ol><ol start="4"><li>収穫と測定ペリクル湿重量、厚さ、乾燥重量（セルロース収量）と結晶化度（ 図2）： <ol><li>反対側のペリクルエッジを高め、鉗子で個々のペリクルを除去するために、ペリクルの片側を押し下げます。グリップを保持しつつ、その湿重量を決定するために計量前に、過剰な培地を除去するために、3秒間の新鮮なペーパータオル上に置きます。 </li><li>高解像度デジタルカメラを使用して、サイドから定規と写真に隣接したペリクルを合わせます。 </li><li> ImageJソフトウェア17を使用して、左肩、右肩と各ペリクルの中央にペリクルの厚さを測定します。各生物学的replicatのためのすべての技術的反復の平均電子。 </li><li>個別に6ウェルプレートのウェルにペリクルを移します。細胞を溶解するために20分間、80℃で0.1 N NaOHを12 mlのペリクルを扱います。 </li><li> NaOHを削除し、攪拌しながら24時間超純水で洗浄することによりペリクルを中和します。水ごとに6時間を変更します。 注：ペリクルは、洗浄工程の完了時に白でなければなりません。 </li><li>一定重量になるまで48時間、50℃でシリコンマットとドライにペリクルを置きます。乾燥したら、マットから削除して、バクテリアセルロースの収率を決定するために分析的規模でペリクル重量を測定します。 </li><li> 4,000〜650センチメートルの範囲で赤外分光法（FT-IR）32スキャンを用い、分解能4cm -1フーリエ変換用いてペリクル結晶を分析-1。 1437 / A 895を使用して、結晶化度、CI（IR）を計算します。以前18に記載されているように 、「結晶性バンド」および「非晶質バンド」の吸光度比。 </li></オール&gt; </li><li> 、塩素及びリン酸のレベルをコントロール0.01、0.1を使用して同一の実験を行い、それぞれ、5、50、および500 mMのストックを使用してのNaCl-のNaH 2 PO 4溶液の1.0 mmまで。 </li><li>ペリクルデータを分析します。 <ol><li>ペリクル湿重量と乾燥重量との差を決定することによって、ペリクル水和を計算します。 </li><li>統計分析のために、各生物学的複製のための単一の値を取得するためにすべての技術的反復の値を平均します。 Tukeyの多重比較検定で一方向ANOVAを用いて治療を比較してください。 p &lt;0.05 の場合の違いは重要です。 </li><li>未処理対照の割合としてデータを正規化し、生物学的複製の平均をプロットします。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで説明する方法は、モデル生物、Kを用いて細菌エチレン応答の研究のためのCEPAからエチレンをその場生産に概説しますxylinus。エチレンは、CEPAは、純粋なエチレンガスや特殊な実験装置の必要性を否定すると3.5 10,11よりも高いpHを有する任意の水性媒体を補充することによって製造することができるように、この方法は非常に便利です。この方法は、?...

オレフィン、エチレン（C 2 H 4）それは、石炭ガスランプを使用し、実験室で増殖させたエンドウ苗は、（胚軸）をステムする異常な形態を示したことが観察された場合、最初1901年に植物ホルモンとして発見されたが、より短い厚かったですそして、通常のエンドウの苗に比べて横に曲がりました。表現型は、後に三重反応1,2と呼ばれます。その後の研究は、エチレンが、そのような成長、ストレス応答、果実の成熟と老化3。 シロイヌナズナ 、植物生物学研究のためのモデル生物として多数の発生過程を調節する重要な植物ホルモンは、十分にエチレンへの対応に関して検討されているであることを実証しました。いくつかのエチレン応答変異体は暗成長A.で観察されたトリプル応答表現型を利用することによって単離されていますエチレン1,4,5の存在下でのシロイヌナズナの苗。植物におけるエチレン生産のための生合成前駆体は、1-Aでありますminocyclopropaneカルボン酸（ACC）6、一般三重応答表現型1,4,5を導く内因性エチレン産生を増加させるためにトリプル応答アッセイ中に使用されます。 エチレン応答は、広く植物で研究されていますが、細菌上の外因性エチレンの影響は非常に植物と細菌の密接な関係にもかかわらず、understudiedされます。ある研究では、特定のシュードモナス株は炭素とエネルギー7の唯一の供給源としてエチレンを使用して生き残ることができることを報告しました。しかし、2つだけの研究では、細菌は、エチレンに応答することを実証しました。最初の研究は、 緑膿菌 、Pの株フルオレッセンス 、P.プチダ 、およびP. syringaeの溶融アガロース純エチレンガス8で平衡化し、走化性緩衝液と混合したアガロースプラグアッセイを使用してエチレンに向かって走化性ました。しかし、我々の知る限り、何のフュルトはなされていません特殊な装置なしに実験室でガスを扱う困難に可能性の高い細菌のエチレン応答を、特徴付けるために純粋なエチレンガスを使用して、えーレポート。細菌のエチレン応答の第二の報告書は、エチレンが9 xylinusフルーツ関連細菌、Komagataeibacter（旧グルコン ）にバクテリアセルロースの生産と影響を受けた遺伝子の発現を増加させたことを実証しました。この場合には、エチレン放出化合物は、2-クロロエチルホスホン酸（CEPA）は、純粋なエチレンガスまたは特殊な装置の必要性を迂回し、細菌増殖培地内でその場でエチレンを製造するために使用しました。 14 -塩基触媒、一次反応12を介してpHが3.5 10,11上記モル比1：CEPAは1でエチレンを生成します。 CEPAの劣化を確実にpHおよび温度13,14およびエチルの製造における結果と相関していますエン、塩化物およびリン酸。 CEPAは、ガス状のエチレンへの便利な代替手段でエチレンに対する細菌の応答を研究に興味を持って研究者に提供します。 次のプロトコルの全体的な目標は、CEPA分解を確実にするために、細菌のエチレン応答を研究するための簡単かつ効率的な方法を提供し、細菌増殖培地中CEPA分解からエチレン生産の生理的に適切なレベルの検証を含む、培養pHを分析する時に損なわれません細菌の増殖、および細菌の形態および表現型に対するエチレンの影響の評価。我々は、Kを使用して、これらのプロトコルを示しますxylinusは、しかしながら、これらのプロトコルは、適切な増殖培地を使用し、表現型解析することによって、他の細菌におけるエチレン応答を研究するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetic precursor of ethylene in plants</td></tr><tr><td>4-sector Petri dish</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>For testing triple response</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>To solidify medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>For pictures of pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Aqueous solution</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Commercial bleach</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach for seed sterilization</td></tr><tr><td>Concentrated HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Hydrochloric acid for pH adjustment</td></tr><tr><td>Digital USB microscope</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>For pictures of colonies</td></tr><tr><td>Ethephon (&amp;ge;96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylene-releasing compound</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) basal medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana growth medium</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Sodium chloride for saline and control solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Sodium hydroxide for pH adjustment</td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>For sealing plates and flasks</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriological)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Bacterial cell counting chamber</td></tr><tr><td>Polyethersulfone sterilization filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>For sterilizing cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose for MS medium</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

C -トリプル応答アッセイによるSH培地（pHは7）におけるCEPAからのエチレン放出を検証するための模式的なプレートのセットアップを図1Aに示されています。ペリクルプロトコルを示すフロー・チャートは、 図2ダーク成長したAに示されていますシロイヌナズナの苗は、ACCの存在下およびSH培地（pHは7）上ではなく、?...

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Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

細菌でエチレン応答を研究するためのツールとして、エチレン放出化合物、2-クロロエチルホスホン酸を利用します

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K ビュー.  University of Ontario Institute of Technology. The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas. 

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

環境学

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

免疫・感染学

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>DHNAを用いた Lactiplantibacillus plantarum におけるEETのクロノアンペロメトリー解析

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

生化学

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

生物学

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

細菌でエチレン応答を研究するためのツールとして、エチレン放出化合物、2-クロロエチルホスホン酸を利用します

要約

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別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

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使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ