The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

1. Prodotti chimici <ol><li> Preparare una soluzione di 500 mM CEPA (144.49 g / mol), e una soluzione costituita sia 500 mM NaCl (58.44 g / mol) e 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137.99 g / mol) in acidificata (pH 2.5) ultra-acqua pura o 0,1 N HCl. Mescolare con un vortice fino a quando le soluzioni sono chiare. </li><li> In serie diluire (10x) le soluzioni 500 mm nello stesso solvente per ottenere 5 mm e 50 titoli mm. </li><li> Preparare una soluzione di 10 mm 1-aminociclopropano acido carbossilico (ACC; 101.1 g / mol) in acqua ultra-pura. </li><li> Filtro-sterilizzare soluzioni di riserva e aliquote conservare a -20 ° C. </li><li> Filtro-sterilizzare cellulasi. Aliquote Conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Verifica Etilene produzione da 2-Chloroethylphosphonic acido di decomposizione: Triple Assay Risposta <ol><li> Surface-sterilizzare Arabidopsis thaliana Ecotipo Columbia Seeds Uso della fase vapore Metodo: ATTENZIONE: Il passo successivo produce tgas di cloro ossico. Condurre la sterilizzazione seme in una cappa aspirante. <ol><li> Ottenere un contenitore sigillabile profondo abbastanza per ospitare un bicchiere di vetro da 250 ml per la sterilizzazione del seme e metterlo in una cappa aspirante. </li><li> Aggiungere A. thaliana semi in una provetta e posizionare il tubo in un rack. Posizionare il rack che contiene il tubo aperto nel contenitore richiudibile. Nota: Non riempire singoli tubi oltre mezzo pieno per consentire al gas di cloro di penetrare i semi inferiori. </li><li> Inserire un becher da 250 ml contenente 100 ml di candeggina commerciale nel contenitore sigillabile. Aggiungere con cautela 3 ml di HCl concentrato alla candeggina e sigillare immediatamente il contenitore con il suo coperchio. ATTENZIONE: Bleach e HCl reagiscono per produrre gas di cloro tossico che agisce in superficie-sterilizzare i semi. </li><li> Incubare i semi in presenza di cloro gassoso per 4 ore in fumehood. Nota: i tempi di sterilizzazione più lunghi ridurre l&#39;efficienza di germinazione. </li><li> Dopo la sterilizzazione, consentire cgas hlorine per sfogare la cappa per almeno 1 ora poi sigillare la provetta. Lasciare la candeggina e la miscela HCl nel fumehood per almeno 24 ore prima dello smaltimento. Nota: i semi sterilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente per un utilizzo immediato. </li><li> Conservare i semi a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Portare i semi a temperatura ambiente prima di aprire la provetta per evitare la formazione di condensa. semi Conservare al buio. </li></ol></li><li> Preparare piastre di agar a 4-settore Petri Piatti (90 x 15 mm): <ol><li> Preparare 110 ml di terreno di coltura per A. thaliana piantine: 1x Murashige e Skoog (MS) terreno base 15 (4.33 g / L) contenente 1% (w / v) di saccarosio e 0,8% (w / v) di agar. Regolare il supporto MS a pH 6 con NaOH. </li><li> Preparare 100 ml di terreno di coltura batterica di CEPA decomposizione: Schramm e Hestrin (SH) medium 16 contenente 1,5% (w / v) di agar. Regolare il medium SH a pH 7 con NaOH. </li><li> Sterilizzare i media in autoclave e Temper a bagnomaria C 55 °. </li><li> Una volta che l&#39;agar MS ha temprato, aggiungere 40 ml in un pallone sterile. Per preparare il terreno di coltura controllo positivo per A. thaliana piantine, completano l&#39;40 ml aliquota di MS agar con 40 ml di 10 mm secondo per ottenere una concentrazione finale di 10 micron ACC. </li><li> Aggiungere 5 ml di terreno ai quadranti appropriate delle piastre Petri settorizzati (Figura 1) e consentire l&#39;agar solidificare. Preparare tutte le lastre in triplice copia. Nota: CEPA non viene aggiunto al mezzo di crescita fino al più tardi nel protocollo. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Figura 1:. Installazione di piastre di agar utilizzati per il test di risposta tripla con CEPA Uno schema illustra i quadranti specifici per il controllo negativo (A), controllo positivo (B), e piastre sperimentali (C). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> Stratify A. thaliana semi di germinazione Assicurarsi sincrono: <ol><li> Aggiungere circa cinquanta A. semi thaliana viene eseguito su ciascun quadrante contenente MS o MS + ACC agar. Assicurarsi che i semi sono distribuiti in modo uniforme per facilitare la rimozione piantina e l&#39;analisi. </li><li> Incubare le piastre contenenti semi al buio a 4 ° C per 3-4 giorni. </li></ol></li><li> Scomporre CEPA su batterica di crescita a medio (SH) ed eseguire Triple test di risposta: <ol><li> Dopo stratificazione, esporre i semi di luce fluorescente per 2 ore. </li><li> Distribuire 10 ml di soluzione stock di 500 mM CEPA sui quadranti delle piastre sperimentali contenenti SH agar (pH 7; Figura 1) per ottenere una concentrazione finale CEPAdi 1 mM. </li><li> Sigillare i piatti con pellicola di laboratorio e coprire con un foglio per creare un ambiente scuro per i semi. </li><li> Germinare semi incubando le piastre al buio a 23 ° C per 3 giorni con il lato agar giù. Nota: Le piastre possono essere impilati, ma controlli negativi dovrebbero essere collocati sul fondo dal etilene è più leggero dell&#39;aria. </li></ol></li><li> Analizzare Triple Risposta Assay dati: <ol><li> Con una pinza di fiamma sterilizzato, rimuovere singole piantine da una piastra corrispondente ad ogni trattamento e vista sotto un microscopio da dissezione o USB digitale. Assicurarsi che il fondo delle piantine sono allineati e fotografia. </li><li> Rimuovere 30 piantine da ogni quadrante (60 piantine per replica biologica e 180 piantine per il trattamento). Allineare su una superficie con uno sfondo nero e la fotografia con un righello. </li><li> Misurare la lunghezza hypocotyl (mm) di piantine ripetute utilizzando il software ImageJ 17. Impostare la scala facendo clic e trascinando il * diritta *strumento per selezionare una lunghezza di 10 mm. Selezionare &quot;Set Scale&quot; nella scheda &quot;Analizza&quot; e impostare la distanza nota a 10. Utilizzando lo strumento * * segmentato, fare clic e trascinare per selezionare la lunghezza della dell&#39;ipocotilo e premere M per misurare la distanza. Confronta i mezzi di repliche biologiche con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di un Tukey. Le differenze sono ritenuti significativi se p &lt;0.05. </li></ol></li></ol> 3. Analisi del pH durante la crescita batterica <ol><li> Crescere e quantificare Komagataeibacter Culture xylinus Starter in triplice copia: <ol><li> Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore). </li><li> Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml sterile 0,85% (w / v) NaCl soluzione, lavare le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Seminare Culture per l&#39;analisi di pH: <ol><li> Aggiungere 150 ml di brodo SH (pH 7) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione a dodici 500 ml flaconi con coperchi foglio. Seminare palloni con K. colture starter xylinus ad una concentrazione di 10 5 cellule / ml. Utilizzando le tre colture starter, preparare tre repliche biologiche per il trattamento. </li><li> culture integrare con 300 ml di soluzioni madre 5, 50, o 500 mm CEPA per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1 e 1,0 mm, rispettivamente. Supplemento colture di controllo non trattati con 300 ml di solvente usato per sciogliere CEPA. </li><li> Sigillare beute mediante nastratura ermeticamente i coperchi foglio nei flaconi e incubare culture per 14 giorni a 30 ° C con agitazione a 150 rpm. </li></ol></li><li> Ogni giorno, Asepticarimuovere lly 5 ml campioni provenienti da ciascuno cellule pallone e pellet per centrifugazione (2.000 x g, 4 ° C; 10 min). Trasferire surnatanti in una provetta pulita e misurare il pH di ciascun replicato biologica usando un pH-metro. </li><li> Analizzare i dati in tempo portate dalla graficamente il pH media delle repliche biologiche. Nota: È importante che il pH coltura non scenda sotto 3,5; un pH cultura 5 riduce significativamente rilascio etilene da CEPA, e un pH inferiore a 3,5 inibisce completamente il rilascio di etilene. </li><li> Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente. </li></ol> 4. Colony Morfologia <ol><li> Grow K. Culture xylinus Starter in triplice copia: <ol><li> Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. incubaculture te a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore). </li><li> Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare le cellule e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare 24 piastre di agar contenenti 25 ml di SH (pH 7) medie con 1,5% (w / v) di agar. </li><li> Una volta che l&#39;agar è solidificato, diffusa 50 ml di 5, 50, e 500 soluzioni madre mM CEPA su agar per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Impostare placche di comando trattato e del solvente, che consistono di alcuna modifica e la diffusione di 50 ml di solvente usato per sciogliere i composti di prova. </li><li> Piastre di scansione per gli colonie isolate con un ciclo-completo (~ 5 ml) di K. xylinus coltura starter e sigillarli con la pellicola di paraffina. Seminare tutte le lastre in triplice copia. Incubare le piastre per cinque giorni a 30 ° C. </li><li> Photcolonie ograph a 20X di ingrandimento utilizzando un microscopio digitale USB e qualitativamente valutare la morfologia e la cellulosa di produzione coloniale su terreno solido. Nota: Cellulosa appare come sostanza nebuloso lungo il margine della colonia. </li><li> Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente. </li></ol> 5. Pellicle Assays <ol><li> Crescere e quantificare K. Culture xylinus Starter in triplice copia: <ol><li> In triplice copia, inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore). </li><li> Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare tlui le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Preparare Master Mix per inoculare piastre da 24 pozzetti: <ol><li> Supplemento 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di 5, 50, e 500 mM scorte CEPA avere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Supplemento altri 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di solvente usato per sciogliere CEPA. Vortex per miscelare. </li><li> Dividere ogni 60 ml di CEPA contenente mezzo in quattro 14 ml aliquote. Inoculare tre dei 14 ml aliquote con repliche biologiche di coltura starter alla concentrazione di 10 5 cellule / ml. Mantenere i tubi con le cellule in ghiaccio per evitare la produzione di cellulosa. Nota: Il restante 14 ml un&#39;aliquota sarà utilizzato per pozzetti di controllo sterili. </li></ol></li><li> Seminare piastre da 24 pozzetti: <ol><li> Testare ogni trattamento nel proprio piatto con tre file di repliche biologiche euna fila di controlli sterili (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Figura 2:. Flow-chart che illustra il protocollo utilizzato per il saggio pellicola e l&#39;analisi della CEPA supplementato medio SH pH 7 (60 ml) è aliquotati per tre inoculazioni replicati biologica separati e un controllo sterile (14 ml ciascuna). Tali colture sono poi aliquotati in sei repliche tecniche (2 ml) in una piastra ben 24 e quindi sigillati con parafilm. Dopo incubazione per 7 giorni a 30 ° C, pellicole vengono raccolte e caratterizzati determinando peso umido, spessore, peso a secco, e cristallinità dal FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzando il master mix 14 ml, aggiungere 2 ml in each di sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti sterili. Completare per le tre repliche biologiche e controllo sterile (Figura 2). Ripetere l&#39;operazione per ogni trattamento. </li><li> piastre di tenuta con la pellicola di paraffina e incubare staticamente per 7 giorni a 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Raccolta e Misura Pellicle Wet peso, spessore, asciutto Peso (cellulosa Yield) e cristallinità (Figura 2): <ol><li> Premere un lato della pellicola di elevare il bordo pellicle avversaria e rimuovere singole pellicole con una pinza. Pur mantenendo la presa, metterli su un tovagliolo di carta fresca per 3 secondi per rimuovere eccesso di terreno prima della pesatura per determinare il loro peso umido. </li><li> Allineare pellicole adiacenti ad un righello e fotografia dal lato utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione. </li><li> Utilizzando il software ImageJ 17, misurare lo spessore pellicola sulla spalla sinistra, spalla destra e al centro di ogni pellicola. Medio Tutti i replicati tecnici per ogni Replicat biologicae. </li><li> trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di un 6-pozzetti. Trattare pellicole con 12 ml di 0,1 N NaOH a 80 ° C per 20 minuti per lisare le cellule. </li><li> Rimuovere il NaOH e neutralizzare pellicole mediante lavaggio con acqua ultra pura per 24 ore con agitazione. Cambiare l&#39;acqua ogni 6 ore. Nota: pellicole dovrebbero essere bianco al termine della fase di lavaggio. </li><li> Inserire pellicole stuoie silicio e asciutto a 50 ° C per 48 ore fino a peso costante. Una volta asciutto, togliere dal stuoie e misurare pesi pellicle su una bilancia analitica per determinare il rendimento di cellulosa batterica. </li><li> Analizzare pellicola cristallinità mediante trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FT-IR) utilizzando 32 scansioni e una risoluzione di 4 cm -1 nell&#39;intervallo 4000 a 650 cm -1. Calcolare l&#39;indice di cristallinità, CI (IR), utilizzando un 1437 / A 895; il rapporto di assorbanza del &quot;banda cristallina&quot; e &quot;banda amorfa&quot; come descritto in precedenza 18. </li></ol&gt; </li><li> Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente. </li><li> Analizzare Pellicle dati: <ol><li> Calcolare pellicola idratazione determinando la differenza tra pellicola peso umido e il peso secco. </li><li> La media dei valori di tutti i replicati tecniche per ottenere un singolo valore per ciascun replicato biologico per l&#39;analisi statistica. Confronto trattamenti con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di Tukey. Le differenze sono significative se p &lt;0.05. </li><li> Normalizzare i dati come la percentuale dei controlli non trattati e riportare i mezzi di repliche biologiche. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

I metodi qui descritti illustrano la produzione in situ di etilene da CEPA per lo studio della risposta etilene batterica usando l&#39;organismo modello, K. xylinus. Questo metodo è molto utile come etilene può essere prodotto da integrare qualsiasi mezzo acquoso che ha un pH superiore a 3,5 10,11 con CEPA eliminando la necessità di etilene puro o di laboratorio specializzato. Questo metodo non è limitato a studiare gli effetti di etilene CEPA derivato sui batteri, ma può essere anche e...

L&#39;etilene olefina (C 2 H 4) fu scoperto come ormone vegetale nel 1901, quando si è osservato che piantine pisello, coltivate in un laboratorio che utilizza lampade a gas di carbone, mostravano una morfologia anomala in cui steli (ipocotili) erano più corte, più spessa e piegato di lato rispetto ai normali piantine di piselli; un fenotipo in seguito definito il 1,2 risposta tripla. Studi successivi hanno dimostrato che l&#39;etilene è un fitormoni vitale che regola numerosi processi di sviluppo come la crescita, la risposta allo stress, la maturazione dei frutti e senescenza 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modello per la ricerca biologia vegetale, è stato ben studiato per quanto riguarda la sua risposta alla etilene. Mutanti risposta Diversi etilene sono stati isolati sfruttando il fenotipo risposta tripla osservato in dark-grown A. piantine thaliana in presenza di etilene 1,4,5. Il precursore biosintetico per la produzione di etilene in piante è 1-aAcido minocyclopropane carbossilico (ACC) 6 ed è comunemente usato per il test di risposta tripla per aumentare la produzione di etilene endogeno che porta alla tripla 1,4,5 risposta fenotipo. Sebbene la risposta etilene viene ampiamente studiato nelle piante, l&#39;effetto dell&#39;etilene esogeno sui batteri è notevolmente poco studiata nonostante la stretta associazione di batteri con piante. Uno studio ha riportato che alcuni ceppi di Pseudomonas possono sopravvivere con etilene come unica fonte di carbonio e di energia 7. Tuttavia, solo due studi hanno dimostrato che i batteri rispondono all&#39;etilene. Il primo studio ha mostrato che ceppi di Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida e P. syringae erano chemiotattica verso etilene utilizzando un test spina agarosio in cui agarosio fuso è stato mescolato con un buffer chemiotassi equilibrata con gas puro etilene 8. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono stati Furthrapporti er usano gas etilene puro per caratterizzare la risposta di etilene batterica, probabilmente a causa della difficilmente di gestire gas in laboratorio, senza attrezzature specializzate. La seconda relazione di risposta etilene batterica dimostrato che un aumento della produzione di etilene di cellulosa batterica e l&#39;espressione genica influenzato nel batterio frutta-associata, Komagataeibacter (ex Gluconacetobacter) xylinus 9. In questo caso, il composto di etilene-releasing, acido 2-chloroethylphosphonic (CEPA) è stato usato per la produzione di etilene in situ nel mezzo di crescita batterica, bypassando la necessità di etilene puro o attrezzature specializzate. CEPA produce etilene in un rapporto 1: 1 molare sopra pH 3,5 10,11 attraverso un primo ordine di reazione base-catalizzata 12 - 14. La degradazione del CEPA è correlata positivamente con pH e temperatura 13,14 e risultati nella produzione di etilene, cloruro e fosfato. CEPA fornisce ai ricercatori interessati a studiare le risposte batterici di etilene con una comoda alternativa per l&#39;etilene gassoso. L&#39;obiettivo generale dei seguenti protocolli è di fornire un metodo semplice ed efficace per studiare la risposta di etilene batterica e comprende la convalida dei livelli fisiologicamente rilevanti di produzione di etilene da CEPA decomposizione in mezzo di crescita batterica, analisi di pH cultura per assicurare CEPA decomposizione non è compromessa durante crescita batterica, e la valutazione degli effetti dell&#39;etilene sulla morfologia batterica e fenotipo. Dimostriamo questi protocolli che utilizzano K. xylinus, tuttavia, questi protocolli può essere adattato per studiare la risposta di etilene in altri batteri utilizzando il terreno di coltura appropriato e analisi fenotipo.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetic precursor of ethylene in plants</td></tr><tr><td>4-sector Petri dish</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>For testing triple response</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>To solidify medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>For pictures of pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Aqueous solution</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Commercial bleach</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach for seed sterilization</td></tr><tr><td>Concentrated HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Hydrochloric acid for pH adjustment</td></tr><tr><td>Digital USB microscope</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>For pictures of colonies</td></tr><tr><td>Ethephon (&amp;ge;96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylene-releasing compound</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) basal medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana growth medium</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Sodium chloride for saline and control solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Sodium hydroxide for pH adjustment</td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>For sealing plates and flasks</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriological)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Bacterial cell counting chamber</td></tr><tr><td>Polyethersulfone sterilization filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>For sterilizing cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose for MS medium</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Una configurazione schematica piatto per la verifica dell&#39;etilene liberazione dal CEPA in terreno SH (pH 7) con il test triplice risposta è illustrato in Figura 1A - C. Un diagramma di flusso illustrante il protocollo pellicola è mostrato in Figura 2. Dark-grown A. thaliana piantine mostrano il fenotipo triplice risposta (hypocotyl più breve e più spesso di un gancio apicale esagerata) in presenza di ACC e in presenza di...

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Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.8K Views.  University of Ontario Institute of Technology. The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas. 

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

Aderenza dei batteri per piantare superfici misurate in laboratorio

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Ricerca

Ambiente

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Immunologia e infezioni

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

L&#39;utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Peptidi antimicrobici prodotte dalla pressione selettiva incorporazione di aminoacidi Non canonico

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Analisi cronoamperometrica dell'EET in Lactiplantibacillus plantarum con DHNA

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camer

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Biochimica

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Biologia

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Aderenza dei batteri per piantare superfici misurate in laboratorio

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il

L'utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

Peptidi antimicrobici prodotte dalla pressione selettiva incorporazione di aminoacidi Non canonico

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana

Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti