The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

1. Kimyasallar <ol><li> 500 mM NaH 2 PO 4 · asitleştirildi içinde H2O (137,99 g / Mol) (pH 500 mM CEPA (144.49 gr / mol) ihtiva eden bir çözelti, ve her ikisi de, 500 mM NaCI (58.44 g / mol) &#39;den oluşan bir çözelti hazırlamak 2.5) ultra saf su ve 0.1 N HCI. çözümler açıktır kadar vorteks ile karıştırın. </li><li> Seri olarak 5 mM ve 50 mM stok elde etmek için aynı çözücü (10 x) 500 mM seyreltik çözeltiler. </li><li> Ultra saf su içinde 1-aminosiklopropan karboksilik asit (101.1 g / mol ACC) içindeki bir 10 mM çözelti hazırlayın. </li><li> -Filtre sterilize -20 ° C&#39;de stok çözümleri ve mağaza alikotları. </li><li> Filtre sterilize selülaz. 4 ° C&#39;de saklayın alikotları. </li></ol> 2-chloroethylphosphonic acid Ayrışma 2. doğrulanıyor Etilen Üretimi: Üçlü Tepki Testi <ol><li> Buhar fazlı Yöntemiyle Ekotip Columbia tohumları thaliana Arabidopsis Yüzey sterilize: DİKKAT: Aşağıdaki adımı t üretiroksik klor gazı. Davlumbaz tohum sterilizasyon kuralları. <ol><li> Tohum sterilizasyon için 250 ml cam beher karşılamak ve davlumbaz yerleştirmek yeterince derin bir yapışmalı kabı alın. </li><li> A. ekle thaliana bir mikrosantrifüj tüp tohum ve rafa tüp yerleştirin. yapışmalı kabın içine açık tüp içeren raf yerleştirin. Not: klor gazı daha düşük tohum nüfuz sağlamak için yarısı dolu üzerinde bireysel tüpleri doldurmak etmeyin. </li><li> sızdırmaz kapta ticari ağartıcı, 100 ml içeren 250 ml&#39;lik bir beher yerleştirin. Dikkatle ağartıcıya konsantre HCI 3 ml ilave edilir ve derhal kapaklı konteyner mühür. DİKKAT: Ağartıcı ve HCl tohumları, yüzey sterilize edilmesi işlevini görürler toksik klorin gazı üretmek için reaksiyona girer. </li><li> fumehood 4 saat boyunca klor gazı varlığında tohumları inkübe edin. Not: Daha uzun sterilizasyon süreleri çimlenme etkinliğini azaltacaktır. </li><li> Sterilizasyon sonrasında, c izinhlorine gaz daha sonra en az 1 saat süre ile duman davlumbazında havalandırma mikrosantrifüj tüpü mühür. atılmadan önce en az 24 saat boyunca fumehood çamaşır suyu ve HCl karışımı bırakın. Not: Sterilize edilmiş tohumlara, acil kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C &#39;de tohum tutun. yoğunlaşmayı önlemek için ependorf tüp açmadan önce oda sıcaklığına kadar tohum getirin. karanlıkta saklayın tohumları. </li></ol></li><li> 4-sektör Petri Yemekleri (90 x 15 mm) Agar Plakaları hazırlayın: <ol><li> A. büyüme ortamı 110 ml hazırlanması thaliana fidanları: 1 x Murashige ve% 1 ihtiva eden Skoog (MS) bazal ortam 15 (4.33 gr / lt) (ağ / hac) sakroz ve% 0.8 (ağ / hac) ağar. NaOH ile pH 6&#39;ya MS ortamı ayarlayın. </li><li> CEPA&#39;nın ayrışma bakteriyel büyüme ortamı 100 ml hazırlayın: Schramm ve Hestrin 16% 1.5 ihtiva eden (SH) ortamı (ağırlık / hacim) ağar. NaOH ile pH 7&#39;ye SH ortamı ayarlayın. </li><li> otoklav ve tempe tarafından medya sterilize55 ° C su banyosu içinde R. </li><li> MS agar katkılı sonra, steril bir şişeye 40 mi ekleyin. A. pozitif kontrol büyüme ortamı hazırlamak için thaliana fideler, 10 uM ACC bir son konsantrasyon elde etmek üzere, 10 mM ACC 40 ul MS agar 40 ml kısım tamamlar. </li><li> Sektörlü Petri kapları (Şekil 1), uygun kadran ortamın 5 ml ilave edilir ve Ağarı katılaştırmak için bir olanak sağlar. üç nüsha olarak tüm tabak hazırlayın. Not: CEPA sonra protokolde kadar büyüme ortamına ilave edilmez. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Şekil 1:. CEPA üçlü müdahale analizi için kullanılan agar plakaları Kur şematik (negatif kontrol (A), pozitif kontrol (B) belirli bir kadran ve deney plakaları görüntülemektedirC). Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> Tabakalandırmak A. thaliana Tohumlar Senkron Çimlenme sağlamak için: <ol><li> Yaklaşık elli A. ekle MS veya MS + ACC agar içeren her kadranda üzerine thaliana tohumları. Emin olun tohumlar eşit fide çıkarılmasını ve analizi kolaylaştırmak için dağıtılır. </li><li> Plakalar 4 ° C&#39;de karanlıkta tohumlarının inkübe 3-4 gün ° C. </li></ol></li><li> Üçlü Tepki Testi Bakteriyel Büyüme Medium üzerinde CEPA (SH) ayrıştırmak ve uygulayın: <ol><li> tabakalaşma sonra, 2 saat boyunca floresan ışık tohumları maruz. </li><li> SH agar içeren deney levhaları çeyrek üzerine 500 mM İEKB stok çözeltisinin 10 ul yay (pH 7, Şekil 1) bir son konsantrasyon elde etmek için CEPA&#39;nın1 mM. </li><li> laboratuvar film ile plakaları mühür ve tohum için karanlık bir ortam yaratmak için folyo ile kaplayın. </li><li> Aşağı agar yüzü 3 gün boyunca 23 ° C&#39;de karanlıkta plakaları inkübe edilerek de tohumlar çimlenmeye. Not: Tabaklar yığılmış olabilir, ancak etilen havadan daha hafif olduğu için negatif kontroller altına konulmalıdır. </li></ol></li><li> Üçlü Tepki Testi Verileri Analiz: <ol><li> Alev sterilize forseps ile, bir diseksiyon veya dijital USB mikroskop altında her tedavi ve görünümüne tekabül eden bir plakadan tek fidan kaldırın. fide alt hizalanmış ve fotoğrafı emin olun. </li><li> Her kadranda 30 fideleri (biyolojik çoğaltmak başına 60 fide ve tedavi başına 180 fidan) çıkarın. bir cetvel ile siyah bir arka plan ve fotoğraf ile bir yüzey üzerinde aynı hizaya getirin. </li><li> ImageJ yazılımı 17 kullanarak çoğaltmak fidelerin hipokotil uzunluğu (mm) ölçün. tıklayıp * düz sürükleyerek ölçeği ayarlama *aracı 10 mm uzunluğunda seçin. &quot;Analiz&quot; sekmesi altında &quot;Set Ölçeği&quot; i seçin ve * Parçalı aracını kullanarak 10&#39;a bilinen mesafeyi ayarlamak, tıklayın ve sürükleyin mesafeyi ölçmek için hipokotil ve basın M uzunluğunu seçmek için kullanılır. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA kullanılarak biyolojik çoğaltır araçlarını karşılaştır. Farklılıklar &lt;0.05 anlamlı eğer p olarak kabul edilir. </li></ol></li></ol> Bakteriyel Büyüme boyunca pH 3. Analiz <ol><li> Üç nüsha olarak xylinus Starter Kültürler büyümek ve Ölçmek Komagataeibacter: <ol><li> K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, 0.3, 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de kültürler inkübe edin. </li><li> santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). 5 ml steril% 0.85 ile NAC (w / v)l Çözelti hücreler iki kez yıkama ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek. </li></ol></li><li> pH Analiz için Kültürleri aşılamak: <ol><li> folyo kapak ile on iki adet 500 ml&#39;lik şişelere% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH suyu (pH 7), 150 ml ilave edilir. K. ile şişeler aşılamak 10 5 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda xylinus başlangıç kültürleri. Üç starter kültür kullanılarak, tedavi başına üç biyolojik çoğaltır hazırlamak. </li><li> 5, 50 veya 500 mM İEKB stok çözeltileri 300 ul Ek kültürleri, sırasıyla, 1.0 mM, 0.01, 0.1 nihai CEPA konsantrasyonlar elde, ve. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 300 ul muamele edilmemiş kontrol kültürleri Supplement. </li><li> sıkı şişelere folyo kapak bantlayarak şişeler kapatılır ve 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de 14 gün boyunca kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> Her gün, aseptically (10 dakika;, 4 ° C 2,000 x g) santrifüj ile, her şişe ve topak hücrelerinden 5 mi örnek alabilir. temiz bir tüpe süpernatantlar aktarın ve bir pH ölçer kullanılarak her bir biyolojik tekrarında pH&#39;ı ölçülür. </li><li> biyolojik çoğaltır ortalama pH değeri grafik ile zaman ders verileri analiz edin. Not: kültür pH 3.5&#39;in altında düşmemesine önemlidir; 5 bir kültür pH değerinin önemli ölçüde CEPA etilen salınımını azaltan ve 3.5&#39;in altında bir pH değeri, tamamen etilen salınımını inhibe eder. </li><li> , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm&#39;dir. </li></ol> 4. Koloni Morfolojisi <ol><li> K. büyümek üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri: <ol><li> K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. doğmuş iyileşmesini0.4, 0.3 OD 600 kadar, 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de te kültürleri (yaklaşık 72 saat) ulaşılır. </li><li> santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml hücre, yıkama ve daha sonra hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> % 1.5 SH 25 ml içeren 24 agar plakaları (pH 7) orta hazırlayın (a / h) agar. </li><li> Agar katılaşmış sonra, sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 50 ul ve agar üzerinde, 500 mM CEPA stok solüsyonları yayıldı. herhangi bir değişiklik meydana ve çözücünün 50 ul yayılan ayarlama muamele edilmemiş ve çözücü kontrol plakaları, test bileşiklerini çözmek için kullanılan. </li><li> K. bir döngü dolu (~ 5 ul) ile izole edilmiş koloniler için şerit tabakalar xylinus starter kültür ve parafin film ile onları mühür. üç nüsha olarak tüm plakaları aşılamak. 30 ° C&#39;de beş gün süreyle inkübe edin. </li><li> fotniteliksel bir dijital USB mikroskop kullanarak ve 20X büyütmede ograph koloniler katı ortam üzerinde koloni morfolojisi ve selüloz üretimi değerlendirmek. Not: Selüloz koloni kenarı boyunca puslu bir madde olarak görünür. </li><li> , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm&#39;dir. </li></ol> 5. zar Tahliller <ol><li> Büyümek ve Ölçmek K. üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri: <ol><li> Üç nüsha olarak, K. tek bir koloni aşılamak xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, 0.3, 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de kültürler inkübe edin. </li><li> santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml, t yıkamao hücreler iki kez ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek. </li></ol></li><li> 24 oyuklu plakaların aşılanması için ana karışımlarını hazırlamak: <ol><li> sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 120 ul ve 500 mM İEHB stokları SH ortamı 60 ml (pH 7) Supplement. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 120 ul SH ortamı (pH 7) arasında bir 60 ml Supplement. Vortex karıştırın. </li><li> dört adet 14 ml&#39;lik miktarlar halinde İEHB içeren bir maddenin her birinden 60 ml bölün. 10 5 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda başlatıcı kültür biyolojik çoğaltır 14 ml alikotlar üç inoküle. selüloz üretimi önlemek için buz üzerinde hücreleri ile tüpler tutun. Not: Geri kalan 14 ml bir örnek steril kontrol kuyuları için kullanılacaktır. </li></ol></li><li> 24 oyuklu plakaların aşılanması: <ol><li> Üç biyolojik çoğaltır satır ve kendi plaka her tedaviyi testSteril kontrollerin bir satır (Şekil 2). </li></ol></li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Şekil 2:. Zar tahlilinde ve analiz Hazır İEHB-desteklenmiş, pH 7 SH ortamı (60 mi) için kullanılan protokol gösteren bir akış şemasıdır, üç ayrı biyolojik suret aşılamalar ve steril bir kontrol (14 mL) ekstrakte edildi için örnek olarak alındı. Bu kültürler daha sonra bir 24 yuvalı plaka içine altı teknik çoğaltır (2 mi) içine bölüştürülmüştür ve parafın bir film ile kaplanmıştır. 30 ° C&#39;de 7 gün beklettikten sonra, zarlarına hasat edilir ve FT-IR ile ıslak ağırlık, kalınlık, kuru ağırlığı, ve kristal belirlenmesi ile karakterize. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 14 ml ana karışımı kullanarak, EAC içine 2 ml ekleyinsteril 24 oyuklu plaka altı kuyu H. Üç biyolojik çoğaltır ve steril kontrol (Şekil 2) için tamamlayın. Her tedavi için tekrarlayın. </li><li> parafın film kapatma plakaları ve 30 ° C &#39;de 7 gün süre ile, statik inkübe edin. </li></ol><ol start="4"><li> Hasat ve Tedbir pelikül Islak Ağırlığı, Kalınlığı, kuru Ağırlık (Selüloz Verim) ve kristal yapıdaki (Şekil 2): <ol><li> Rakip zar kenarı yükseltmek ve forseps ile bireysel zarlarına kaldırmak için ince tabakanın bir tarafını basınız. kavrama koruyarak, kendi ıslak ağırlıkları belirlemek için tartım önce aşırı orta kaldırmak için 3 sn taze kağıt havlu üzerine koyun. </li><li> yüksek çözünürlüklü bir dijital kamerayı kullanarak taraftan bir cetvel ve fotoğraf bitişik zarlarına hizalayın. </li><li> ImageJ yazılımı kullanma 17, sol omuz, sağ omuz ve her ince tabakanın ortasına pelikül kalınlığını ölçmek. Her biyolojik RepliCat için tüm teknik çoğaltır ortalamae. </li><li> Ayrı ayrı 6-çukurlu bir plaka gözlerine zarlarına transfer. 20 dakika hücreleri lize etmek için, 80 ° C de, 0.1 N NaOH 12 ml zarlarına tedavi edin. </li><li> NaOH çıkarın ve ajitasyon ile 24 saat boyunca ultra saf su ile yıkanarak zarlarına nötralize eder. suya her 6 saat değiştirin. Not: ince zarlar yıkama aşamasının tamamlanması üzerine beyaz olmalıdır. </li><li> Talep silikon tabakaları üzerindeki ince zarlar ve sabit bir ağırlığa kadar 48 saat boyunca 50 ° C&#39;de kurutulur. Kuru kez, bakteriyel selüloz verimi belirlemek için analitik bir ölçekte pelikül ağırlıkları paspaslar kaldırmak ve ölçün. </li><li> 4.000 650 cm aralığında kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) 32 taramaları kullanılarak ve 4 sm bir çözünürlük -1 Fourier dönüşümü kullanılarak ince tabaka kristal analiz -1. A 1437 / A 895 kullanarak, kristallik endeksi, CI (IR) hesaplayın; &quot;kristal bant&quot; ve &quot;amorf band&quot; absorbansı oranı daha önce 18 nitelendirdi. </li></ol&gt; </li><li> , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm&#39;dir. </li><li> Zar Verileri Analiz: <ol><li> zar ıslak ağırlığı ve kuru ağırlığı arasındaki farkı belirleyerek pelikül hidrasyon hesaplayın. </li><li> İstatistiksel analiz için her bir biyolojik çoğaltmak için tek bir değer elde etmek için tüm teknik çoğaltır değerlerinin ortalamasını alın. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA ile tedavi karşılaştır. Farklılıklar p eğer &lt;0.05 anlamlı bulunmaktadır. </li><li> Tedavi edilmeyen kontrollerin yüzdesi olarak veri normalleştirmek ve biyolojik çoğaltır araçları arsa. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Guzm&#225;n, P., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+triple+response+of+Arabidopsis+to+identify+ethylene-related+mutants.">Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants.</a> Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).</li><li>Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+research+on+the+plant+hormone+ethylene.">History of research on the plant hormone ethylene.</a> J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).</li><li>Schaller, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+and+the+regulation+of+plant+development.">Ethylene and the regulation of plant development.</a> BMC Biol. 10 (1), (2012).</li><li>Hua, J., Sakai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EIN4+and+ERS2+are+members+of+the+putative+ethylene+receptor+gene+family+in+Arabidopsis.">EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).</li><li>Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insensitivity+to+ethylene+conferred+by+a+dominant+Mutation+in+Arabidopsis+thaliana.">Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana.</a> Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).</li><li>Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tomato+gene+for+the+ethylene-forming+enzyme+by+expression+in+yeast.">Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).</li><li>Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ethylene+removal+with+Pseudomonas+strains.">Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains.</a> J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).</li><li>Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+chemotaxis+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+other+Pseudomonas+species.">Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species.</a> Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).</li><li>Augimeri, R. V., Strap, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phytohormone+ethylene+enhances+bacterial+cellulose+production,+regulates+CRP/FNRKx+transcription+and+causes+differential+gene+expression+within+the+cellulose+synthesis+operon+of+Komagataeibacter+(Gluconacetobacter)+xylinus+ATCC+53582.">The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582.</a> Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).</li><li>Zhang, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ethylene+gas+and+comparison+of+ethylene+responses+induced+by+ethylene,+ACC,+and+ethephon.">Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).</li><li>Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+preparation+and+its+application+to+physiological+experiments.">Ethylene preparation and its application to physiological experiments.</a> Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).</li><li>Warner, H. L., Leopold, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+evolution+from+2-chloroethylphosphonic+acid.">Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).</li><li>Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid+in+aqueous+solution.">Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution.</a> Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).</li><li>Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+water+vapor+pressure+on+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid.">Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Schramm, M., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+production+of+cellulose+at+the+air/liquid+interface+of+a+culture+of+Acetobacter+xylinum.">Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum.</a> J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+cellulose-structure+and+characterization.">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tarif edilen yöntemler modeli organizma, K. kullanılarak bakteriyel etilen tepkisinin incelenmesi için CEPA etilenin in situ üretimini anahat xylinus. Etilen bir pH&#39;a CEPA saf etilen gazı veya özel laboratuar ekipmanı ihtiyacını ortadan sahip daha büyük 3.5 10,11 sahip herhangi bir sulu ortam ilave üretilebilir Bu yöntem çok yararlıdır. Bu yöntem, bakterilerin Cepa türetilmiş Etilenin etkilerini incelemek ile sınırlı değildir, aynı zamanda ökaryot...

Olefin (C2 lH 4) havagazı lambaları kullanılan bir laboratuarda yetiştirilir bezelye fide, (hipokotiller) daha kısa olduğu gövde olan bir anormal morfoloji sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir, birinci 1901, bir bitki hormonu olarak tespit edilmiştir, daha kalın ve normal bezelye fide ile karşılaştırıldığında yan bükülmüş; Bir fenotip sonra üçlü cevap 1,2 olarak nitelendirdi. Daha sonraki çalışmalar, etilen gibi büyüme, stres yanıtı, meyve olgunlaşma ve yaşlanma 3. Arabidopsis thaliana, bitki biyolojisi araştırma için bir model organizma olarak çok sayıda gelişimsel süreçleri düzenleyen önemli bir fitohormondur, iyi etilen verdiği yanıtta açısından incelenmiştir olduğunu göstermiştir. Çeşitli etilen tepki mutantlar koyu yetişkin A&#39;da görülen üçlü cevap fenotip istismar ederek izole edilmiştir etilen 1,4,5 mevcudiyetinde thaliana fideleri. bitkilerdeki etilen üretimi için biyosentetik ön-madde 1-a,minocyclopropane karboksilik asit (ACC) 6 ve yaygın olarak üç karşılık fenotipi 1,4,5 neden endojen, etilen üretimini geliştirmek için üçlü cevap deneyi sırasında kullanılır. Etilen yanıtı yaygın bitkilerde çalışılan olmasına rağmen, bakteriler üzerinde eksojen etilen etkisi büyük ölçüde bitkiler ile bakterilerin yakın ilişki rağmen understudied edilir. Bir çalışmada, belirli Pseudomonas suşları karbon ve enerji 7&#39;nin tek kaynağı olarak etilen kullanarak hayatta olduğunu bildirdi. Ancak, yalnızca iki çalışma bakteri etilen yanıt göstermiştir. İlk çalışma göstermiştir ki Pseudomonas aeruginosa, P. suşları fluorescens, P. putida ve P. syringae eriyik agaroz, saf etilen gazı 8 ile dengelenmiş bir kemotaksis tampon maddesi ile karıştırıldı olan bir agaroz tıkayıcı deneyi kullanılarak, etilen bakımından kemotaktik edildi. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir Furth olmuşturSaf etilen gazı kullanılarak er raporları nedeniyle özel ekipman olmadan laboratuvarda gazların sevkinde güçlüğüne muhtemel bakteriyel etilen tepkisini, karakterize etmek. Bakteriyel etilen tepkisinin ikinci rapor etilen 9 xylinus meyve ilişkili bakteri Komagataeibacter (eski Gluconacetobacter) bakteriyel selüloz üretimi ve etkisinde gen ifadesini arttığını gösterdi. Bu durumda, etilen-salan bileşik, 2-chloroethylphosphonic asit (İEKB) saf etilen gazı ve özel ekipman ihtiyaç kalmaz, bakteriyel büyüme ortamında in situ etilen meydana getirmek üzere kullanıldı. - 14, bir baz katalizörlü, birinci dereceden reaksiyon 12 boyunca pH 3.5 10,11 Yukarıdaki: 1 molar oranında İEHB 1 etilen üretir. CEPA bozunması pozitif Etil pH ve sıcaklık 13,14 ve sonuçlar ile ilişkilidiren, klorür ve fosfat. CEPA gaz etilen için uygun bir alternatif etilen bakteriyel yanıtları okuyan ilgilenen araştırmacılar sağlar. Aşağıdaki protokoller genel amacı bakteriyel etilen tepkisini incelemek için basit ve etkili bir yöntem sağlamaktır ve bakteriyel büyüme ortamında CEPA&#39;nın ayrışma etilen üretiminin fizyolojik olarak uygun seviyelerinin doğrulaması içerir, kültür pH analizi CEPA ayrışma sırasında zarar görmemesini sağlamak için bakteri üremesi ve bakteriyel morfoloji ve fenotip üzerindeki etilen etkisi değerlendirilmesi. Biz K. kullanarak bu protokolleri göstermek xylinus, bununla birlikte, bu protokoller uygun büyüme ortamı kullanılarak ve fenotip analizi diğer bakterilerde etilen tepkisini incelemek için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetic precursor of ethylene in plants</td></tr><tr><td>4-sector Petri dish</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>For testing triple response</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>To solidify medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>For pictures of pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Aqueous solution</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Commercial bleach</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach for seed sterilization</td></tr><tr><td>Concentrated HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Hydrochloric acid for pH adjustment</td></tr><tr><td>Digital USB microscope</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>For pictures of colonies</td></tr><tr><td>Ethephon (&amp;ge;96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylene-releasing compound</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) basal medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana growth medium</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Sodium chloride for saline and control solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Sodium hydroxide for pH adjustment</td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>For sealing plates and flasks</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriological)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Bacterial cell counting chamber</td></tr><tr><td>Polyethersulfone sterilization filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>For sterilizing cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose for MS medium</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Üçlü cevap testi ile SH ortamında CEPA etilen kurtuluş (pH 7) doğrulanması için bir şematik plaka kurulum Şekil 1A gösterilmiştir - C. Zar protokolünü gösteren bir akış şeması Şekil 2&#39;de Koyu-yetişkin A. gösterilir thaliana fideler ACC mevcudiyetinde ve SH ortamı Cepa ayrışma yoluyla üretilen etilen (pH 7) varlığında üçlü cevap fenotipi (abartılı apikal kancalı daha kısa ve daha k...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria at JoVE.com

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.8K Görüntüleme.  University of Ontario Institute of Technology. The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas. 

Video: Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Biyokimya

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Biyoloji

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

Toplanması ve analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floem EDTA-kolaylaştırdı Yöntemi eksuda

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Arabidopsis'te Bakteri İstilasına Otomatik Stoma Yanıtı Ölçümü

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Yazar Spotlight: Otomatik Diyafram Ölçümü ile Stoma Araştırmalarını Geliştirme

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Toplanması ve analizi

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için