Name: a model for perineural invasion in head and neck squamous cell carcinoma
Uploaded: 2017-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma at JoVE.com

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.

1.培養培地の調製と料理（10分） <ol><li> 100μLを96ウェルV底プレートのウェルに、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を加えます。 </li><li> 20℃の冷凍庫から半固体マトリックスの約100μLの前等分し、バイアルを取り外し、氷の上に直接配置します。 注：半固体マトリックスは、その後の工程のために必要である、氷の上に液体状態に達するのに約30分かかりますので、この前後根神経節に（DRG）の収穫を行います。すべての回で、氷上で半固体マトリックスを維持するために失敗すると、低品質のマトリックス液滴を発生します。 </li><li>ラベルグラスボトム永久インクでの培養プレート、プレートの下面に四隅のそれぞれに一意の識別子を作成します。プレート表面を冷却するために氷の上にプレートが右サイドを置きます。 注：各マウス利回り32から40 DRGので、1から40にラベルを付けそれはプレチルパイする必要はありませんチルドのヒントは、潜在的に、マトリックス液滴を配置する行列の一貫性の違いを導入するコースを渡って温めますよう、ヒントをペット。 </li></ol>マウスDRGの2解剖（45分） <ol><li>例えばCO 2室と開胸の使用を通じてなど、特定の研究室プロトコル、あたりなどの無胸腺ヌードマウスを安楽死させます。 </li><li>解剖エリアと顕微鏡を設定します。 15-または50-mLコニカルチューブ用ポリスチレン容器の、きれいな滅菌し、平らな底面を使用してください。 注：また、彼らは、使い捨て、安価であるため、解剖面として使用するのに適しており、ピンまたは針を使用して脊柱の固定を可能にします。唯一の滅菌機器や針を使用しています。 </li><li>自然なビジョンの下では、直線状または曲線状の微細なハサミを持つマウスの頭に尾の付け根から背骨に沿って縦切開を行います。 </li><li> SACRの下に横方向に分割する同じハサミを使用してくださいアル背骨。背骨の両側にハサミを使用して頭蓋底までのすべての方法を分析。この時点で、頸椎が頭蓋できるだけハサミで横に切開されていることを確認してください。 </li><li>低電力で手術用顕微鏡下で脊柱の子宮頸終了を確認します。白い脊髄は傍脊柱筋群および軟組織の可変量に囲まれている骨リングの真ん中には明らかです。 </li><li>微視的な春のはさみで3椎体 - 背側または第2の優れた面を分割します。ハサミのバネ作用を使用して、椎体の解剖は正中線で発生したことを確実にするために、この初期の骨のカットを開きます。仙骨に向かって少しずつ続行し、次に椎体の腹側または下面に同一のカットを完了することによって、背骨を二分します。 注：下のDRG収率をもたらす骨脊柱の正中切開を確保するために失敗しました。 </li><li> THIでS点は、脊柱を二等分に分割されています。代わりに脊髄で、脇1ヘミ背骨を置き、滅菌プレートに下向きに。 注：DRGを脊髄に深いような場所に脊髄を残して、乾燥からのDRGを防ぐことができます。 </li><li>ポリスチレン解剖プラットフォーム上の2つの18ゲージの針を他のヘミ背骨の両端を固定します。子宮頸終わりに出発し、穏やか約4椎レベルから脊髄をバック剥離、（背骨が狭いので明らかである、DRGは互いに接近している、とリブ挿入があります）。 </li><li> DRGを接続する感覚神経（通常は2）を確認します。神経がDRGに挿入する領域で、静かに微細な鉗子で周囲の筋膜を把握します。 DRGを解放するために微細な春のはさみでこの筋膜およびその他の神経組織を解剖し、トリム。穏やかな後退は、骨、脊椎内のその位置からDRGをもたらすでしょう。 注：増加この段階で、顕微鏡力が有益です。 DRGへの圧挫損傷は大幅に神経突起の成長を制限します。これは、直接DRGを把握することはありませんすることにより、むしろ周囲の筋膜を把握することにより回避されます。 </li><li> DRGを解放するために微細な春のはさみで（DRGは一般的に解剖ビューに深い相対的なものである1末梢神経を持っている）、末梢神経をカット。 注：それは神経が終了し、DRGはので、この時点でのDRGのできるだけ近くに、このカットを作り、緊張にしながら、始まりが理想的である把握するのが最も簡単です。この遠位枝が切断されると、近位の枝も同様にトリミングされています。 </li><li>微視的な春のハサミでの浮遊神経線維や筋膜の添付ファイルのDRGをトリミング。適切な単離後、96ウェルV底プレート内の室温の培地にDRGを配置します。 注：プレートの下に暗い背景を配置すると、簡単にサブミリメートルホワイトのDRGを可視化することができます。唯一のEAC内の1つのDRGを置きます時間だけでなく、このように、それらは後の工程でより容易に説明することができます。 </li><li>すべての方法1ヘミ背筋がこのプロセスを繰り返し、その後、他の。 40から32を合計20のDRG、 - それぞれの側は、16が得られます。 注：これより少ないたDRGがある場合、脊椎の解剖は、さらに頭または尾を行う必要があります。 DRGを1が尾側に進行するよう、ますますあまり明確になります。 </li></ol>半固体マトリックス液滴の調製（プレートあたり&lt;1分） <ol><li>氷から一方のガラスだけでなく、底板を外し、手術用顕微鏡下に氷のブロックの上に置きます。マトリックスのアリコートは、すべての回で氷の上に残っていることを確認します。 </li><li>よくガラスの端からの液滴自体と少なくとも同じ偉大な距離を残して、2-μLまたは10μLのマイクロピペッターでガラス底板の四隅に行列の1.5-μLの液滴を配置します。 <ol><li>上に直接ピペットの先端を置き45度の角度でガラス。ゆっくりと行列をピペット。行列が板に従事した後、ゆっくりとガラス底部から離れます。 注：行列とガラスとの間の表面張力が完璧な半球を毎回作成する必要があります。 </li><li>行列の液滴への空気の不慮の注入は、行列の液滴の直径がはるかに大きくなり、除去するのが困難であるためである。先端が、空になる直前にピペッティングを停止 注：ピペッティング手を安定させるために秒針を使用して、より正確な配置を容易にします。 </li></ol></li></ol>半固体マトリックス液滴にDRGの4挿入（&lt;プレートあたり2分） <ol><li>簡単に、室温（〜1分）でマトリックス滴でプレートを残します。これはわずかにDRGを正確に配置するのにそれが容易になり、マトリックスを補強します。 </li><li>スクープ（把握していない）DRGそっと左手に閉じられた微細なピンセットで。ここでも、小さなに対して暗い背景、白DRGは、可視化を容易にします。右手に21ゲージの針の先端にDRGを転送します。この転送は鉗子上の残留メディアを残します。 </li><li>静かに21ゲージの針（ 図1）を使用して、マトリックス液滴の中央にDRGを挿入します。ほとんどの時間、DRGを容易にマトリックスに放出され、その後針を中央に配置することができます。 <ol><li> DRGが針に付着した場合、針のオフとマトリックス液滴にDRGをプッシュするために微細な鉗子を使用しています。ラボでの微視的鉗子から余分なメディアをワイプ吸い取ります。 注：行列への紹介メディアは、アッセイの直径、体積、および一貫性が変更されます。色や色の書き込みと氷のブロックは、この繊細なプロセスの可視化を容易に背景のコントラストを、提供します。 </li></ol></li><li>プレートはすべて4のDRGを持っていた後、DRGは、行列滴の中心にあることを確実にするために、最終的な検査を行います。調整を行います21ゲージの針を用いて、必要に応じて。 </li><li> 37℃のインキュベーターに完成したプレートを転送します。これは、半固体マトリックスを固化した位置にDRGを修正します。 </li><li> DRGのすべてについて、この手順を繰り返します。陰性対照としてDRGずにブランクマトリックス液滴を配置します。 </li><li>すべてのプレートを完了し、少なくとも3分間37℃のインキュベーターにそれらを露出させた後、各ガラス底プレートに10％FBS培地を含むDMEMの4 mLを加え。わずかな角度でプレートを置き、ゆっくりと、それは徐々にマトリックス-DRGユニットと接触するように、メディアを追加します。 注：媒体が速すぎるか、積極的に追加された場合、マトリックスおよび/またはDRGは追い出さになることができます。 </li><li> 72時間 - 次の48を37℃のインキュベーター中でアッセイを保管してください。 注：アッセイの定期検査では、行列のエッジ（ 図2）に向けて神経突起の周方向の伸長が表示されます。神経突起は、マトリックスへの道の4分の3よりも大きい場合には、それを細胞をプレーすることが適切です。 </li></ol>頭頸部癌細胞の5準備注：頭頸部扁平上皮癌細胞以外の細胞株は、この実験の設計に使用することができます。 <ol><li> 37℃のインキュベーター中で好ましいフラスコまたは培養皿に10％FBSを含むDMEM中に扁平上皮癌細胞株を維持します。すべての培地培養フラスコまたはディッシュから実験、吸引用の細胞を調製し、PBSで2回それを洗浄します。 10％FBSを含むDMEMに続いて、5分間、0.025％トリプシンを適量添加することにより細胞を懸濁。 6 mLの培養皿への細胞および培地混合物のピペット4ミリリットル。 注：6 mLの培養プレートは十分な細胞でも、50％未満コンフルエント以上のものを提供します。 </li><li>染色およびDRGアッセイにメッキの24時間前に異なる条件にHNSCC細胞株を公開します。再線量細胞は一貫environmeを維持するためにメッキされた後の状態をNT。 注： - マトリックスへのDRGのマウスを解剖し、移植後2日目の細胞培養皿に1抗体、成長因子、サイトカイン、または他の分子を加えます。 </li><li> （ - 3日マトリックスへのDRGの収穫と移植後2）細胞をプレーティングする前に、蛍光細胞の汚れを1時間を追加します。 注：ここで使用される特定の汚れは、細胞膜を自由に通過。しかしながら、細胞内のチオール基と反応した後、染色は、細胞内に留まると娘細胞に受け継がれます。染色は大幅アッセイ内の可視化を容易にします。これらの実験の時間枠である3日、 - 蛍光は2のために存在しているので、これらの一時的な汚れは、これらのアッセイのために理想的です。また、多くの異なる色の使用を可能にし、蛍光タンパク質、トランスフェクトされた細胞株を作成する必要がなくなります。 <ol><li>無血清DMEMの2mLに2μLの10mMストック細胞の汚れを混合することにより、色素溶液の10μMの準備すべてのセルの状態のため。細胞に添加する前に37℃にこれを暖めます。 </li><li>プレートに付着HNSCC細胞を残し、6 mLのプレート内の培地を除去します。 DMEMを各プレートに添加し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の2 mLを加え、10μM細胞染色/無血清2mLのを削除</li><li> 40分間37℃のインキュベーターに細胞染色で6 mLの培養プレートを返します。 </li><li> 40分後、培地を吸引除去します。 PBSの2ミリリットルを追加し、それを吸引除去します。各プレートに0.025％トリプシンの1 mLを加え、37℃のインキュベーターでそれらを交換してください。 </li><li> 3の後に10％FBSを含むDMEMの2mLのを追加 - 5分および15-mLコニカルチューブに懸濁した細胞を移します。細胞をスピンし、10％FBSを含むDMEMを1mLで再懸濁しました。 </li><li>血球計又は自動化細胞カウンターで細胞をカウントし、その後mLの30万の細胞の最終細胞濃度を作成するために、10％FBSを含むDMEMを加えます。 </li></ol></li></ol> 6.メッキヘッドとNECK癌細胞<ol><li>インキュベーターから行列-DRGアッセイとガラス底プレートを取り外します。 注： - 3日神経突起は、一般的に2の後に起こるマトリックスのエッジへの道の少なくとも75％である場合もやはり、それらが適切です。これは最高の、少なくとも10倍の対物レンズを用いて見られています。 </li><li>ガラス底プレート内の培地を吸引除去します。完全によくマトリックス-DRGユニットを取り外すことなく、ガラス内の培地を吸引除去します。 </li><li> 200-μLのピペットを用いて30万細胞/ mL培地の200μLを描画します。各マトリックス-DRGアッセイを介して細胞の2滴を置きます。一方のプレート上の各セルの状態の4反復を作成し、各マトリックス滴に対してこの手順を実行します。 注：行列の半球形状は、細胞が、アッセイ（ 図3a、図3b）の外周に沿ってリングに定住することができます。滑らかなトリガーとピペットを見つけることは、均一の配置ははるかに簡単に低下させます。 </li><li>同様の細胞数およびジを確認します4X顕微鏡下での様々な細胞条件のstribution。 </li><li>約60分間、37℃のインキュベーターにガラス底プレートを置きます。注：細胞および培地（〜150μL）のわずかなボリュームがありますがインキュベータ時間の数時間が経過するまで、アッセイが乾燥しないでください。 </li><li> 60分後、そっとガラス底板の側壁に沿って10％FBSを含むDMEMの4 mLを加え。 注：時間の期間にわたり、細胞が部分的にプレート底部に付着し、そして培地を添加する方法は、細胞に影響を与えません。異なる細胞型は、ガラス底プレートに付着し始めるために、多かれ少なかれ時間がかかるします。 </li><li>前の濃度レベルを維持するために、この時点で、任意の外因性薬剤または成長因子を交換してください。 </li><li>彼らは顕微鏡で検査されている場合を除いて、37℃のインキュベーターにアッセイを返します。顕微鏡イメージングによってこのアッセイの結果を定量化します。簡単に言うと、神経周囲浸潤の鎖を数えます4X顕微鏡画像を使用して、4つの象限インチ 注：4X目的と蛍光機能を備えた顕微鏡は、光文書化アッセイのために適切です。アッセイの大きさは、神経周囲浸潤の個々の領域をキャプチャするのに十分な詳細である4X対物レンズの視野内にうまく収まります。神経周囲の浸潤は、24時間以内に明らかになったが、48時間を超えて、アッセイの整合性は、腫瘍細胞がマトリックスの周囲に沿って分割して侵入するように、弱体化し始めます。 48時間を超えて、明視野顕微鏡を用いて可視化を不明瞭DRG、からの線維芽細胞の実質的な流出もあります。したがって、このウィンドウの間に少なくとも2回のフォトドキュメント4X顕微鏡での結果と得策である（ 例えば、腫瘍細胞をプレーティング後24および48時間で）。これらは、3次元のアッセイであり、それは完全に画像全体を分析することは困難であることを留意します。ほとんどの神経周囲の浸潤は、プレートの底、トンから飛行機で発生します彼細胞はわずかにプレートの底の上にマトリックス中に埋め込まれています。この平面が水平に近いため、腫瘍細胞と神経突起の大半は4Xでの単一レベルの画像に取り込まれます。 </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

プロトコル内の重要なステップ このプロトコル内の最も重要なステップは、後根神経節の正確な解剖と抽出されています。 2半棘に脊柱と正中線縦部門の適切離断は、DRGを大量に得るために重要です。個々のDRGの解剖時には、神経節は、直接処理するべきではありませんが、むしろ周囲の筋膜は、微細な鉗子で把持する必要があります。これを行うに失敗す...

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide1. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients2,3. 
PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI4-8.
Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC. 
In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine &amp;amp; 15 mM HEPES</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-090-CV</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11150</td><td>Flowery Branch, GA</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>25200056</td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Phosphate buffered Saline 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualif Mouse</td><td>Corning Incorporated</td><td>354277</td><td>Bedford, MA</td></tr><tr><td>Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Ashland, MA</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8 Operating Microscope</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td>495015-0021-000&amp;nbsp;</td><td>Thornwood, NY</td></tr><tr><td>Schott ACE I light source</td><td>Schott</td><td>A20500</td><td>Germany</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>C2925</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Premium Microdissecting Tweezer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>60-3851</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Premium Fine Operating Standard Scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-2789</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Premium Spring Scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>60-3923</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Dressing Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8949</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Athymic nude mice (002019)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002019</td><td>Bar Harbor, ME</td></tr></tbody></table>

a model for perineural invasion in head and neck squamous cell carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

DRGの解剖とマトリックス液滴内で配置した後、アッセイの外観は、DRGが完全な円ではなく、それをマトリックス液滴内の中心に位置していることを、図1（注）のようになります。これは、部分的に、図2に示す360度における神経突起の伸長を可能にします。 DRGの特定の部分は、典型的には、遠心性と求心性神経の枝が入力され、それぞれ、DR...

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A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.6K ビュー.  University of Pittsburgh Medical Center. Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

ビデオ: A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

医学

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

神経周囲浸潤のIn Vivoマウスの坐骨神経モデル

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

がん研究

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

神経科学

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous cell carcinoma and other cancers. Mechanistic studies have shown that the molecular crosstalk between nerves and tumor cells occurs prior to physical interaction. There are only a few in vivo models to study perineural invasion, especially to investigate early progression, before physical nerve-tumor interactions occur. The chick chorioallantoic membrane model has been used to study cancer invasion, because the basement membrane of the chorionic epithelium mimics that of human epithelial tissue. Here we repurposed the chick chorioallantoic membrane model to investigate perineural invasion, grafting rat dorsal root ganglia and human head and neck squamous cell carcinoma cells onto the chorionic epithelium. We have demonstrated how this model can be useful to evaluate the ability of cancer cells to invade neural tissue in vivo.&#160;

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is an aggressive phenotype for head and neck squamous cell carcinomas and other tumors. The chick chorioallantoic membrane model has been used for studying angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Here we demonstrate how this model can be utilized to assess perineural invasion in vivo.

頭頸部癌のペリオラル侵食を評価する生体内モデルにおけるひよこチョリオアラントIC膜

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Chick Chorioallantoic Membrane or CAM Tumor Model: An In Ovo Method to Simulate Perineural Invasion of Tumor Cells

Source: Schmidt, L. B. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59296" target="_blank">The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we describe the method to co-culture dorsal root ganglia and cancer cells on chick chorioallantoic membrane or CAM to study perineural invasion.

ひよこ絨毛尿膜またはCAM腫瘍モデル:腫瘍細胞の神経周囲浸潤をシミュレートするためのInOvo法

Source: Schmidt, L. B. et al. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (2019)
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JoVE Encyclopedia of Experiments

頭頸部がん

体内研究

Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion or PNI: Extraction and Processing of Sciatic Nerve to Understand Invasion by Cancer Cells

Source: Deborde, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56857" target="_blank">An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe the procedure to establish a murine model of perineural invasion by injecting cancer cells into the sciatic nerve. The model can help gain an understanding of the magnitude of nerve invasion for subsequent assessment of anti-cancer drugs.

神経周囲浸潤またはPNIのマウス坐骨神経モデル:がん細胞による浸潤を理解するための坐骨神経の抽出と処理

Source: Deborde, S. et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe the procedure to ...

神経系のがん

体外研究

Establishing a Three-dimensional Co-culture Model of Murine Dorsal Root Ganglia and Cancer Cells: An In Vitro Model to Study Perineural Cancer Cell Invasion

Source: Huyett, P. et al. <a href="https://www.jove.com/video/55043" target="_blank">A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the procedure for developing an in vitro perineural cancer cell invasion model by co-culturing mouse dorsal root ganglion and neurotropic cancer cells. The model can be utilized to conduct cancer assays, producing rapid and reproducible results.

マウス背根神経節とがん細胞の三次元共培養モデルの確立:神経周囲がん細胞の浸潤を研究するためのインビトロモデル

Source: Huyett, P. et al. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the ...