This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.

1. 문화 매체의 준비 및 요리 (10 분) <ol><li> 100 μL를 96 웰 V 바닥 플레이트의 웰에 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 추가한다. </li><li> 20 ° C의 냉동고에서 반고체 행렬의 약 100 μL의 사전 분주-병을 제거하고 얼음에 직접 배치합니다. 참고 : 반고체 행렬은 후속 단계에 필요한 얼음에 액체 상태에 도달하는 데 약 30 분 걸리기 때문에이 전에 후근 신경절에 (DRG) 수확 작업을 수행합니다. 항상 얼음에 반고체 매트릭스를 유지하지 않으면 저품질 매트릭스 방울을 초래할 것이다. </li><li> 라벨 유리 바닥 영구 잉크 배양 플레이트, 플레이트의 저면의 네 모서리 각각에 고유 식별자를 생성. 판 표면의 온도를 얼음에 플레이트가 오른쪽을 놓습니다. 참고 : 각 마우스 수익률 32-40 DRG, 소위 냉각 사전 파이 할 필요가 없습니다 (40)에 1에서 그들을 레이블냉장 팁 잠재적 매트릭스 방울을 배치하는 매트릭스 일관성의 차이를 도입하는 과정을 통해 따뜻한 같이, 팁 애완. </li></ol> 쥐 DRG 2. 해부 (45 분) <ol><li> 이러한 CO 2 챔버 개흉술의 사용을 통해 특정 실험 프로토콜, 당 등의 무 흉선 누드 마우스를 안락사. </li><li> 해부 영역과 현미경을 설정합니다. 15 또는 50 ML 원뿔 튜브 폴리스티렌 용기의 살균, 깨끗하고 평평한 밑면을 사용합니다. 주 : 또한 그들은 일회용 저렴 같이 해부 표면으로 사용하기 위해 적합하며, 핀 또는 바늘을 사용하는 척추 고정을 허용한다. 만 멸균 악기와 바늘을 사용합니다. </li><li> 천연 시각에서 직선 또는 곡선 섬세한 가위로 마우스의 꼬리 헤드의 루트에서 척주를 따라 세로 절개를 만든다. </li><li> SACR 아래에 가로 분할에 같은 가위를 사용하여알 척추. 모든 방법을 사용 가위 두개골베이스까지 척추 양쪽 해부. 이 시점에서, 경추가 가위 가능한 두개쪽으로까지 횡단되어 있는지 확인합니다. </li><li> 낮은 전력에서 운영 현미경 척추의 자궁 끝을 준수하십시오. 백색 척수 척추 주위 근육 및 연부 조직의 다양한 양으로 둘러싸인 뼈 링의 중앙에 명백하다. </li><li> 미세한 스프링 가위로 3 척추 기관 - 제 2의 지느러미 또는 우수한면을 분할합니다. 가위의 스프링 작용을 이용하여, 척추체 박리가 중심선에서 발생되도록 절단 초기 뼈를 연다. 성례의 척추쪽으로 조금씩 계속하고 추체의 복부 또는 열등한 측면에서 동일한 상처를 완료하여 척추를 이등분. 참고 : 낮은 DRG 수율가 발생합니다 뼈 척추의 중간 선 절개를 확인하지 않으면. </li><li> 생에서의 포인트는, 척추는 두 부분으로 나누어 져 있습니다. 장소 및 멸균 접시에 아래로 향하게 척수로, 옆으로 하나의 헤미 - 척추를 놓습니다. 참고 : 장소에서 척수를 떠나는 것은 DRGs는 척수에 깊은만큼, 건조에서 DRGs를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 폴리스티렌 해부 플랫폼이 18 게이지 바늘과 다른 헤미 - 척추의 양쪽 끝을 고정합니다. 경부 끝부터 부드럽게 약 4 척추 수준에서 척수를 다시 박리 (척추가 좁아지고 있기 때문에 명백한 상기 DRG는 서로 근접하며, 리브 삽입있다). </li><li> DRG를 연결하는 감각 신경 (일반적으로 두)를 관찰한다. 신경이 DRG에 삽입 영역에서 부드럽게 미세 집게로 주변 근막을 파악. 해부 및 DRG을 확보하기 위해 미세한 스프링 가위로이 밴드와 다른 신경 조직을 잘라. 부드러운 철회는 뼈 척추 내 위치 밖으로 DRG을 가져올 것이다. 참고 : 증가이 단계에서 현미경 전력은 유리하다. 크게 신경 돌기의 성장을 제한 할 DRG에 부상을 크러시. 이것은 결코 직접 DRG 파악하지 피할 아니라 주변의 밴드를 파악하는 것이다. </li><li> 주변 신경을 DRG를 해제하는 미세한 스프링 가위로합니다 (DRG는 일반적으로 해부보기로 깊은 기준으로 한 말초 신경을 가지고) 잘라. 주 : 신경 말단과 DRG 지금이 시점에서 DRG에 가능한 한 가까운이 컷을 긴장에있는 동안 시작 이상적입니다 확인하는 가장 쉬운 방법입니다. 이 말단 지점이 절단되면, 근위 분기도 트리밍된다. </li><li> 미세한 스프링 가위로 어떤 길 잃은 신경 섬유 또는 근막 첨부 파일의 DRG를 낸다. 적절한 분리 한 후, 96 웰 V-바닥 판 내 상온 매체에 DRG를 배치했다. 참고 : 접시는 흰색 DRGs 쉽게 하위 mm를 시각화 수 아래 어두운 배경을 배치. 만 EAC 한 DRG를 배치시간 잘; 이러한 방식으로, 그들은 쉽게 후속 단계에서 설명 될 수있다. </li><li> 한 헤미 - 척추 후 다른 아래로이 과정을 모든 방법을 반복합니다. 40-32 총 20 DRGs, - 각 팀은 16을 산출한다. 주 :이보다 적은 DRGs가 있다면 척추 해부 상기 cephalad 및 / 또는 미부를 행할 필요가있다. DRGs 하나가 꼬리 쪽이 진행됨에 따라 점점 덜 잘 정의된다. </li></ol> 반고체 매트릭스 방울 3. 준비 (&lt;판 당 1 분) <ol><li> 얼음에서 하나의 유리 잘 바닥 플레이트를 제거하고 운영 현미경 아래에 얼음 블록에 놓습니다. 확인 매트릭스의 분취 항상 얼음에 유지합니다. </li><li> 또한 유리의 가장자리로부터 액적 자체 적어도 큰 거리를두고 2 μL 또는 10 μL의 micropipetter으로 유리 바닥 판의 4 개의 코너 부 각각에 행렬 1.5 μL 방울을 놓는다. <ol><li> 직접에 피펫의 팁을 놓고45도 각도로 유리합니다. 천천히 행렬을 피펫. 매트릭스가 접시에 종사 한 후 천천히 유리 바닥에서 멀리 이동합니다. 참고 : 매트릭스와 유리 사이의 표면 장력이 완벽한 반구 때마다 작성해야합니다. </li><li> 매트릭스로 공기 방울 부주의 주입 매트릭스 액적 훨씬 큰 직경을하고 제거하기 어렵 기 때문에 팁 비어 직전 피펫 멈춘다. 참고 : 피펫 손을 안정시키기 위해 두 번째 손을 사용하여보다 정확한 위치를 용이하게한다. </li></ol></li></ol> 반고체 매트릭스 방울로 DRG 4. 삽입 (&lt;접시 당 2 분) <ol><li> 잠시 실온 (~ 1 분)에서 매트릭스 물방울 접시를 남겨주세요. 이것은 약간 DRG의 정확한 배치가 쉬워, 매트릭스를 경화된다. </li><li> 국자 (파악하지)가 DRG 부드럽게 왼쪽 손에 폐쇄 미세 집게로. 다시, 작은 대하여 어두운 배경, 흰색DRG 시각화를 용이하게한다. 오른쪽 손에 21 게이지 바늘의 끝 부분에 DRG를 전송합니다. 이 전송은 집게에 잔류 미디어를 떠날 것이다. </li><li> 천천히 21 게이지 바늘 (도 1)를 사용하여 매트릭스 방울의 중앙으로 DRG를 삽입한다. 대부분은 DRG 용이 행렬로 분리되며, 그 바늘 중앙에 위치 될 수있다. <ol><li> DRG이 바늘로 찌르는 경우, 바늘의 오프 매트릭스 방울에 DRG를 밀어 미세 집게를 사용합니다. 실험실과 현미경 집게에서 심지 멀리 초과 용지는 닦습니다. 참고 : 매트릭스 미디어를 소개하는 것은 분석의 직경, 볼륨과 일관성을 변경합니다. 색 또는 색 쓰기와 얼음 블록이 섬세한 프로세스의 시각화를 쉽게 배경 대조를 제공합니다. </li></ol></li><li> 판은 네 DRGs있다 후에 DRG 행렬 방울의 중심에 있음을 보장하기 위해 최종 검사를 수행한다. 조정21 게이지 바늘로 필요에 따라. </li><li> 37 ° C 배양기에 완성 된 판을 전송합니다. 이 반고체 행렬을 공고히하고 위치에 DRG가 해결됩니다. </li><li> DRGs 모두에 대해이 과정을 반복합니다. 음성 대조군으로 DRG없이 빈 매트릭스 방울을 놓습니다. </li><li> 모든 접시를 완료하고 최소 3 분 동안 37 ° C 배양기에 노출 후 각각의 유리 바닥 판에 10 % FBS 매체와 DMEM의 4 ML을 추가합니다. 약간의 각도로 접시를 놓고 천천히 점진적으로 매트릭스 DRG 단위와 접촉하도록, 매체를 추가 할 수 있습니다. 주 : 매체가 너무 빨리 또는 적극적으로 매트릭스 및 / 또는 DRG를 추가하면 빠질 될 수 있습니다. </li><li> 72 시간 - 48에 대해 37 ° C 배양기에서 분석을 저장합니다. 참고 : 분석의 정기 검사 행렬 에지 (그림 2)으로 신경 돌기의 원주 가지를 표시합니다. 신경 돌기가 매트릭스 방식의 3/4보다 큰 경우에는, 그것을세포를 도금하는 것이 적절하다. </li></ol> 머리와 목 암 세포의 5. 준비 주 : 두경부 편평 세포 암종 세포 이외의 세포 라인이 실험 설계에 사용될 수있다. <ol><li> 37 ° C 배양기에서 선호 플라스크 또는 배양 접시에 10 % FBS와 DMEM에서 편평 상피 세포 암 세포주를 유지한다. 모든 매체 문화 플라스크 또는 접시에서 실험, 흡입 세포를 준비하고 PBS로 두 번 세척합니다. 10 % FBS DMEM으로 다음 5 분 동안 0.025 % 트립신을 적당량 첨가하여 세포를 정지. 6 mL의 배양 접시에 세포 및 미디어 혼합물의 피펫 4 mL를. 주 : 6 ㎖의 배양 플레이트가 더 이상 충분한 세포를 제공하는 경우에도 50 % 이하로 합류한다. </li><li> 염색 및 DRG 분석에 도금에 24 시간 이전에 다른 조건에 HNSCC 셀 라인을 노출. 재 투여 세포 environme 일관성을 유지하는 도금되면 조건NT를. 참고 : 세포 배양 접시에 1 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 다른 분자를 추가 - 마우스의 해부 및 매트릭스에 DRG의 주입 다음 1 일. </li><li> (- 삼일 행렬에 DRG 수확 및 주입 후 2) 세포를 도금하기 전에 형광 세포 얼룩에게 1 시간을 추가합니다. 참고 : 세포막을 통해 자유롭게 통과 여기에 사용되는 특정 얼룩; 그러나, 세포 내 티올 그룹과 반응 후, 얼룩은 세포 내에서 유지와 딸 세포에 전달된다. 염색 크게 분석법에서 시각화를 용이하게한다. 이 실험의 기간 3 일 - 형광이 2 존재하기 때문에 이러한 임시 얼룩은 이러한 분석에 이상적이다. 또한, 다양한 컬러의 사용을 허용하고 형광 단백질 형질 감염된 세포주를 생성하기위한 필요성을 제거한다. <ol><li> 무 혈청 DMEM 2 ㎖에 2 μL 10 mM의 스톡 세포 얼룩 혼합 색소 용액 10 μM 준비모든 세포의 상태에 따라. 세포에 첨가하기 전에 37 ℃로 가온이. </li><li> 플레이트에 부착 HNSCC 세포를 떠나, 6 mL의 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 10 μM 세포 염색 / 무 혈청 DMEM의 용액을 인산 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 첨가하고 2 분리 각 플레이트에 첨가 </li><li> 40 분 동안 37 ° C 배양기에 세포 얼룩 6 mL의 문화 판을 돌려줍니다. </li><li> 40 분 후, 배지를 흡인. PBS의 2 mL를 넣고 다음을 대기음. 각각의 판에 0.025 % 트립신 1 ㎖를 추가하고 37 ° C 배양기에서 교체합니다. </li><li> 3 후 10 % FBS와 DMEM 2 ML을 추가합니다 - 5 분, 15 ML 원뿔 튜브에 정지 세포를 전송합니다. 세포를 스핀 10 % FBS DMEM으로 1 ㎖에이를 재현 탁. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기와 세포를 카운트하고 용액 당 300,000 세포의 최종 세포 농도를 만들기 위해 10 % FBS DMEM으로 추가. </li></ol></li></ol> 6. 도금 머리와 N에크 암 세포 <ol><li> 인큐베이터에서 매트릭스 DRG 분석과 함께 유리 바닥 플레이트를 제거합니다. 주 - 삼일 신경 돌기는 일반적으로이 후 발생 행렬의 가장자리 방향의 적어도 75 % 일 때 다시, 이들은 적합하다. 이 가장 적어도 10 배 목표를 사용하여 볼 수 있습니다. </li><li> 유리 바닥 판에서 매체를 기음. 완전히 잘 매트릭스 DRG 유닛을 제거하지 않고, 유리 내의 매체 대기음. </li><li> 200 μL 피펫을 사용하여 300,000 세포 / ㎖의 매체의 200 μL를 그립니다. 각 매트릭스 DRG 분석을 통해 세포의 두 방울을 놓습니다. 한 접시에 각 셀 상태의 네 개의 반복을 만들어 각 매트릭스 방울에 대해이 단계를 수행합니다. 참고 : 행렬의 반구 형태는 세포 분석 (그림 3a,도 3b)의 주변을 따라 링에 정착 할 수 있습니다. 부드러운 트리거와 피펫을 찾는 것은 균일 한 배치가 훨씬 쉽게 떨어질 수 있습니다. </li><li> 유사 세포 수 및 디 확인4X 현미경 하에서 다양한 세포 조건 stribution. </li><li> 약 60 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 유리 바닥 판을 놓습니다. 주 : 세포 및 매체 (~ 150 μL)의 소량이 있지만 인큐베이터 시간을 몇 시간이 경과 할 때까지 상기 분석법은 건조하지 않는다. </li><li> 60 분 후, 부드럽게 유리 바닥 판의 측벽을 따라 10 % FBS와 DMEM 4 mL를 넣어. 주 : 일정 시간 동안 상기 세포가 부분적으로 바닥 판 및 세포를 방해하지 않는 매체를 첨가하는 방법을 준수. 상이한 세포 유형은 유리 바닥 판에 부착하기 위해 다소 시간이 걸릴 수 있도록. </li><li> 이전의 농도 수준을 유지하기 위해 현재 어떤 약물 또는 외인성 성장 인자를 교체. </li><li> 그들은 현미경으로 조사하는 경우를 제외하고 37 ° C 배양기에 분석을 돌려줍니다. 현미경에 의한 촬상이 분석의 결과를 정량화. 간단히과 신경초 침윤의 가닥을 계산네 개의 사분면에서 4 배 현미경 이미지를 사용. 참고 : 4X 목적 및 형광 기능이있는 현미경 사진 문서화 분석법을위한 적합합니다. 분석법의 크기는 신경초 침윤의 개별 영역을 포착 할 수있을만큼 자세히 설명하는 4X 목적, 분야 내에서 잘 맞습니다. 신경초 침윤 24 시간 이내에 분명하게하지만, 48 시간을 초과하면 분석의 무결성 종양 세포 매트릭스의 둘레를 따라 나누어 침입으로 약화하기 시작한다. 48 시간을 넘어도 시야 현미경을 사용하여 시각화를 가리는 DRG에서 섬유 아세포의 상당한 유출이 있습니다. 따라서,이 기간 동안 적어도 두 광 문서 4X 현미경에서의 결과하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 종양 세포 도금 후 24 및 48 시간에서). 이러한 3 차원 분석하고, 완전히 화상 전체 분석 어렵다는 염두. 대부분의 신경초 침윤 플레이트의 바닥, t에서 비행기에서 발생그 세포는 다소 플레이트의 바닥 위에 매트릭스에 포함된다. 이 평면은 수평으로 근접하기 때문에, 종양 세포와 신경 돌기의 대부분은 4X에서 단일 레벨의 이미지에서 캡처된다. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

프로토콜 내에서 중요한 단계 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 정확한 해부 및 후근 신경절의 추출이다. 이 헤미 - 척추에 척추와 중간 선 - 세로 부문의 적절한 절개는 DRG 많은 수의 획득에 중요하다. 개별 DRGs의 해부 동안, 신경절은 직접 처리해서는 안, 오히려 주위의 근막은 미세 집게로 파악되어야한다. 이렇게하지 않으면 가능성이 신경 돌기 가지에 대?...

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide1. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients2,3. 
PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI4-8.
Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC. 
In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine &#38; 15mM HEPES</td>
			<td style="width:207px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:139px;">10-090-CV</td>
			<td style="width:157px;">Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Flowery Branch, GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered Saline 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel hESC-Qualif Mouse</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>354277</td>
			<td>Bedford, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gamma Irradiated 35mm glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Ashland, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SteREO Discovery.V8 Operating Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td>495015-0021-000&#160;</td>
			<td>Thornwood, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Schott ACE I light source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>A20500</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker&#160;</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD PrecisionGlide Needle 18G and 21G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td>Franklin Lakes, NJ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Microdissecting Tweezer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>60-3851</td>
			<td>Holliston, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Fine Operating Standard Scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-2789</td>
			<td>Holliston, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Spring Scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>60-3923</td>
			<td>Holliston, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dressing Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td>Holliston, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Athymic nude mice (002019)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>002019</td>
			<td>Bar Harbor, ME</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model for perineural invasion in head and neck squamous cell carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

DRG의 절개 및 매트릭스 액적 내에 배치 한 후, 분석의 외형은 완전한 원형이 DRG 아니라고 참고도 1과 유사해야 있지만, 매트릭스 내 액적 중심. 이것은 그림 2에 부분적으로 표시된 360도에서 신경 돌기의 생장, 수 있습니다. DRG의 특정 부분이 일반적으로 원심성과 구 심성 신경 가지 입력하고 각각 DRG를 종료 한 경우에 해당, 다른 사람보다 더 빠르?...

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A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.5K 조회수.  University of Pittsburgh Medical Center. Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

비디오: A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of diagnosis. Metastatic RCC (mRCC) is incurable, with a median survival time of only 18 months. Immune-based interventions (e.g., interferon (IFN) and interleukin (IL)-2) induce durable responses in a fraction of mRCC patients, and multikinase inhibitors (e.g., sunitinib or sorafenib) or anti-VEGF receptor monoclonal antibodies (mAb) are largely palliative, as complete remissions are rare. Such shortcomings in current therapies for mRCC patients provide the rationale for the development of novel treatment protocols. A key component in the preclinical testing of new therapies for mRCC is a suitable animal model. Beneficial features that recapitulate the human condition include a primary renal tumor, renal tumor metastases, and an intact immune system to investigate any therapy-driven immune effector responses and the formation of tumor-induced immunosuppressive factors. This report describes an orthotopic mRCC mouse model that has all of these features. We describe an intrarenal implantation technique using the mouse renal adenocarcinoma cell line Renca, followed by the assessment of tumor growth in the kidney (primary site) and lungs (metastatic site).

Implementation of an orthotopic model of renal cell carcinoma in immunocompetent mice affords the investigator a clinically-relevant system defined by the presence of a primary renal tumor and lung metastases in the same animal. This system can be used to preclinically test a variety of treatments in vivo.

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

연구

암 연구학

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their relative distribution and their localization in the tissue. This technique has been extensively applied to study the immune infiltrate in various tumor types. The tumor microenvironment is infiltrated by immune cells that are attracted to the tumor site. Different immune cell populations have been found to play different roles in the tumor microenvironment and to have a different impact on the outcome of disease. This manuscript describes the use of multiparameter fluorescence IHC on oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) as an example. This technique can be extended to other tissue samples and cell types of interest. In the presented study, we analyzed the intraepithelial and stromal compartment of a large OPSCC cohort (n = 162). We focused on total T lymphocytes (CD3+), immunosuppressive regulatory T cells (Tregs; i.e., FoxP3+), and T helper 17 (Th17) cells (i.e., IL-17+CD3+) using a nuclear counterstain to distinguish tumor epithelium from stroma. A high number of T cells was found to be correlated with improved disease-free survival in patients with a low number of intratumoral IL-17+ non-T cells. This suggests that IL-17+ non-T cells may be correlated with a poor immune response in OPSCC, which is in agreement with the correlation described between IL-17 and poor survival in cancer patients. Currently, novel multiparameter fluorescence IHC techniques are being developed using up to 7 different fluorochromes and will enable the more precise characterization and localization of immune cells in the tumor microenvironment.

Multiparameter fluorescence immunohistochemistry can be used to assess the number, relative distribution, and localization of immune cell populations in the tumor microenvironment. This manuscript describes the use of this technique to analyze T-cell subpopulations in oropharyngeal cancer.

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

Vivo에서 Murine 좌 골 신경의 모델 Perineural 내 습

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

종양 면역 프로 파일링에 대 한 쥐 및 치료 반응 평가에 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, one third of ccRCC patients will develop metastases to the lung, which is related to a very poor outcome for patients. Unfortunately, no therapy is available for this deadly stage, because the molecular mechanism of metastasis remains unknown. It has been known for 25 years that the loss of function of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene is pathognomonic of ccRCC. However, no clinically relevant transgenic mouse model of ccRCC has been generated. The purpose of this protocol is to introduce and compare two newly established animal models for metastatic ccRCC. The first is renal implantation in the mouse model. In our laboratory, the CRISPR gene editing system was utilized to knock out the VHL gene in several RCC cell lines. Orthotopic implantation of heterogeneous ccRCC populations to the renal capsule created novel ccRCC models that develop robust lung metastases in immunocompetent mice. The second model is the chicken chorioallantoic membrane (CAM) system. In comparison to the mouse model, this model is more time, labor, and cost-efficient. This model also supported robust tumor formation and intravasation. Due to the short 10 day period of tumor growth in CAM, no overt metastasis was observed by immunohistochemistry (IHC) in the collected embryo tissues. However, when tumor growth was extended by two weeks in the hatched chicken, micrometastatic ccRCC lesions were observed by IHC in the lungs. These two novel preclinical models will be useful to further study the molecular mechanism behind metastasis, as well as to establish new, patient-derived xenografts (PDXs) toward the development of novel treatments for metastatic ccRCC.

Metastatic clear cell renal cell carcinoma is a disease without a comprehensive animal model for thorough preclinical investigation. This protocol illustrates two novel animal models for the disease: the orthotopically implanted mouse model and the chicken chorioallantoic membrane model, both of which demonstrate lung metastasis resembling clinical cases.

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

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