Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson's Institute Brain Donation Program.

脳の寄付登録が寄付する意思の登録者によってドキュメントが含まれています。法律で認められているように、組織の検索のために剖検許可は近親者により提供されます。収集した剖検標本を用いた調査研究は、医療保険の携行性と責任に関する法律（HIPAA）規制の遵守を確保するために、治験審査委員会（IRB）によって検討されています。 注：軟膜試料は脳解剖中脳切開または神経病理学者によって収集され、25〜30 mLの髄膜増殖培地を含有する50mLのコニカルチューブに格納されています。試料は、試料調製まで4℃で保存します。細胞の生存率は、時間死後と減少する処理が可能な限り早く行われるべきです。 1.セットアップ軟膜解剖を開始する前に注：1.1ステップ - 1.3は、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。 <ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地、ウシ胎仔血清を100mLの375ミリリットルを組み合わせることにより、髄膜増殖培地を準備し、5 mLの10 mMの非必須アミノ酸、5 mLの200 mMのL-アラニル-L-グルタミン、5mlの100mMのピルビン酸ナトリウム、 5mLの万U / mLのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5 mLの250 / mlのアムホテリシンBを500mLのフィルターユニットです。フィルタと混ぜます。 4週間までのメディアを使用してください。 </li><li>解剖を開始する前に、バイオセーフティキャビネット内のすべての材料を配置する：4倍ペトリ皿、2×6ウェルプレート、2倍メス、15-20滅菌15 mmのカバースリップ、ピペットを吸引するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、血清学的ピペット、。 </li><li> 6ウェルプレートの各ウェルに滅菌オートクレーブ0.1％ゼラチン溶液1mLを加えます。 30〜60分間脇にプレートを設定します。 2×6ウェルプレートを準備します。 </li></ol>軟膜サンプルの調製注：2.1ステップ - 2.3は、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。 <ol><li>にPBSの約10 mLを加え滅菌10 cmの組織培養皿と皿に髄膜サンプルを配置します。鉗子を使用して、静かに血液を除去するためにPBSで軟膜を洗います。 </li><li>新鮮な10mLのPBSを含む新しい10-cmの組織培養皿に髄膜を移し、洗浄を続けます。できるだけ多くの血液を除去するために、必要に応じて繰り返します。 </li><li> 2メスを使用して、X 6センチメートル約6センチメートルに大部分を軟膜の組織を切断します。 </li><li>培養皿と水平層流フード内で解剖顕微鏡への転送の上に置いて蓋。 </li></ol>軟膜組織の3解剖注：3.1手順 - 3.3解剖顕微鏡を使用して、水平層流フード内で実行されます。 <ol><li>少なくとも20-25 3ミリメートル×3ミリメートルの作品を作成するのに十分な大き軟膜ピース（ステップ2.3）上の領域から血管を削除します。 1メスでの場所で軟膜を持ち、他に、穏やかな浅い掻きカ月を使用ションは、血管を分離します。 </li><li>準備された領域から組織の小さな正方形をカット。最初の大きい作品を作り、その後、小さなセクションにそれらをスライスして、段階的プロセスでカットします。 </li><li>揺動運動と組織を切断する代わりに、組織と別のメスを保持するために1メスを使用してください。組織の一貫性のために、互いに対してメスをスライドすることは困難です。これは離れて組織を引き裂くとギザギザのエッジになります。 </li><li>約20〜25 3ミリメートル×3ミリメートル片が存在するまで、半分に作品を切断続けます。 </li></ol>組織培養プレート上に解剖髄膜個の4譲渡注：ステップ4は、生物学的安全キャビネットの内部で行われるべきです。 <ol><li> （ステップ1.3から）6ウェルプレートから吸引除去ゼラチン。各ウェルに、髄膜増殖培地の1 mLを加え。滅菌ピンセットを用いて、各ウェルに3-4生検片を配置します。 </li></ol> Mの上カバースリップの5配置eninges小品注：5.1手順 - 5.2解剖顕微鏡を使用して、水平層流フード内で実行されます。 <ol><li>ウェル当たり1-2滅菌15-mmの円形カバースリップで作品をカバーしています。 </li><li>片がプレートの底に触れていることを確認するために鉗子でしっかりと押し下げます。これは、井戸の底に組織片の付着を可能にします。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーターに6ウェルプレートに置き。 </li></ol> 6.細胞培養のメンテナンス注：6.1ステップ - 6.3は、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。カバースリップは、髄膜片を移動させ、取り除くべきではないよう注意して培養皿を扱います。 <ol><li>文化の中で2日後、各ウェルに新鮮な髄膜増殖培地の追加の1 mLを加え。 </li><li> 7日目に、慎重にメディアを吸引し、各ウェルに新鮮な培地の2 mLを加え。 </li><li> 9日後、増殖培地毎に変化し続けます文化まで、他の日は、コンフルエントになります。 </li></ol> 7.継代注：すべてのステップは、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。髄膜線維芽細胞は、髄膜組織片の外に移行し、より大きな培養皿に髄膜線維芽細胞を、培養容器の縁に向かって成長拡大を開始した後。 <ol><li>継代を開始する前に、コート15-30分間1％ゼラチンで培養皿。 </li><li> 6ウェル皿から培地を吸引し、2mLのPBSで細胞を洗浄。 </li><li>各ウェルにトリプシン/ EDTAを1 mLを加え、5〜10分間37℃でインキュベートします。カバースリップまたはこのステップの髄膜組織を除去する必要はありません。 </li><li>細胞は丸みを帯びていると、デタッチ培地2mLのを追加して起動すると。 </li><li>ピペット細胞最大とまでは完全にすべての塊を破壊し、より大きな培養皿に細胞溶液を移します。 </li><li>三6ウェル皿から細胞を結合するために4：1〜3：1の比率を使用し1 T75培養皿に。 </li><li>髄膜線維芽後細胞を、細胞をトリプシン処理、T75培養フラスコ中でコンフルエントに、バイアル当たり1×10 6細胞/ mlで凍結保存培地中で凍結保存します。コンフルエント髄膜線維芽細胞の一つのT75培養フラスコは、約5〜7万個の細胞が含まれています。 </li></ol>免疫染色により髄膜線維芽細胞の8キャラクタリゼーション注：手順を開始する前に、4％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、PBS中の5％正常ヤギ血清（ブロッキング緩衝液）、0.3％トリトンX-100 PBS（透過化緩衝液）、一次および二次抗体溶液中で、およびを1μg/ mLでのヘキスト33342は、10mg / mLのストックからPBSで希釈しました。 <ol><li> 0.1％ゼラチンでコーティングした8ウェルチャンバースライドに15,000〜30,000髄膜線維芽細胞をシード。 </li><li>細胞が付着している場合、24時間後、室温で10分間、ウェルあたり100μLの4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 1×PBSでウェルを3回洗浄。 </li><li>室温で5分間、0.3％トリトンX-100150μlで細胞を透過性。 1×PBSでウェルを3回洗浄。 </li><li>室温で1時間ブロッキング溶液200μL（PBS + 5％正常ヤギ血清）を加えます。 </li><li>ブロッキング溶液を吸引除去し、ブロッキング溶液中に希釈し、所望の一次抗体の150μLを追加します。二重染色のために、次のように氷上で別々の遠心分離管中の一次抗体の作業希釈液を準備します。 <ol><li>抗フィブロネクチン+ 1の300倍希釈液：ブロッキング溶液中の抗ネスチンの200倍希釈を準備します。抗SERPINH1 + 1の250倍希釈液：ブロッキング溶液中の抗TUJ1 1,000希釈1を準備します。抗SERPINH1 + 1の250倍希釈液：ブロッキング溶液中の抗SOX2 100希釈の1を準備します</li></ol></li><li> 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 1×PBSでウェルを3回洗浄。 </li><li>抗ウサギ（緑ヤギ二次抗体を蛍光標識の400希釈; EX /エム2：作業1を準備します</sアップ&gt; 519分の495 nm）をヤギ抗マウス（赤; EX /エム2 617分の590 nm）をブロッキング溶液中で、各ウェルに100μLを追加します。室温、暗所で1時間インキュベートします。その後、1×PBSで一回、ウェルを洗浄します。 </li><li>各ウェルへの解決策を、3分間、暗所でインキュベートし; 100を1μg/ mLのヘキスト33342のμL（例/エム2 461分の358 nmの青に）を追加します。ウェルの最終1×PBS洗浄に残して、1×PBSでウェルを3回洗浄し、アルミ箔でスライドをカバーしています。 </li><li>蛍光顕微鏡下で細胞を分析します。 </li></ol>

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	<li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meninges:+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche.">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+stem/progenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche.">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood.">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).</li><li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases.">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li><li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells.">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li><li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain.">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li><li>Hjelm, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson's+disease:+a+clinico-pathological+study+of+100+cases.">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li><li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson's+disease.">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li><li>Langston, J. W., Sch&#252;le, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders.">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li><li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Sch&#252;le, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts.">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779 (2013).</li><li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNCA+triplication+Parkinson's+patient's+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress.">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).</li><li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson's+disease+patients:+reversal+by+gene+correction.">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li><li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson's+disease.">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、脳の寄付金と合わせて採取したヒト死後の軟膜から髄膜線維芽細胞培養を導出するためのシンプルかつ堅牢なプロトコルを記述します。死後の人間の材料から細胞培養物を導出するプロトコルの非常にいくつかの説明があります。二つの研究は、皮膚由来線維芽細胞培養物7を説明する 8、9、</...

硬膜、くも膜と軟膜：髄膜は脳を保護する3膜で構成されています。より最近には、髄膜も脳の発達と脳のホメオスタシス1で重要な役割を果たすことが認識されています。髄膜は、間葉系および神経堤由来細胞から誘導され、興味深いことに、髄膜内に存在する前駆細胞は、in vitroおよびin vivo 2、3、4 における移植後の神経細胞を生じさせることができることが示されています。それらはドーパミン作動性ニューロン5に、胚性幹細胞の分化のための間質細胞由来誘導活性を有するような髄膜培養物はまた、成功裏に、フィーダー層として使用されてきました。また、軟膜は直接虚血状態6の下で、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化する能力を持っています。 このプロトコルでは、人間の死後髄膜サンプルをまとめて、くも膜と軟膜から収集された軟膜と呼ばれ、研究目的のために人間の脳の寄付金の一部として調達されています。脳の解剖死の24時間以内に行われ、このプロトコルでここに示されているように軟膜サンプルは、次の6~8時間以内にさらなる処理のために冷増殖培地中に置かれます。 このプロトコルは、患者の一次軟膜細胞培養の開発のための解剖と人間の髄膜試料の調製を記載します。組織は、約3ミリメートル×3ミリメートルの正方形の25-30片に切断されています。三枚は各6ウェルに配置されたゼラチンでコーティングされたウェルと丸いガラスカバースリップでダウンして開催されました。髄膜切開は、約25-35分かかります。この文化の主な課題は、脳の調達、輸送、および解剖などの無菌性は、一般的に無菌条件下で行われていないです。 Therefore、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンBのカクテルで培地を補足し、別々に培養組織片にマルチウェルディッシュを使用することが重要です。 髄膜線維芽細胞の増殖は、最初の週以内に通常発生します。細胞がコンフルエントになるまで培地を2〜3日ごとに変化させ、細胞を酵素的に継代します。髄膜線維芽細胞は、凍結保存培地mLの/バイアルあたり100万個の細胞で凍結保存します。このプロトコルでは、20から30000000髄膜線維芽細胞は、凍結保存のため6-8週間で導出することができます。これらの髄膜線維芽細胞の下流のアプリケーションが、疾患の研究、直接神経分化または病気のメカニズムの理解のため、および薬物開発のための軟膜から誘導された多能性幹細胞の誘導のための一次培養物です。

<table><tbody><tr><td>Corning Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 6-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>15-mm cover slips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels, sterile blade, No. 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Curved precision tip forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL filter unit</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Combine media components and filter.</td></tr><tr><td>Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B (Yellow Solution/250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fibronectin Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 well chamber slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% Glycerol&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>100% normal goat serum&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectin antibody [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>1:300 dilution in blocking solution</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>1:250 dilution in blocking solution</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>1:100 dilution in blocking solution</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 dilution in blocking solution</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1:1,000 dilution in blocking solution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>dilute to a final concentration of 1.0 &amp;mu;g/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.</td></tr></tbody></table>

derivation of leptomeninges explant cultures from postmortem human brain donors

大きな進歩は、パーキンソン病の臨床的特徴付けてなされたものであっても、いくつかの研究は、パーキンソン病の診断は病理学的に、臨床的に診断されたパーキンソン病の25％までで確認されていないことを報告しています。したがって、特発性パーキンソン病と臨床的に診断された患者から採取した組織は、誤診率の高さを持つことができます。したがって、前臨床モデルとして、パーキンソン病を研究するために、このような組織からのin vitro試験で無駄になることができます。 パーキンソン病の確認神経病理学的診断と死後の人間の軟膜を収集し、黒質線条体細胞損失およびレビー小体と呼ばれる細胞内タンパク質封入体によって特徴づけられることで、1は、臨床的に観察されたパーキンソニズムは、他の基礎疾患プロセス（ 例えば、腫瘍、動脈硬化症）によって引き起こされていないことを確信することができます。 このプロトコルPRESEN髄膜線維芽細胞培養の導出のための死後の人間の軟膜の解剖と準備TS。この手順は、堅牢であり、高い成功率を有します。脳の調達は、一般的に無菌条件下で行われていないとして、文化の課題は、無菌性です。従って、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンBのカクテルで培地を補充することが重要ですパーキンソン病の剖検で確認例から髄膜線維芽細胞の導出は、パーキンソン病のin vitroモデル化のための基盤を提供します。髄膜線維芽細胞は3-9日、試料調製後に表示され、約20〜30万個の細胞を6〜8週間で凍結保存することができます。髄膜線維芽細胞培養物は、均質であり、細胞は、フィブロネクチン、髄膜を識別するために一般的に使用されるマーカーを発現します。

軟膜の処理プロトコルが成功したときに、これは脳のための死後変化の長さに依存することができますが、髄膜線維芽細胞の増殖は最初、3〜9日切開後に観察されます。 図1は、4つの異なるドナーの髄膜線維芽細胞培養物を示しています。 図1Aは、4日10時間20分の死後変化と88歳のドナーからの処理後の組織の周りにガラスカバー?...

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Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

人間の死後脳から軟膜外植片培養プロトコルは6-8週間以内にフィブロネクチン陽性髄膜線維芽細胞を導出し、約20から30000000細胞を凍結保存するための技術的に堅牢かつ簡単な方法です。

死後ヒト脳ドナーから軟膜植片培養物の導出

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

derivation-leptomeninges-explant-cultures-from-postmortem-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K ビュー.  Parkinson’s Institute and Clinical Center. 人間の死後脳から軟膜外植片培養プロトコルは6-8週間以内にフィブロネクチン陽性髄膜線維芽細胞を導出し、約20から30000000細胞を凍結保存するための技術的に堅牢かつ簡単な方法です。 

ビデオ: Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

神経科学

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

<meta charset="utf8"></head><body>循環腫瘍細胞を用いた軟髄膜疾患研究のためのマウスモデル

Ex Vivo Culture of Circulating Tumor Cells in the Cerebral Spinal Fluid from Melanoma Patients to Study Melanoma&#45;Associated Leptomeningeal Disease

Melanoma-associated leptomeningeal disease (M-LMD) occurs when circulating tumor cells (CTCs) enter into the cerebral spinal fluid (CSF) and colonize the meninges, the membrane layers that protect the brain and the spinal cord. Once established, the prognosis for M-LMD patients is dismal, with overall survival ranging from weeks to months. This is primarily due to a paucity in our understanding of the disease and, as a consequence, the availability of effective treatment options. Defining the underlying biology of M-LMD will significantly improve the ability to adapt available therapies for M-LMD treatment or design novel inhibitors for this universally fatal disease. A major barrier, however, lies in obtaining sufficient quantities of CTCs from the patient-derived CSF (CSF-CTCs) to conduct preclinical experiments, such as molecular characterization, functional analysis, and in vivo efficacy studies. Culturing CSF-CTCs ex vivo has also proven to be challenging. To address this, a novel protocol for the culture of patient-derived M-LMD CSF-CTCs ex vivo and in vivo is developed. The incorporation of conditioned media produced by human meningeal cells (HMCs) is found to be critical to the procedure. Cytokine array analysis reveals that factors produced by HMCs, such as insulin-like growth factor-binding proteins (IGFBPs) and vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), are important in supporting CSF-CTC survival ex vivo. Here, the usefulness of the isolated patient-derived CSF-CTC lines is demonstrated in determining the efficacy of inhibitors that target the insulin-like growth factor (IGF) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. In addition, the ability to intrathecally inoculate these cells in vivo to establish murine models of M-LMD that can be employed for preclinical testing of approved or novel therapies is shown. These tools can help unravel the underlying biology driving CSF-CTC establishment in the meninges and identify novel therapies to reduce the morbidity and mortality associated with M-LMD.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:軟髄膜疾患研究における循環腫瘍細胞の可能性の評価

This article describes a protocol for the propagation of cerebral spinal fluid-circulating tumor cells (CSF-CTCs) collected from patients with melanoma-associated leptomeningeal disease (M-LMD) to develop preclinical models to study M-LMD.

生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

Melanoma-associated leptomeningeal disease (M-LMD) occurs when circulating tumor cells (CTCs) enter into the cerebral spinal fluid (CSF) and colonize the ...

がん研究

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

免疫・感染学

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find preventive and curative measures. The most effective way to achieve this is through direct examination of diseased and healthy brain tissue. The authors present a protocol to obtain, process, characterize and store good quality brain tissue donated by individuals registered in an antemortem brain donation program. The donation program includes a face-to-face empathic approach to people, a collection of complementary clinical, biological, social and lifestyle information and serial multi-dimensional assessments over time to track individual trajectories of normal aging and cognitive decline. Since many neurological diseases are asymmetrical, our brain bank offers a unique protocol for slicing fresh specimens. Brain sections of both hemispheres are alternately frozen (at -80 &#176;C) or fixed in formalin; a fixed slice on one hemisphere corresponds to a frozen one on the other hemisphere. With this approach, a complete histological characterization of all frozen material can be obtained, and omics studies can be performed on histologically well-defined tissues from both hemispheres thus offering a more complete assessment of neurodegenerative disease mechanisms. Correct and definite diagnosis of these diseases can only be achieved by combining the clinical syndrome with the neuropathological evaluation, which often adds important etiological clues necessary to interpret the pathogenesis. This method can be time consuming, expensive and limited as it only covers a limited geographical area. Regardless of its limitations, the high degree of characterization it provides can be rewarding. Our ultimate goal is to establish the first Italian Brain Bank, all the while emphasizing the importance of neuropathologically verified epidemiological studies.

This protocol describes a method to track individual brain-aging trajectories through a brain donation program and proper characterization of brains. Brain donors are involved in a long-term longitudinal study including serial multi-dimensional assessments. The protocol contains a detailed description of brain processing and an accurate diagnostic methodology.

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

感染と自然免疫を研究するためのマウス脳胚混合細胞培養

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

著者スポットライト:感染と自然免疫を研究するためのマウス胚脳からの混合ニューロン細胞培養とグリア細胞培養の確立  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

死後ヒト脳ドナーから軟膜植片培養物の導出

要約

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出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

生体外黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

生体外黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

生体外黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

死後ヒト脳ドナーから軟膜植片培養物の導出

要約

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出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

生体外黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

生体外黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

生体外黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養