Name: temporal ordering of dynamic expression data from detailed spatial expression maps
Uploaded: 2017-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
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この作品は、RABにMRCの学生の身分、CSLBにMRCの学生の身分、およびJKD（WT089357MA）にWTプロジェクトの助成金によってサポートされていました。仕事はまた、ウェルカム・トラスト戦略賞（097945 / Z / 11 / Z）によってサポートされていました。私たちは、DLL1抗体とLfng RNAプローブのための博士O. Pourquieの寄贈博士E. Kremmerに感謝します。

すべての実験は、動物（科学的手順）1986年の法と科学的手順における動物の使用のための実践の英国内務省コードを厳守で、プロジェクトのライセンス番号6004219の下で行われました。 1. PSM植解剖<ol><li>野生型（CD1）マウス13の時限交配によって生成された胚から尾組織を取得します。簡潔には、胚日（E）10.5で、二酸化炭素チャンバ内妊娠ドナーマウスを安楽死させます。子宮角を収穫し、ホームオフィスのライセンス手続きまたは同等のローカルルールに従い、1×滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中にそれを置きます。新鮮な、滅菌PBSを含む組織培養皿に子宮角を転送します。この溶液中の後続のすべての解剖の手順を実行します。 </li><li>実体顕微鏡下では、湾曲したハサミを使用して子宮角の太い筋肉の膜をカットし、慎重に微細な鉗子を使用して、各胚を抽出します。世話をする尾の組織がこのプロセスにおいて損傷を受けないことを保証します。湾曲したハサミと細かい鉗子を使用して、各胚から羊膜嚢を離れて解剖、胚を傷つけないように注意しながら。 </li><li>後部肢芽への胚の後方を切断することによって、各胚の尾組織を採取するために外科用針又は湾曲したハサミのいずれかを使用してください。 </li><li>鉗子と針の両方を使用して、尾組織腹側を下にバランスをとります。正中線に沿って半分に尾組織を切開することにより、各胚の尾からPSMの外植片のペアを生成します。針で穏やかに揺動運動を行います。神経管、脊索、およびPSMの組織が均等に2外植片の間で分割されていることを確認してください。 </li><li>予め温めた（37℃）培地少量の10％ウシ胎児血清（DMEM-F12 + 0.1％L-グルタミン代わりに35mmのプラスチック培養皿の蓋の下面にそれぞれ対PSM外植片をピペット、10 nMのヒトbFGF、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。 </li> &lt;LI&gt;蓋の上に皿を置き、迅速PSM組織はメディアの「ハンギングドロップ」で蓋から吊り下げられているように、それを反転。文化1 37℃で加湿チャンバー内PSM植 - 2時間。 </li><li> 24ウェル組織培養プレートの個々のウェルにPSM植片の転送対。一晩、室温（RT）または4℃で1時間（O / N）をPBS中4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートします。 注意 ：パラホルムアルデヒドは有毒であり、この溶液を用いて作業する場合、適切な安全対策が取られなければなりません。 注：24ウェル組織培養プレート内のすべてのその後の洗浄およびインキュベーションの手順を実行します。 </li><li> 4回 - 新鮮なPBS 3用のサンプル上のPBS溶液を交換するために微細なプラスチック製パスツールピペットを使用して、ロッキングプラットフォーム上でRTでPBS中のサンプルウェルを洗浄します。プロセス1 PSMの免疫組織化学を使用して、各ペアから外植（ステップ2）と知られている時計遺伝子（STのためのin situハイブリダイゼーションその他用いた蛍光EP 3）。 </li></ol> PSM外植片の2免疫組織化学<ol><li>ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間、PBS中2％のトリトンX-100で、ステップ1で生成された各胚のペアから1 PSM外植片を洗浄し、その後PBSで簡単にサンプルをすすいでください。溶液（PBS + 0.1％ツイーン20中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清（NGS））をブロッキングサンプルにPBSを交換し、ロッキングプラットフォーム上で、4℃でO / Nインキュベートします。 注：特に明記しない限り、このセクションのすべてのその後の洗浄およびインキュベーション工程は、ロッキングプラットフォーム上でRTで実行する必要があります。洗浄溶液は、簡単に先の細いプラスチックまたはガラスパスツールピペットを使用して変更することができます。 </li><li>ワーキングバッファー中の所望の一次抗体/抗体を希釈し（0.1％BSA、0.3％NGS、そしてPBS中の0.2％トリトンX-100）。この例では、バッファを作業中のDLL1とのNotch1抗体1:25に希釈します。 注：最適化は、Th1に必要とされる適切な希釈係数を決定する必要があります代替抗体が使用される場合の手順。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で4℃で5日間 - 3用の抗体溶液中の外植片をインキュベートします。二次抗体のコントロールとして機能するように何の一次抗体を含有しない作業用バッファを持ついくつかのサンプルを必ず含めるようにしてください。 </li><li>ピペットを用いて1.5 mLの貯蔵管における一次抗体溶液を回収し、4℃で保存。 注：一次抗体を使用する抗体に依存して、数回使用することができる回収。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上でRTでPBS中2％トリトンX-100で10分間ずつ3回洗浄し、PBS中の10分間ずつ、 - 5のためのサンプルの2回の洗浄を行います。 </li><li>蛍光標識された二次抗体/抗体を希釈バッファーを作業中（一次抗体へのエピトープがマッチした/抗体を使用します）。必要に応じて、核を対比染色するために、この溶液に、20μgの/ mLのヘキスト33342を追加します。 注：最適化は、この工程で必要とされる適切な希釈率を決定するために必要とされ得ます。この電子でXAMPLE、1の希釈係数400は、一般的に使用されました。 </li><li>抗体凝集体の形成を防止するために、16×gで10分間、二次抗体溶液を遠心。抗体凝集体を含有することができる溶液の最後の数マイクロリットルを使用しないように注意しながら、各サンプルウェルに二次抗体溶液の500μL - 250を追加します。 </li><li>暗所で4℃で5日間 - 光の露出を最小限に抑え、3のための二次抗体溶液中でサンプルをインキュベートするスズ箔とサンプルプレートをカバーしています。 </li><li>実装サンプルをPBS中の0.1％のTween-20で10分間ずつ（PBST）およびロッキングプラットフォーム上で室温でPBSで一回で5分間二回のサンプルを洗う前に（ステップ4を参照）。 </li></ol> PSM外植片のin situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光<ol><li>代替的な容器に保存されている場合は、24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに、残りの対PSM外植片を移します。 </li><li>以下のためのサンプルを洗います10 PBST中50％エタノールで分、その後組織を脱水し、室温で揺動プラットフォーム上で、100％エタノールで10分間ずつ2回の洗浄を行います。 注：特に明記しない限り、このセクションのすべてのその後の洗浄およびインキュベーション工程は、ロッキングプラットフォーム上でRTで実行する必要があります。 </li><li> PBSTで各5分間、2回洗浄し、続いてPBST中50％エタノールで10分間洗浄することによって、組織を再水和します。 注：ステップ3.2および3.3は、このプロトコルのために必要な必要な固定ステップであり、省略することはできません。 </li><li>撹拌せずに5分間PBS（PBST）で0.1％のTween-20で10 / mlのプロテ​​イナーゼKでサンプルをインキュベートします。迅速プロテイナーゼKを除去し、PBSTで4％ホルムアルデヒド+ 0.1％グルタルアルデヒドで30分間組織を定着後の前にPBSTで簡単にサンプルをすすいでください。 注意：ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドの両方は有毒であり、そしてこれらのソリューションで作業するときに適切な安全対策が取られなければなりません。 注：以下の洗浄50％と100％のハイブリダイゼーションミックス（3.6ステップ - 3.9）を含むインキュベーション工程は、攪拌せずに実行する必要があります。 </li><li> 50％ホルムアミド、5×生理食塩水 - クエン酸ナトリウム（SSC）、5mMのEDTA、50μg/ mlのtRNAを、10分間、二回PBSTで各サンプルを洗浄した後、一度イントロンプローブに適した50％のハイブリダイゼーション混合物（内のサンプルを洗いますPBST中の0.2％Tween-20を、0.1％SDS、および100μg/ mLのヘパリン）を室温で調製しました。攪拌せずに65℃で10分間この溶液中でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 65℃で（48時間まで）≥2時間、ハイブリダイゼーション混合物中でサンプルをインキュベートする前に、予め温めた（65℃）ハイブリダイゼーション混合物で二回サンプルをすすぎ（より長いインキュベーション時間は、得られる信号対雑音コントラストを向上させます） 。前のステップからのハイブリダイゼーション混合物を取り外し、0.25に置き換える - ジゴキシゲニンを含む予め温めた（65℃）ハイブリダイゼーション混合物（DIG）の0.5 mLを知らセグメンテーション・クロック成分に対するアンチセンスRNAプローブを標識。 NOTE：例えば、イントロンルナティックフリンジ（Lfng（i））をプローブは、新生LfngのmRNAを検出するために、20μL/ mLの濃度で使用しました。この工程で使用される希釈は、プローブに依存し、最適化を必要とします。 </li><li>蒸発を防ぎ、65℃で2泊プローブ溶液中の試料をインキュベートする粘着テープを使用してプレートをシール。 </li><li>先の細いプラスチックパスツールピペットを使用して、再利用のためのプローブを回復し、20℃で保管してください。前に65℃で20分間、試料をさらに2回洗浄する前に、予め温めた（65℃）後、ハイブリダイゼーションミックス（50％ホルムアミド、0.2％のTween-20、および1×SSC）で2回サンプルをリンスポストハイブリダイゼーション混合物を温めました。 </li><li>トリス緩衝生理食塩水（TBST）中の0.1％のTween-20で予め温めておいた50％のハイブリダイゼーション混合物中で65℃で15分間、試料を洗浄します。ロッキングプラットフォーム上でTBST中、室温で30分間洗浄する前に、TBSTで二回サンプルを洗浄します。 </li><li> BLOでプレインキュベート外植弄ぶ天使液（TBST + 2％バッファー試薬（BBR）+ 20％熱処理ヤギ血清をブロッキング）2時間の最低。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の200希釈抗ジゴキシゲニン抗体を抱合：1を含む新鮮なブロッキング溶液でこのソリューションを交換してください。 4°CでサンプルO / Nインキュベートします。 </li><li>抗体のインキュベーション後、室温で試料をTBSTで3回リンスし、新しい24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに移します。 1時間ごとに、TBSTで3回植片を洗います。 </li><li>この時点で、チラミドシグナル増幅（TSA）は、以下のステップでの検出試薬の必要量を減少させるために0.5 mLの貯蔵チューブまたは48ウェル組織培養プレートの個々のウェルにサンプルを移します。 </li><li>サンプルが完全に溶液中に浸漬されていることを確実に、できるだけ少量を使用して攪拌せずに1分間RTで（試薬リストを参照）TSA増幅緩衝液中でサンプルをインキュベートします。 </li><li> （参照TSA試薬を追加します。1:50希釈でサンプル増幅バッファに試薬のリスト）。迅速TSA試薬が均等に分散されるまで、溶液を混合スズ箔でプレートまたはチューブをカバーし、60のためのサンプルをインキュベート - 暗所で90分。 </li><li> TSA増幅溶液を除去し、5分間ずつTBSTで3回のサンプルを洗います。洗浄量を増加させ、1時間TBST中1％過酸化水素中でサンプルをインキュベートするバック24ウェル組織培養プレートに外植片を移します。 （ステップ4を参照）取り付けサンプリングする前にPBSTで5分間ずつ二回、その後TBSTでサンプルを5分間、3回ずつ洗浄し、。 </li></ol>イメージング用4.サンプルの調製<ol><li>カバーガラスの添加によって押しつぶされからサンプルを防ぐ0.12ミリ厚のイメージングスペーサを、追加することにより、各植片対について1帯電した接着ガラススライドを準備します。スペーサの一方の面から接着剤ライナーを取り外し、スライドガラス上に接着剤側を下に置き、Fを押しますirmlyスライドにスペーサーをシールします。 注：残りの手順については、光退色を避けるために、低光の中や暗闇の中でサンプルを維持するために努めています。外植片の解剖側がスライドに直面していることを確認して、スペーサの中心部内のガラスパスツールピペットを用いて調製したスライド上にピペットの外植片のペア。側によって外植側の反対側のペアを配置します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いてスライドからできるだけ多くの液体を除去し、折り畳まれた低リントティッシュ一枚の紙を使用して、サンプルを囲む任意の残留水分をオフに吸い上げます。 </li><li>組織が粘着性と半透明表示され始めるまで、60秒 - サンプルは45のためのスライドに接着させます。この間、ピンセットを用いて、スペーサから残りの接着剤ライナーを削除します。サンプルを乾燥させないでください。 </li><li>センター内のサンプルに（90％グリセロール、0.5％のp-フェニレンジアミンおよび20 mMトリス、pHが8.8、）二重機能の封入及びクリア溶液の大液滴を追加スペーサーの。注：酸化することを許可すると、このソリューションは、ブラック/ブラウンになります。 </li><li>慎重に封入が均等に分散されていること、およびカバーガラスのすべてのエッジは、スペーサと接触することを確実にすること、サンプル全体に円形のカバースリップ（なし。1.5）を配置。いくつかの低リントティッシュペーパーの上に逆さまにカバースリップをスライドを置きます。 </li><li>カバーガラスが完全にスペーサーに付着すると、余分な封入が除去されることを保証するために、しっかりと押し下げます。これ以上の封入ブロット紙まで繰り返します。 </li><li>クリーンかつ適切にスライド（複数可）ラベル、およびイメージング-20℃で、短期的または-80℃で長期まで暗所に保管してください。ストレージからスライドを除去した後、彼らは完全にイメージングする前に解凍することができます。 </li><li>画像タイル張りの取得と高倍率の対物レンズとの共焦点顕微鏡を使用してマウントのサンプル。画像植片対488-nmの、568-nmおよび647 nmのレーザー李を使用して、4μmのz軸間隔で40X油浸対物レンズを使用して、それぞれ、緑、赤、および遠赤色の蛍光色素分子を励起するNEは、タンパク質と本研究12中のmRNA検出のために使用します。 注：タイル張りの画像は、分析のために単一の画像を形成するために、買収後にステッチしました。 </li></ol> 5.買収後の画像解析<ol><li>各実験サンプルのPSM内の関心領域を定義するために画像解析ソフトウェアを使用してください。 <ol><li>その後の定量化の前に非主要対照サンプルのレベルに発現レベル、減算背景閾値画像を定量化します。原点、軸、および各試料の単位長さを定義します。 </li></ol></li><li> M個のサンプル12のそれぞれの正規化吻側-尾側軸に沿った位置の関数としての蛍光強度を算出します。強度プロットを正規化した後、側によって強度プロファイル側に配置し、強度行列F（i、j）を取得iにおける強度を記述する<sサンプルj 番目の空間番目の位置&gt;まで。 </li></ol>サンプルの6時間的順序<ol><li>既知のクロック成分の時間的順序を推測するには、その強度行列を定義します。時間的に周期的なパターンを得るために、その後、強度行列の列を並べ替えます。これを行うには、関数を定義します <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation01.jpg" /> （F、J、K）はここで、f及びA Tのj 番目の列の自己相関関数を表すことにより、所定のパターンの時間的な周期性を強制するために選択された対象の自己相関関数であります <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation02.jpg" /></li><li>関数gを最小限のサンプルの順序を識別するために、メトロポリス・ヘイスティングス（または別の最小化アルゴリズム）12を使用してください。このように、順序を決定します既知のクロック成分の時間的周期性を最大化するMサンプル。 </li><li> Mサンプルの推論された時間的な順序付けを使用して、提携チャネル12内での発現パターンのために注文したカイモグラフを構築します。 </li></ol>

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	<li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139 (4), 625-639 (2012).</li><li>Krol, A. J., Roellig, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+segmentation+clock+networks.">Evolutionary plasticity of segmentation clock networks.</a> Development. 138 (13), 2783-2792 (2011).</li><li>Dequ&#233;ant, M. -. L., Ahnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pattern+Detection+Methods+in+Microarray+Time+Series+of+the+Segmentation+Clock.">Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock.</a> PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).</li><li>Bailey, C., Dale, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Somitogenesis in Vertebrate Development. , 1-15 (2015).</li><li>Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somitogenesis.">Somitogenesis.</a> Development. 139 (14), 2453-2456 (2012).</li><li>Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillator+mechanism+of+notch+pathway+in+the+segmentation+clock.">Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).</li><li>Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+Is+a+Critical+Component+of+the+Mouse+Somitogenesis+Oscillator+and+Is+Essential+for+the+Formation+of+the+Somites.">Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).</li><li>Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+positive+and+negative+regulators+determines+the+pace+of+the+segmentation+clock.">A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock.</a> eLife. 4, 05842 (2015).</li><li>Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+inhibition+by+the+ligand+DELTA-LIKE+3+defines+the+mechanism+of+abnormal+vertebral+segmentation+in+spondylocostal+dysostosis.">Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis.</a> Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).</li><li>Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanism+for+Gene-Environment+Interaction+in+the+Etiology+of+Congenital+Scoliosis.">A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis.</a> Cell. 149 (2), 295-306 (2012).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nature communications. 3, 1141 (2012).</li><li>Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+oscillations+of+Notch1,+Dll1+and+NICD+are+coordinated+across+the+mouse+PSM.">Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM.</a> Development. 141 (24), 4806-4816 (2014).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).</li><li>Denkers, N., Garc&#237;a-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+for+chick+genes:+Triple-label+whole-mount+fluorescence+in+situ+hybridization+detects+simultaneous+and+overlapping+gene+expression+in+avian+embryos.">FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).</li><li>Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+Notch+signaling+in+priming+the+cellular+response+to+Shh+through+ciliary+localisation+of+the+key+Shh+transducer+Smo.">A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo.</a> Development. 142 (13), 2291-2303 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

プロトコル内の重要なステップ現在のプロトコルは、E10.5マウスPSMの外植片に低レベルのタンパク質発現および振動ダイナミクスの定量分析を実行するために感度の高い方法を説明します。 in situハイブリダイゼーション（FISH） で免疫組織化学および蛍光の両方のための堅牢なプロトコルがPSMにわたってタンパク質発現の時空間マップを生成するために、高解像度の全マウント共焦点画像化に続いて、その後の画像解析とkymographsの時間分割によるものです。タンパク質およびmRNA検出において高い信号対雑音比は、この手法の成功を確実にするために不可欠です。に対して有効な抗体およびRNAプローブを供給するために時間を取ることが最も有利であるケア徹底的に洗浄工程の中に効果的にすべてのソリューションを交換するために注意しなければならないとステップ3の関連する段階で65℃の洗浄液の温度を維持するために、これらの試薬をテストするために、関心の対象と徹底的ホールマウント標本上でこのプロトコルを開始する前に。 修正およびトラブルシューティングこのプロトコルを実行する際に遭遇することができる主な問題は、貧弱な信号検出強度と品質から生じます。これは、それぞれのプロトコルにおける免疫組織化学またはFISH手順のために使用される抗体またはRNAプローブの有効性に大きく依存します。適切な信号検出が実現される前に別のステップ数は、最適化を必要とし得ます。劣悪な信号検出のための1つの一般的な原因は、不適切な固定です。新鮮なPFAまたはPFAのいずれかのサンプルを固定するために使用されなくなった1週間以内4℃で保存されていることが必須です。固定の長さもまた、使用される抗体又はRNAプローブに応じて、最適化を必要とし得ます。 RNAプローブのために、我々は公表された文献の相談を助言しながら、抗体のために、可能な場合は、製造元の指示に従うことをお勧めします。 LfngのプレmRNAを検出したRNAプローブを使用。存在量の相対的欠如、LfngプレmRNAの検出は、良好な信号検出のために5×生理食塩水-クエン酸ナトリウム（SSC）を含むハイブリダイゼーション混合物中のプローブとのインキュベーションの長時間を必要とします。同じ条件が弱く発現するmRNAを検出し、他のプローブに適用される場合がありますが、私たちの経験では、より安定したmRNA標的の検出は、ハイブリダイゼーション混合物中の短いプローブハイブリダイゼーション工程および低いSSC濃度（ 例えば、1.3倍のSSC）を必要とするかもしれません。免疫組織化学とFISHの両方のために、プロトコルが最初に胚全体で最適化する必要があり、かつ抗体またはプローブの最適濃度は、経験的に決定されなければなりません。 テクニックの制限事項上記のように、この手法の成功は、タンパク質およびmRNA検出の品質に大きく依存します。 Weはタンパク質およびmRNAの検出を向上させることができる方法についてのいくつかの提案を概説しているが、高品質な蛍光シグナル検出の不存在下で、実験を進めることができる方法はありません。各組織試料で分析することができるタンパク質標的の数は、共焦点顕微鏡のスペクトル分解能によって、および使用される抗体のエピトープによって制限されます。本研究では、各サンプル12上のDNA染色と一緒にタンパク質の検出のための3つのエピトープまで使用することができました。現在の別の方法は、最大3つのターゲット14にこれを増加させるために用いることができるが、このプロトコルだけ、1つのmRNA標的の検出を可能にします。 既存の/代替方法に関して技術の意義ここで説明する方法は、全マウントPSM植片における低レベルのタンパク質の変動を検出するための敏感な技術を提供します。これらのダイナミクスの定量化は、反対側の外植片を対応で知られている時計遺伝子のためのFISHを行うことで可能。 kymographsのライブラリーは、この時間枠内の関心対象の時空間的発現動態を強調一セグメンテーションクロックサイクルにわたって編成することができるが生成されます。他のものよりもこの手法で重要な違いは、時間的に公平な方法で分析するための新規クロックコンポーネントの時空間的発現動態を可能にする大規模なデータセットを注文する計算の自動化を使用することです。例えば、この技術は、DLL1およびNotch1のタンパク質およびそれらの振動が全体PSMにわたって共調節される方法への洞察を提供しました。この文脈での別の方法はまた、免疫染色に依存してきたが、彼らはこの方法を用いて明らかになった尾PSMにDLL1とのNotch1タンパク質レベルの小さな変動を検出しませんでした。その代わりに、彼らは吻側領域9に最も強い表現の安定勾配を報告しました<sアップ&gt;、10、11。タンパク質の低いレベルを検出するために必要とされてもよい - （一晩対照的に5日、3）、これは、このプロトコルは、より長い一次抗体のインキュベーション期間を有するという事実に起因し得ます。 DLL1およびNotch1の発現のレベルは、吻側PSMに比較的高いように、これは、より低い露光でサンプルを尾部タンパク質の発現を検出するために必要であるよりも設定画像に著者に影響を与えたかもしれません。一つの更なる潜在的な矛盾は、チャップマンらの研究における未固定組織の使用から生じます。 、ここで尾PSMでDLL1とのNotch1の一過性発現が少ない9をよく保存されている場合があります。 テクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方このプロトコルは、習得された後、高スループット発現分析はPSM中の目的の任意のタンパク質のために行うことができます。いくつかのマウスの同腹仔から生成されたPSMの外植片は、分析に必要な高いサンプル番号を生成するために、一度に処理することができます。我々はこれらの研究において、野生型の胚のみを使用しているが、タンパク質の発現動態上の1つ以上の因子の重要性を評価するために遺伝的に改変された胚を用いて、この分析を行うことが可能です。 PSMを超えて、このプロトコルは、2つの反対側の半分から構成されており、高感度低レベルのタンパク質発現および振動ダイナミクスを検出するために用いることができる他のシステムに適用することができます。反対側の半分を生成して培養することができるので、このプロトコルを適合させることができるれる一例では、マウスの神経管の動的タンパク質発現の研究で、Notch活性は、15をパターニングするために存在し、重要なの両方であることが示されています。私たちは、他のシステムにこのプロトコルを適応させることや将来の改善のためのフィードバックを提供するために、他のグループを奨励します。

体節は、脊椎動物種の開発に伸長体軸に形成された第一のセグメントであり、脊椎、肋骨の前駆体である、と真皮組織だけでなく、筋および内皮細胞の。体節形成の間に、上皮体節は（文献1に概説）セグメント化されていない前体節中胚葉（PSM）から形成されます。この処理は、主にNotchシグナル伝達経路に属する、振動遺伝子およびタンパク質のネットワークで構成され、「セグメンテーションクロック」によって調節されます。セグメンテーションクロックは単一のセル2内のNotch活性の拍動の生産を可能にする様々な負のフィードバックループ、で構成されています（参考文献に総説3から6）。発振の細胞内法は十分に特徴付けされているが、これらの振動は、PSMの組織全体で調整されているか、まだほとんど知られていません。最近では、これらの振動がessentiaであることを、両方の実験的および理論的研究によって示されています体節形成のプロセス及びNotch経路を分割し、振動遺伝子発現7,8両方のプロセスにおいて重要な役割を果たしていることを、L。しかし、それは広く、そのNotch受容体1（ノッチ1）に報告されており、デルタ様リガンド（DLL）-1 PSM 9、10、11の静的勾配を有しています。 私たちは、PSMセグメンテーションクロックのノッチ依存振動がマウスPSM渡って、それぞれメインNotch経路受容体とリガンド、のNotch1およびDLL1、の定期的な活性化に依存するという仮説を立てました。これらのタンパク質の静的吻側 - 尾側勾配を報告した以前の研究の結論は、我々は免疫染色技術の感受性の欠如のために、予測、によるものでした。彼らは尾PSMにDLL1とのNotch1の低レベルの変動を検出することができませんでした。 私たちは海eは、クロック成分のタンパク質の振動がPSM 12にわたって調整される機構を予測する数学的モデルと実験データとを組み合わせ、より密接にこれらの要因を検討する方法を考案しました。 この方法の全体的な目標を検出し、PSMで低レベル、ダイナミックなタンパク質の発現を定量化し、既知の時計遺伝子の発現に応じて目的のタンパク質の発現プロファイルをマッピングすることであり、 ルナティックフリンジ （Lfng）。マウス胚におけるセグメンテーションクロックの1サイクルが完了するまでに2時間を要しているため、様々なサンプルがPSMで1 Lfngの発振時DLL1とのNotch1タンパク質発現の完全な時空間プロファイルを構築するために必要とされます。そこで我々は、全体のマウントで低レベルのタンパク質発現のハイスループット検出、対側PSM植片を可能にするために、このプロトコルを開発しました。しかしながら、この技術も研究さtのために有用であり得ます帽子は反対側の半分に分割することができる任意の胚組織内で低レベルのタンパク質のダイナミクスを特徴づけることを目指しています。

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;trade;-1 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^</td><td>BD Pharmingen</td><td>552466</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat polyclonal Dll1 antibody^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Lfng&lt;/em&gt; intronic anti-sense RNA probe^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR grade&amp;nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>31158</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Made in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS) (heat-treated)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>16210072&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Saline-sodium citrate (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>101095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS)</td><td>Made in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer Reagent&amp;nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification (TSA) kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL744001KT</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources.</td></tr><tr><td colspan="4">^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader.</td></tr></tbody></table>

temporal ordering of dynamic expression data from detailed spatial expression maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

このプロトコルは、マウスPSM 12における時計遺伝子の転写と一緒に目的のタンパク質の時空間プロファイルの可視化を可能にします。たとえば、DLL1（ 図1A-C）とのNotch1（ 図1D-F）タンパク質の発現は、Notch調節セグメンテーション時計遺伝子Lfngの新生転写と同期外振動することが示されています。 DLL1、ノッチ1、およびPSM（ 図1G）の前後（AP）軸に対してLfng（I）信号強度の定量化は、これらのターゲット（ 図1H-J）のための明確な振動式ダイナミクスを明らかにする。クロックサイクルを通してDLL1とのNotch1タンパク質発現の時空間プロファイルが明らかに視覚化し、高解像度の固定組織の画像データの取得後の画像解析により、このプロトコルを使用して定量します。 図1：DLL1とのNotch1タンパク質発現ダイナミクスの時空間可視化と定量化。 （AF）での検出と一緒に半分でDLL1タンパク質（AC）またはNotch1のタンパク質（DF）の空間分布を示す6 E10.5胚（AF）LfngプレmRNA（Lfng（i））をから外植片のペア各ペアの反対側の半分に相当します。 Lfngの空間プロファイル（I）式によって決定されるパネルは、分割クロック周期のフェーズ1（A及びD）、フェーズ2（B及びE）、およびフェーズ3（CおよびF）に応じて配置されています。 PSMの前後軸に沿ってDLL1（緑）、ノッチ1（赤）、およびLfng（ⅰ）（グレー）のための発現ドメインの程度はBを持っています色分けされたバーで区切らEEN。点線は、最近形成体節（S）、PSMの外縁と隣接する神経組織（C及びE）の位置の境界を定めます。スケールバー（各パネルの左下、AF）は 100μmで表します。 PSMを横切る信号強度の軸方向の変化を示す（G）例えば強度プロット。データは反対側の外植片中のNotch1タンパク質（赤）（胚1）、ならびにLfngプレmRNA（黒の実線）で比較して1つの外植片にLfngプレmRNA（黒ハッシュ化されたライン）を示す2植片対からプロットされています別の外植片は反対側の外植片（胚2）にDLL1タンパク質（緑）と比較します。測定された信号強度（y軸）の軸方向位置に対してプロットされている（X軸; [A]、左から右及び後方PSM [P]にPSMを前方）。全体の（H）DLL1、のNotch1、およびLfng（i）の空間分布を示すカイモグラフ多数のPSM。カイモグラフの各行は、個々のPSMの外植片の信号強度を表しています。行がLfngプレmRNA（I）に示されているデータの定期的な拡張によってシミュレートされた複数のクロック発振を通じてDLL1、ノッチ1、およびLfng（i）の時空間分布の時空間分布に応じて時系列に配置されている（H） 、DLL1およびNotch1の発現動態の振動性を強調しています。尾PSM中（J）脈動のNotch1タンパク質の発現は、（I）に示した仮想カイモグラフに画定地域の拡大によって強調されています。リファレンス12から変更された<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> 図2：DLL1 とのNotch1タンパク質発現の時空間ダイナミクスの定量。 （A）の例の強度プロットは、PSMを横切る信号強度の軸方向の変化を示しています。データはから半植片で反対側の外植半分でのNotch1タンパク質（赤）、ならびにLfngプレmRNA（黒の実線）と比較して、1つの外植片にLfngプレmRNA（黒ハッシュ化されたライン）を示す2植片対からプロット第二尾の反対側の外植半分にDLL1タンパク質（緑）に比べて二尾。測定された強度（y軸）は、軸方向の位置（;吻側[A]右尾[P]左側のx軸）に対してプロットされています。 （BH）Kymographsは、多くのPSM全体でのNotch1、DLL1、NICD、およびLfng（i）の空間分布を示しています。 （BおよびC）、NICD（B）およびDLL1（C）PSM切片における発現。 （DおよびE）Lfng（I）〜（D）およびDLL1（&lt;反対側の外植半分に強い&gt; E）; （FとG）対側外植半分でLfng（i）から （F）とのNotch1（G）。リファレンス12から<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K ビュー.  University of Copenhagen. The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

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Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

発生生物学

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

がん研究

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein and RNA multiplexing by leveraging photo-cleavable oligo-tagged antibodies and probes, respectively. Oligos are cleaved and quantified from specific regions across the tissue to elucidate the underlying biology. Here, the study demonstrates that automated custom antibody visualization protocols can be utilized to guide ROI selection in conjunction with spatial proteomics assays. This specific method did not show acceptable performance with spatial transcriptomics assays. The protocol describes the development of a 3-plex immunofluorescent (IF) assay for marker visualization on an automated platform, using tyramide signal amplification (TSA) to amplify the fluorescent signal from a given protein target and increase the antibody pool to choose from. The visualization protocol was automated using a thoroughly validated 3-plex assay to ensure quality and reproducibility. In addition, the exchange of DAPI for SYTO dyes was evaluated to allow imaging of TSA-based IF assays on the spatial profiling platform. Additionally, we tested the ability of selecting small ROIs using the spatial transcriptomics assay to allow the investigation of highly-specific areas of interest (e.g., areas enriched for a given cell type). ROIs of 50 &#181;m and 300 &#181;m diameter were collected, which corresponds to approximately 15 cells and 100 cells, respectively. Samples were made into libraries and sequenced to investigate the capability to detect signals from small ROIs and profile-specific regions of the tissue. We determined that spatial proteomics technologies highly benefit from automated, standardized protocols to guide ROI selection. While this automated visualization protocol was not compatible with spatial transcriptomics assays, we were able to test and confirm that specific cell populations can successfully be detected even in small ROIs with the standard manual visualization protocol.

Here, we describe a protocol for fine-tuning regions of interest (ROIs) for Spatial Omics technologies to better characterize the tumor microenvironment and identify specific cell populations. For proteomics assays, automated customized protocols can guide ROI selection, while transcriptomics assays can be fine-tuned utilizing ROIs as small as 50 &#181;m.

組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

生物学

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying cell composition, discrimination of functional states, and molecular pathways underlying observed tissue functions and animal behaviors. However, the isolation of intact, healthy single cells from adult mammalian tissues for subsequent downstream single cell molecular analysis can be challenging. This protocol describes the general processes and quality control checks necessary to obtain high-quality adult single cell preparations from the nervous system or skin that enabled subsequent unbiased single cell RNA sequencing and analysis. Guidelines for downstream bioinformatic analysis are also provided.

This protocol describes the general processes and quality control checks necessary for preparing healthy adult mammalian single cells for droplet-based, high throughput single cell RNA-Seq preparations. Sequencing parameters, read alignment, and downstream single-cell bioinformatic analysis are also provided.

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

要約

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この動画の章

で活躍ERKの時空間解析

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

哺乳類の成体の液滴バーコードベースの単一細胞トランスクリプトーム

植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

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で活躍ERKの時空間解析

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析

哺乳類の成体の液滴バーコードベースの単一細胞トランスクリプトーム