この作品は、RABにMRCの学生の身分、CSLBにMRCの学生の身分、およびJKD（WT089357MA）にWTプロジェクトの助成金によってサポートされていました。仕事はまた、ウェルカム・トラスト戦略賞（097945 / Z / 11 / Z）によってサポートされていました。私たちは、DLL1抗体とLfng RNAプローブのための博士O. Pourquieの寄贈博士E. Kremmerに感謝します。

すべての実験は、動物（科学的手順）1986年の法と科学的手順における動物の使用のための実践の英国内務省コードを厳守で、プロジェクトのライセンス番号6004219の下で行われました。 1. PSM植解剖<ol><li>野生型（CD1）マウス13の時限交配によって生成された胚から尾組織を取得します。簡潔には、胚日（E）10.5で、二酸化炭素チャンバ内妊娠ドナーマウスを安楽死させます。子宮角を収穫し、ホームオフィスのライセンス手続きまたは同等のローカルルールに従い、1×滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中にそれを置きます。新鮮な、滅菌PBSを含む組織培養皿に子宮角を転送します。この溶液中の後続のすべての解剖の手順を実行します。 </li><li>実体顕微鏡下では、湾曲したハサミを使用して子宮角の太い筋肉の膜をカットし、慎重に微細な鉗子を使用して、各胚を抽出します。世話をする尾の組織がこのプロセスにおいて損傷を受けないことを保証します。湾曲したハサミと細かい鉗子を使用して、各胚から羊膜嚢を離れて解剖、胚を傷つけないように注意しながら。 </li><li>後部肢芽への胚の後方を切断することによって、各胚の尾組織を採取するために外科用針又は湾曲したハサミのいずれかを使用してください。 </li><li>鉗子と針の両方を使用して、尾組織腹側を下にバランスをとります。正中線に沿って半分に尾組織を切開することにより、各胚の尾からPSMの外植片のペアを生成します。針で穏やかに揺動運動を行います。神経管、脊索、およびPSMの組織が均等に2外植片の間で分割されていることを確認してください。 </li><li>予め温めた（37℃）培地少量の10％ウシ胎児血清（DMEM-F12 + 0.1％L-グルタミン代わりに35mmのプラスチック培養皿の蓋の下面にそれぞれ対PSM外植片をピペット、10 nMのヒトbFGF、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。 </li> &lt;LI&gt;蓋の上に皿を置き、迅速PSM組織はメディアの「ハンギングドロップ」で蓋から吊り下げられているように、それを反転。文化1 37℃で加湿チャンバー内PSM植 - 2時間。 </li><li> 24ウェル組織培養プレートの個々のウェルにPSM植片の転送対。一晩、室温（RT）または4℃で1時間（O / N）をPBS中4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートします。 注意 ：パラホルムアルデヒドは有毒であり、この溶液を用いて作業する場合、適切な安全対策が取られなければなりません。 注：24ウェル組織培養プレート内のすべてのその後の洗浄およびインキュベーションの手順を実行します。 </li><li> 4回 - 新鮮なPBS 3用のサンプル上のPBS溶液を交換するために微細なプラスチック製パスツールピペットを使用して、ロッキングプラットフォーム上でRTでPBS中のサンプルウェルを洗浄します。プロセス1 PSMの免疫組織化学を使用して、各ペアから外植（ステップ2）と知られている時計遺伝子（STのためのin situハイブリダイゼーションその他用いた蛍光EP 3）。 </li></ol> PSM外植片の2免疫組織化学<ol><li>ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間、PBS中2％のトリトンX-100で、ステップ1で生成された各胚のペアから1 PSM外植片を洗浄し、その後PBSで簡単にサンプルをすすいでください。溶液（PBS + 0.1％ツイーン20中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清（NGS））をブロッキングサンプルにPBSを交換し、ロッキングプラットフォーム上で、4℃でO / Nインキュベートします。 注：特に明記しない限り、このセクションのすべてのその後の洗浄およびインキュベーション工程は、ロッキングプラットフォーム上でRTで実行する必要があります。洗浄溶液は、簡単に先の細いプラスチックまたはガラスパスツールピペットを使用して変更することができます。 </li><li>ワーキングバッファー中の所望の一次抗体/抗体を希釈し（0.1％BSA、0.3％NGS、そしてPBS中の0.2％トリトンX-100）。この例では、バッファを作業中のDLL1とのNotch1抗体1:25に希釈します。 注：最適化は、Th1に必要とされる適切な希釈係数を決定する必要があります代替抗体が使用される場合の手順。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で4℃で5日間 - 3用の抗体溶液中の外植片をインキュベートします。二次抗体のコントロールとして機能するように何の一次抗体を含有しない作業用バッファを持ついくつかのサンプルを必ず含めるようにしてください。 </li><li>ピペットを用いて1.5 mLの貯蔵管における一次抗体溶液を回収し、4℃で保存。 注：一次抗体を使用する抗体に依存して、数回使用することができる回収。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上でRTでPBS中2％トリトンX-100で10分間ずつ3回洗浄し、PBS中の10分間ずつ、 - 5のためのサンプルの2回の洗浄を行います。 </li><li>蛍光標識された二次抗体/抗体を希釈バッファーを作業中（一次抗体へのエピトープがマッチした/抗体を使用します）。必要に応じて、核を対比染色するために、この溶液に、20μgの/ mLのヘキスト33342を追加します。 注：最適化は、この工程で必要とされる適切な希釈率を決定するために必要とされ得ます。この電子でXAMPLE、1の希釈係数400は、一般的に使用されました。 </li><li>抗体凝集体の形成を防止するために、16×gで10分間、二次抗体溶液を遠心。抗体凝集体を含有することができる溶液の最後の数マイクロリットルを使用しないように注意しながら、各サンプルウェルに二次抗体溶液の500μL - 250を追加します。 </li><li>暗所で4℃で5日間 - 光の露出を最小限に抑え、3のための二次抗体溶液中でサンプルをインキュベートするスズ箔とサンプルプレートをカバーしています。 </li><li>実装サンプルをPBS中の0.1％のTween-20で10分間ずつ（PBST）およびロッキングプラットフォーム上で室温でPBSで一回で5分間二回のサンプルを洗う前に（ステップ4を参照）。 </li></ol> PSM外植片のin situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光<ol><li>代替的な容器に保存されている場合は、24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに、残りの対PSM外植片を移します。 </li><li>以下のためのサンプルを洗います10 PBST中50％エタノールで分、その後組織を脱水し、室温で揺動プラットフォーム上で、100％エタノールで10分間ずつ2回の洗浄を行います。 注：特に明記しない限り、このセクションのすべてのその後の洗浄およびインキュベーション工程は、ロッキングプラットフォーム上でRTで実行する必要があります。 </li><li> PBSTで各5分間、2回洗浄し、続いてPBST中50％エタノールで10分間洗浄することによって、組織を再水和します。 注：ステップ3.2および3.3は、このプロトコルのために必要な必要な固定ステップであり、省略することはできません。 </li><li>撹拌せずに5分間PBS（PBST）で0.1％のTween-20で10 / mlのプロテ​​イナーゼKでサンプルをインキュベートします。迅速プロテイナーゼKを除去し、PBSTで4％ホルムアルデヒド+ 0.1％グルタルアルデヒドで30分間組織を定着後の前にPBSTで簡単にサンプルをすすいでください。 注意：ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドの両方は有毒であり、そしてこれらのソリューションで作業するときに適切な安全対策が取られなければなりません。 注：以下の洗浄50％と100％のハイブリダイゼーションミックス（3.6ステップ - 3.9）を含むインキュベーション工程は、攪拌せずに実行する必要があります。 </li><li> 50％ホルムアミド、5×生理食塩水 - クエン酸ナトリウム（SSC）、5mMのEDTA、50μg/ mlのtRNAを、10分間、二回PBSTで各サンプルを洗浄した後、一度イントロンプローブに適した50％のハイブリダイゼーション混合物（内のサンプルを洗いますPBST中の0.2％Tween-20を、0.1％SDS、および100μg/ mLのヘパリン）を室温で調製しました。攪拌せずに65℃で10分間この溶液中でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 65℃で（48時間まで）≥2時間、ハイブリダイゼーション混合物中でサンプルをインキュベートする前に、予め温めた（65℃）ハイブリダイゼーション混合物で二回サンプルをすすぎ（より長いインキュベーション時間は、得られる信号対雑音コントラストを向上させます） 。前のステップからのハイブリダイゼーション混合物を取り外し、0.25に置き換える - ジゴキシゲニンを含む予め温めた（65℃）ハイブリダイゼーション混合物（DIG）の0.5 mLを知らセグメンテーション・クロック成分に対するアンチセンスRNAプローブを標識。 NOTE：例えば、イントロンルナティックフリンジ（Lfng（i））をプローブは、新生LfngのmRNAを検出するために、20μL/ mLの濃度で使用しました。この工程で使用される希釈は、プローブに依存し、最適化を必要とします。 </li><li>蒸発を防ぎ、65℃で2泊プローブ溶液中の試料をインキュベートする粘着テープを使用してプレートをシール。 </li><li>先の細いプラスチックパスツールピペットを使用して、再利用のためのプローブを回復し、20℃で保管してください。前に65℃で20分間、試料をさらに2回洗浄する前に、予め温めた（65℃）後、ハイブリダイゼーションミックス（50％ホルムアミド、0.2％のTween-20、および1×SSC）で2回サンプルをリンスポストハイブリダイゼーション混合物を温めました。 </li><li>トリス緩衝生理食塩水（TBST）中の0.1％のTween-20で予め温めておいた50％のハイブリダイゼーション混合物中で65℃で15分間、試料を洗浄します。ロッキングプラットフォーム上でTBST中、室温で30分間洗浄する前に、TBSTで二回サンプルを洗浄します。 </li><li> BLOでプレインキュベート外植弄ぶ天使液（TBST + 2％バッファー試薬（BBR）+ 20％熱処理ヤギ血清をブロッキング）2時間の最低。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の200希釈抗ジゴキシゲニン抗体を抱合：1を含む新鮮なブロッキング溶液でこのソリューションを交換してください。 4°CでサンプルO / Nインキュベートします。 </li><li>抗体のインキュベーション後、室温で試料をTBSTで3回リンスし、新しい24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに移します。 1時間ごとに、TBSTで3回植片を洗います。 </li><li>この時点で、チラミドシグナル増幅（TSA）は、以下のステップでの検出試薬の必要量を減少させるために0.5 mLの貯蔵チューブまたは48ウェル組織培養プレートの個々のウェルにサンプルを移します。 </li><li>サンプルが完全に溶液中に浸漬されていることを確実に、できるだけ少量を使用して攪拌せずに1分間RTで（試薬リストを参照）TSA増幅緩衝液中でサンプルをインキュベートします。 </li><li> （参照TSA試薬を追加します。1:50希釈でサンプル増幅バッファに試薬のリスト）。迅速TSA試薬が均等に分散されるまで、溶液を混合スズ箔でプレートまたはチューブをカバーし、60のためのサンプルをインキュベート - 暗所で90分。 </li><li> TSA増幅溶液を除去し、5分間ずつTBSTで3回のサンプルを洗います。洗浄量を増加させ、1時間TBST中1％過酸化水素中でサンプルをインキュベートするバック24ウェル組織培養プレートに外植片を移します。 （ステップ4を参照）取り付けサンプリングする前にPBSTで5分間ずつ二回、その後TBSTでサンプルを5分間、3回ずつ洗浄し、。 </li></ol>イメージング用4.サンプルの調製<ol><li>カバーガラスの添加によって押しつぶされからサンプルを防ぐ0.12ミリ厚のイメージングスペーサを、追加することにより、各植片対について1帯電した接着ガラススライドを準備します。スペーサの一方の面から接着剤ライナーを取り外し、スライドガラス上に接着剤側を下に置き、Fを押しますirmlyスライドにスペーサーをシールします。 注：残りの手順については、光退色を避けるために、低光の中や暗闇の中でサンプルを維持するために努めています。外植片の解剖側がスライドに直面していることを確認して、スペーサの中心部内のガラスパスツールピペットを用いて調製したスライド上にピペットの外植片のペア。側によって外植側の反対側のペアを配置します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いてスライドからできるだけ多くの液体を除去し、折り畳まれた低リントティッシュ一枚の紙を使用して、サンプルを囲む任意の残留水分をオフに吸い上げます。 </li><li>組織が粘着性と半透明表示され始めるまで、60秒 - サンプルは45のためのスライドに接着させます。この間、ピンセットを用いて、スペーサから残りの接着剤ライナーを削除します。サンプルを乾燥させないでください。 </li><li>センター内のサンプルに（90％グリセロール、0.5％のp-フェニレンジアミンおよび20 mMトリス、pHが8.8、）二重機能の封入及びクリア溶液の大液滴を追加スペーサーの。注：酸化することを許可すると、このソリューションは、ブラック/ブラウンになります。 </li><li>慎重に封入が均等に分散されていること、およびカバーガラスのすべてのエッジは、スペーサと接触することを確実にすること、サンプル全体に円形のカバースリップ（なし。1.5）を配置。いくつかの低リントティッシュペーパーの上に逆さまにカバースリップをスライドを置きます。 </li><li>カバーガラスが完全にスペーサーに付着すると、余分な封入が除去されることを保証するために、しっかりと押し下げます。これ以上の封入ブロット紙まで繰り返します。 </li><li>クリーンかつ適切にスライド（複数可）ラベル、およびイメージング-20℃で、短期的または-80℃で長期まで暗所に保管してください。ストレージからスライドを除去した後、彼らは完全にイメージングする前に解凍することができます。 </li><li>画像タイル張りの取得と高倍率の対物レンズとの共焦点顕微鏡を使用してマウントのサンプル。画像植片対488-nmの、568-nmおよび647 nmのレーザー李を使用して、4μmのz軸間隔で40X油浸対物レンズを使用して、それぞれ、緑、赤、および遠赤色の蛍光色素分子を励起するNEは、タンパク質と本研究12中のmRNA検出のために使用します。 注：タイル張りの画像は、分析のために単一の画像を形成するために、買収後にステッチしました。 </li></ol> 5.買収後の画像解析<ol><li>各実験サンプルのPSM内の関心領域を定義するために画像解析ソフトウェアを使用してください。 <ol><li>その後の定量化の前に非主要対照サンプルのレベルに発現レベル、減算背景閾値画像を定量化します。原点、軸、および各試料の単位長さを定義します。 </li></ol></li><li> M個のサンプル12のそれぞれの正規化吻側-尾側軸に沿った位置の関数としての蛍光強度を算出します。強度プロットを正規化した後、側によって強度プロファイル側に配置し、強度行列F（i、j）を取得iにおける強度を記述する<sサンプルj 番目の空間番目の位置&gt;まで。 </li></ol>サンプルの6時間的順序<ol><li>既知のクロック成分の時間的順序を推測するには、その強度行列を定義します。時間的に周期的なパターンを得るために、その後、強度行列の列を並べ替えます。これを行うには、関数を定義します <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation01.jpg" /> （F、J、K）はここで、f及びA Tのj 番目の列の自己相関関数を表すことにより、所定のパターンの時間的な周期性を強制するために選択された対象の自己相関関数であります <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation02.jpg" /></li><li>関数gを最小限のサンプルの順序を識別するために、メトロポリス・ヘイスティングス（または別の最小化アルゴリズム）12を使用してください。このように、順序を決定します既知のクロック成分の時間的周期性を最大化するMサンプル。 </li><li> Mサンプルの推論された時間的な順序付けを使用して、提携チャネル12内での発現パターンのために注文したカイモグラフを構築します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

プロトコル内の重要なステップ現在のプロトコルは、E10.5マウスPSMの外植片に低レベルのタンパク質発現および振動ダイナミクスの定量分析を実行するために感度の高い方法を説明します。 in situハイブリダイゼーション（FISH） で免疫組織化学および蛍光の両方のための堅牢なプロトコルがPSMにわたってタンパク質発現の時空間マップを生成するために、高解像度の全マウント共焦点画像化に続いて、その後の画像解析とkymographsの時間分割によるものです。タンパク質およびmRNA検出において高い信号対雑音比は、この手法の成功を確実にするために不可欠です。に対して有効な抗体およびRNAプローブを供給するために時間を取ることが最も有利であるケア徹底的に洗浄工程の中に効果的にすべてのソリューションを交換するために注意しなければならないとステップ3の関連する段階で65℃の洗浄液の温度を維持するために、これらの試薬をテストするために、関心の対象と徹底的ホールマウント標本上でこのプロトコルを開始する前に。 修正およびトラブルシューティングこのプロトコルを実行する際に遭遇することができる主な問題は、貧弱な信号検出強度と品質から生じます。これは、それぞれのプロトコルにおける免疫組織化学またはFISH手順のために使用される抗体またはRNAプローブの有効性に大きく依存します。適切な信号検出が実現される前に別のステップ数は、最適化を必要とし得ます。劣悪な信号検出のための1つの一般的な原因は、不適切な固定です。新鮮なPFAまたはPFAのいずれかのサンプルを固定するために使用されなくなった1週間以内4℃で保存されていることが必須です。固定の長さもまた、使用される抗体又はRNAプローブに応じて、最適化を必要とし得ます。 RNAプローブのために、我々は公表された文献の相談を助言しながら、抗体のために、可能な場合は、製造元の指示に従うことをお勧めします。 LfngのプレmRNAを検出したRNAプローブを使用。存在量の相対的欠如、LfngプレmRNAの検出は、良好な信号検出のために5×生理食塩水-クエン酸ナトリウム（SSC）を含むハイブリダイゼーション混合物中のプローブとのインキュベーションの長時間を必要とします。同じ条件が弱く発現するmRNAを検出し、他のプローブに適用される場合がありますが、私たちの経験では、より安定したmRNA標的の検出は、ハイブリダイゼーション混合物中の短いプローブハイブリダイゼーション工程および低いSSC濃度（ 例えば、1.3倍のSSC）を必要とするかもしれません。免疫組織化学とFISHの両方のために、プロトコルが最初に胚全体で最適化する必要があり、かつ抗体またはプローブの最適濃度は、経験的に決定されなければなりません。 テクニックの制限事項上記のように、この手法の成功は、タンパク質およびmRNA検出の品質に大きく依存します。 Weはタンパク質およびmRNAの検出を向上させることができる方法についてのいくつかの提案を概説しているが、高品質な蛍光シグナル検出の不存在下で、実験を進めることができる方法はありません。各組織試料で分析することができるタンパク質標的の数は、共焦点顕微鏡のスペクトル分解能によって、および使用される抗体のエピトープによって制限されます。本研究では、各サンプル12上のDNA染色と一緒にタンパク質の検出のための3つのエピトープまで使用することができました。現在の別の方法は、最大3つのターゲット14にこれを増加させるために用いることができるが、このプロトコルだけ、1つのmRNA標的の検出を可能にします。 既存の/代替方法に関して技術の意義ここで説明する方法は、全マウントPSM植片における低レベルのタンパク質の変動を検出するための敏感な技術を提供します。これらのダイナミクスの定量化は、反対側の外植片を対応で知られている時計遺伝子のためのFISHを行うことで可能。 kymographsのライブラリーは、この時間枠内の関心対象の時空間的発現動態を強調一セグメンテーションクロックサイクルにわたって編成することができるが生成されます。他のものよりもこの手法で重要な違いは、時間的に公平な方法で分析するための新規クロックコンポーネントの時空間的発現動態を可能にする大規模なデータセットを注文する計算の自動化を使用することです。例えば、この技術は、DLL1およびNotch1のタンパク質およびそれらの振動が全体PSMにわたって共調節される方法への洞察を提供しました。この文脈での別の方法はまた、免疫染色に依存してきたが、彼らはこの方法を用いて明らかになった尾PSMにDLL1とのNotch1タンパク質レベルの小さな変動を検出しませんでした。その代わりに、彼らは吻側領域9に最も強い表現の安定勾配を報告しました<sアップ&gt;、10、11。タンパク質の低いレベルを検出するために必要とされてもよい - （一晩対照的に5日、3）、これは、このプロトコルは、より長い一次抗体のインキュベーション期間を有するという事実に起因し得ます。 DLL1およびNotch1の発現のレベルは、吻側PSMに比較的高いように、これは、より低い露光でサンプルを尾部タンパク質の発現を検出するために必要であるよりも設定画像に著者に影響を与えたかもしれません。一つの更なる潜在的な矛盾は、チャップマンらの研究における未固定組織の使用から生じます。 、ここで尾PSMでDLL1とのNotch1の一過性発現が少ない9をよく保存されている場合があります。 テクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方このプロトコルは、習得された後、高スループット発現分析はPSM中の目的の任意のタンパク質のために行うことができます。いくつかのマウスの同腹仔から生成されたPSMの外植片は、分析に必要な高いサンプル番号を生成するために、一度に処理することができます。我々はこれらの研究において、野生型の胚のみを使用しているが、タンパク質の発現動態上の1つ以上の因子の重要性を評価するために遺伝的に改変された胚を用いて、この分析を行うことが可能です。 PSMを超えて、このプロトコルは、2つの反対側の半分から構成されており、高感度低レベルのタンパク質発現および振動ダイナミクスを検出するために用いることができる他のシステムに適用することができます。反対側の半分を生成して培養することができるので、このプロトコルを適合させることができるれる一例では、マウスの神経管の動的タンパク質発現の研究で、Notch活性は、15をパターニングするために存在し、重要なの両方であることが示されています。私たちは、他のシステムにこのプロトコルを適応させることや将来の改善のためのフィードバックを提供するために、他のグループを奨励します。

体節は、脊椎動物種の開発に伸長体軸に形成された第一のセグメントであり、脊椎、肋骨の前駆体である、と真皮組織だけでなく、筋および内皮細胞の。体節形成の間に、上皮体節は（文献1に概説）セグメント化されていない前体節中胚葉（PSM）から形成されます。この処理は、主にNotchシグナル伝達経路に属する、振動遺伝子およびタンパク質のネットワークで構成され、「セグメンテーションクロック」によって調節されます。セグメンテーションクロックは単一のセル2内のNotch活性の拍動の生産を可能にする様々な負のフィードバックループ、で構成されています（参考文献に総説3から6）。発振の細胞内法は十分に特徴付けされているが、これらの振動は、PSMの組織全体で調整されているか、まだほとんど知られていません。最近では、これらの振動がessentiaであることを、両方の実験的および理論的研究によって示されています体節形成のプロセス及びNotch経路を分割し、振動遺伝子発現7,8両方のプロセスにおいて重要な役割を果たしていることを、L。しかし、それは広く、そのNotch受容体1（ノッチ1）に報告されており、デルタ様リガンド（DLL）-1 PSM 9、10、11の静的勾配を有しています。 私たちは、PSMセグメンテーションクロックのノッチ依存振動がマウスPSM渡って、それぞれメインNotch経路受容体とリガンド、のNotch1およびDLL1、の定期的な活性化に依存するという仮説を立てました。これらのタンパク質の静的吻側 - 尾側勾配を報告した以前の研究の結論は、我々は免疫染色技術の感受性の欠如のために、予測、によるものでした。彼らは尾PSMにDLL1とのNotch1の低レベルの変動を検出することができませんでした。 私たちは海eは、クロック成分のタンパク質の振動がPSM 12にわたって調整される機構を予測する数学的モデルと実験データとを組み合わせ、より密接にこれらの要因を検討する方法を考案しました。 この方法の全体的な目標を検出し、PSMで低レベル、ダイナミックなタンパク質の発現を定量化し、既知の時計遺伝子の発現に応じて目的のタンパク質の発現プロファイルをマッピングすることであり、 ルナティックフリンジ （Lfng）。マウス胚におけるセグメンテーションクロックの1サイクルが完了するまでに2時間を要しているため、様々なサンプルがPSMで1 Lfngの発振時DLL1とのNotch1タンパク質発現の完全な時空間プロファイルを構築するために必要とされます。そこで我々は、全体のマウントで低レベルのタンパク質発現のハイスループット検出、対側PSM植片を可能にするために、このプロトコルを開発しました。しかしながら、この技術も研究さtのために有用であり得ます帽子は反対側の半分に分割することができる任意の胚組織内で低レベルのタンパク質のダイナミクスを特徴づけることを目指しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1061">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:456px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:225px;">Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:292px;">11320033</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#8482;-1 (100X)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rat polyclonal Dll1 antibody^*</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lfng intronic anti-sense RNA probe^*</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td>
			<td>PI28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>31158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4</td>
			<td>Made in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum (NGS) (heat-treated)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>16210072&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline-sodium citrate (SSC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>101095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Made in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking Buffer Reagent&#160;</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tyramide signal amplification (TSA) kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL744001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">*NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal ordering of dynamic expression data from detailed spatial expression maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

このプロトコルは、マウスPSM 12における時計遺伝子の転写と一緒に目的のタンパク質の時空間プロファイルの可視化を可能にします。たとえば、DLL1（ 図1A-C）とのNotch1（ 図1D-F）タンパク質の発現は、Notch調節セグメンテーション時計遺伝子Lfngの新生転写と同期外振動することが示されています。 DLL1、ノッチ1、およびPSM（ 図1G）の前後（AP）軸に対してLfng（I）信号強度の定量化は、これらのターゲット（ 図1H-J）のための明確な振動式ダイナミクスを明らかにする。クロックサイクルを通してDLL1とのNotch1タンパク質発現の時空間プロファイルが明らかに視覚化し、高解像度の固定組織の画像データの取得後の画像解析により、このプロトコルを使用して定量します。 図1：DLL1とのNotch1タンパク質発現ダイナミクスの時空間可視化と定量化。 （AF）での検出と一緒に半分でDLL1タンパク質（AC）またはNotch1のタンパク質（DF）の空間分布を示す6 E10.5胚（AF）LfngプレmRNA（Lfng（i））をから外植片のペア各ペアの反対側の半分に相当します。 Lfngの空間プロファイル（I）式によって決定されるパネルは、分割クロック周期のフェーズ1（A及びD）、フェーズ2（B及びE）、およびフェーズ3（CおよびF）に応じて配置されています。 PSMの前後軸に沿ってDLL1（緑）、ノッチ1（赤）、およびLfng（ⅰ）（グレー）のための発現ドメインの程度はBを持っています色分けされたバーで区切らEEN。点線は、最近形成体節（S）、PSMの外縁と隣接する神経組織（C及びE）の位置の境界を定めます。スケールバー（各パネルの左下、AF）は 100μmで表します。 PSMを横切る信号強度の軸方向の変化を示す（G）例えば強度プロット。データは反対側の外植片中のNotch1タンパク質（赤）（胚1）、ならびにLfngプレmRNA（黒の実線）で比較して1つの外植片にLfngプレmRNA（黒ハッシュ化されたライン）を示す2植片対からプロットされています別の外植片は反対側の外植片（胚2）にDLL1タンパク質（緑）と比較します。測定された信号強度（y軸）の軸方向位置に対してプロットされている（X軸; [A]、左から右及び後方PSM [P]にPSMを前方）。全体の（H）DLL1、のNotch1、およびLfng（i）の空間分布を示すカイモグラフ多数のPSM。カイモグラフの各行は、個々のPSMの外植片の信号強度を表しています。行がLfngプレmRNA（I）に示されているデータの定期的な拡張によってシミュレートされた複数のクロック発振を通じてDLL1、ノッチ1、およびLfng（i）の時空間分布の時空間分布に応じて時系列に配置されている（H） 、DLL1およびNotch1の発現動態の振動性を強調しています。尾PSM中（J）脈動のNotch1タンパク質の発現は、（I）に示した仮想カイモグラフに画定地域の拡大によって強調されています。リファレンス12から変更された<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> 図2：DLL1 とのNotch1タンパク質発現の時空間ダイナミクスの定量。 （A）の例の強度プロットは、PSMを横切る信号強度の軸方向の変化を示しています。データはから半植片で反対側の外植半分でのNotch1タンパク質（赤）、ならびにLfngプレmRNA（黒の実線）と比較して、1つの外植片にLfngプレmRNA（黒ハッシュ化されたライン）を示す2植片対からプロット第二尾の反対側の外植半分にDLL1タンパク質（緑）に比べて二尾。測定された強度（y軸）は、軸方向の位置（;吻側[A]右尾[P]左側のx軸）に対してプロットされています。 （BH）Kymographsは、多くのPSM全体でのNotch1、DLL1、NICD、およびLfng（i）の空間分布を示しています。 （BおよびC）、NICD（B）およびDLL1（C）PSM切片における発現。 （DおよびE）Lfng（I）〜（D）およびDLL1（&lt;反対側の外植半分に強い&gt; E）; （FとG）対側外植半分でLfng（i）から （F）とのNotch1（G）。リファレンス12から<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K ビュー.  University of Copenhagen. The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

蛍光タンパク質の発現において<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt;未受精卵へのmRNA注入による

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

発生生物学

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very important to obtain adult stem cells from different tissues such as adipose, umbilical cord, bone marrow and blood. Among the possible sources, dental pulp is particularly interesting because it is easy to obtain in respect of bioethical considerations. Indeed, human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) are a type of adult stem cells able to differentiate in neuronal-like cells and can be obtained from the third molar of healthy patients (13-19 ages). In particular, the dental pulp was removed with an excavator, cut into small slices, treated with collagenase IV and cultured in a flask. To induce the neuronal differentiation, hDPSCs were stimulated with EGF/bFGF for 2 weeks. Previously, we have demonstrated that during the differentiation process the content of cellular prion Protein (PrPC) in hDPSCs increased. The cytofluorimetric analysis showed an early expression of PrPC that increased after neuronal differentiation process. Ablation of PrPC by siRNA PrP prevented neuronal differentiation induced by EGF/bFGF. In this paper, we illustrate that as we enhanced the isolation, separation and in vitro cultivation methods of hDPSCs with several easy procedures, more efficient cell clones were obtained and large-scale expansion of the mesenchymal stem cells (MSCs) was observed. We also show how the hDPSCs, obtained with methods detailed in the protocol, are an excellent experimental model to study the neuronal differentiation process of MSCs and subsequent cellular and molecular processes.

Here we present a protocol for human Dental Pulp Stem Cells isolation and propagation in order to evaluate the prion protein expression during neuronal differentiation process.

分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the exhaustion of muscle progenitor cells. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) gene editing has the potential to restore the expression of the dystrophin gene. Autologous induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived muscle progenitor cells (MPC) can replenish the stem/progenitor cell pool, repair damage, and prevent further complications in DMD without causing an immune response. In this study, we introduce a combination of CRISPR/Cas9 and non-integrated iPSC technologies to obtain muscle progenitors with recovered dystrophin protein expression. Briefly, we use a non-integrating Sendai vector to establish an iPSC line from dermal fibroblasts of Dmdmdx mice. We then use the CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression through a non-homologous end joining of the reframed dystrophin gene. After PCR validation of exon23 depletion in three colonies from 94 picked iPSC colonies, we differentiate iPSC into MPC by doxycycline (Dox)-induced expression of MyoD, a key transcription factor playing a significant role in regulating muscle differentiation. Our results show the feasibility of using CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression in iPSC-derived MPC, which has significant potential for developing future therapies for the treatment of DMD.

Here, we present a Cas9-based exon23 deletion protocol to restore dystrophin expression in iPSC from Dmdmdx mouse-derived skin fibroblasts and directly differentiate iPSCs into myogenic progenitor cells (MPC) using the Tet-on MyoD activation system.

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

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蛍光タンパク質の発現において