Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo MRC para RAB, uma bolsa de estudo MRC para CSLB, e uma subvenção de projecto WT para JKD (WT089357MA). O trabalho também foi apoiado por uma Trust Award Estratégico Welcome (097.945 / Z / 11 / Z). Agradecemos ao Dr. E. Kremmer para o presente tipo de anticorpo DLL1 e Dr. O. Pourquie para a sonda Lfng RNA.

Todos os experimentos foram realizados no âmbito do projecto número de licença 6004219 em estrita observância às Animais (procedimentos científicos) Act de 1986 e os códigos UK Home Office de Boas Práticas para o uso de animais em procedimentos científicos. 1. PSM Explant Dissection <ol><li> Obter o tecido da cauda a partir de embriões produzidos pelo acoplamento temporizada do tipo selvagem (CD1) 13 ratinhos. Resumidamente, no dia embrionário (E) 10,5, eutanásia do camundongo doador grávida em uma câmara de dióxido de carbono. Colher o corno uterino e colocá-lo em solução de 1X solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), em conformidade com os procedimentos de licença Home Office ou regras locais equivalentes. Transferir o corno uterino a um prato de cultura de tecidos contendo fresco, PBS estéril. Execute todas as etapas de dissecção subsequentes nesta solução. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, cortar a membrana muscular grossa do corno uterino utilizando tesoura curva e extrair cada embrião com cuidado usando uma pinça fina. Cuidarpara garantir que o tecido da cauda não é danificado durante este processo. Usando tesoura curva e uma pinça fina, dissecar afastado o saco amniótico de cada embrião, tomando cuidado para não danificar o embrião. </li><li> Use uma agulha cirúrgica ou tesoura curva para colher o tecido da cauda de cada embrião, cortando a posterior embrião para os brotos dos membros traseiros. </li><li> Equilibrar o tecido da cauda ventral do lado para baixo, usando ambos os fórceps e uma agulha. Gerar pares de explantes PSM de cada cauda embrionária dissecando o tecido da cauda em duas metades ao longo da linha média; executar um movimento de balanço suave com uma agulha. Certifique-se de que o tubo, notocorda, e tecido neural PSM são divididos igualmente entre os dois explantes. </li><li> Pipetar cada explante PSM contralateral sobre o lado inferior de uma tampa de placa de cultura de plástico de 35 mm em um pequeno volume de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura (DMEM-F12 + 0,1% de L-glutamina substituto suplementado com soro de vitelo fetal a 10% , 10 nM de bFGF humano, e 1% de penicilina / estreptomicina). </li> &lt;li&gt; Colocar a cápsula no topo da tampa e rapidamente invertê-lo de modo que o tecido de PSM é suspenso a partir da tampa em uma &quot;gota em suspensão&quot; de meio. Cultura os explantes PSM numa câmara humidificada a 37 ° C durante 1 - 2 h. </li><li> pares de transferência de explantes PSM aos poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Incubar em paraformaldeído a 4% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente (TA) ou a 4 ° C durante a noite (O / N). CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, e devem ser tomadas medidas de segurança adequadas ao trabalhar com esta solução. NOTA: Executar todas as etapas de lavagem e posterior incubação em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. </li><li> Lavar os poços de amostras em PBS à temperatura ambiente numa plataforma oscilante, usando uma pipeta de Pasteur de plástico fino para trocar a solução de PBS nas amostras de PBS fresco de 3 - 4 vezes. Processar um explante de PSM de cada par usando imuno-histoquímica (passo 2) e o outro utilizando hibridização in situ fluorescente por um gene conhecido de relógio (rEP 3). </li></ol> 2. A imuno-histoquímica de explantes PSM <ol><li> Lavar um explante de PSM de cada par embrionário gerado no passo 1 em 2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente numa plataforma de agitação, e em seguida enxaguar as amostras brevemente em PBS. Substituir o PBS nas amostras com solução de bloqueio (albumina de 2% de soro de bovino (BSA) e soro de cabra normal a 10% (NGS) em PBS + 0,1% de Tween-20) e incubar O / N a 4 ° C numa plataforma oscilante. NOTA: Todas as lavagens subsequentes e as etapas de incubação desta seção devem ser realizados à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço, salvo indicação contrária. soluções de lavagem pode ser facilmente alterado através de um plástico ou de vidro Pasteur pipeta de ponta fina. </li><li> Dilui-se o anticorpo / anticorpos primários desejadas em tampão de trabalho (0,1% de BSA, 0,3% NGS, e 0,2% de Triton X-100 em PBS). Neste exemplo, os anticorpos diluir 1:25 DLL1 Notch1 e em tampão de trabalho. NOTA: Optimization serão necessários para determinar o fator de diluição adequada exigida nos this etapa se anticorpos alternativos são usados. </li><li> Incubar em explantes a solução de anticorpo durante 3 - 5 dias, a 4 ° C numa plataforma oscilante. Certifique-se de incluir algumas amostras com tampão de trabalho que não contém o anticorpo primário para atuar como controles de anticorpos secundários. </li><li> Recuperar a solução de anticorpo primário em um tubo de armazenamento de 1,5 ml usando uma pipeta e armazená-lo a 4 ° C. NOTA: Recuperado anticorpo primário pode ser utilizado várias vezes, dependendo do anticorpo usado. </li><li> Realizar 2 lavagens de amostras de 5 - 10 minutos cada em PBS, seguido de 3 lavagens de 10 minutos cada em 2% de Triton X-100 em PBS a RT numa plataforma oscilante. </li><li> Diluir anticorpo / anticorpos secundários marcados com fluorescência (epitopo-combinado com o anticorpo primário / anticorpos utilizados) em tampão de trabalho. Opcionalmente, adiciona-se 20 ug / ml Hoechst 33342 a esta solução para contracoloração os núcleos. NOTA: Optimização podem ser necessários para determinar o factor de diluição adequado necessário neste passo. Neste example, um factor de diluição de 1: 400 foi tipicamente utilizado. </li><li> Centrifugar a solução de anticorpo secundário durante 10 min a 16 xg para evitar a formação de agregados de anticorpos. Adicionar 250 - 500 ul da solução de anticorpo secundário em cada poço de amostra, tendo o cuidado de não usar os últimos poucos microlitros da solução, que pode conter agregados de anticorpos. </li><li> Cobrir a placa com folha de estanho amostra para minimizar a exposição à luz e incubar as amostras na solução de anticorpo secundário durante 3 - 5 dias a 4 ° C no escuro. </li><li> Antes da amostra de montagem, lavar as amostras duas vezes durante 10 minutos cada, em 0,1% de Tween-20 em PBS (PBST) e uma vez durante 5 min em PBS, à TA numa plataforma oscilante (ver passo 4). </li></ol> 3. fluorescente hibridação in situ (FISH) de PSM explantes <ol><li> Se armazenado num vaso alternativa, transferir os explantes restantes PSM contralaterais aos poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. </li><li> Lavam-se as amostras para10 min em etanol a 50% em PBST, e, em seguida, executar 2 lavagens de 10 minutos cada em etanol a 100% numa plataforma de agitação à TA a desidratar o tecido. NOTA: Todas as lavagens subsequentes e as etapas de incubação desta seção devem ser realizados à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço, salvo indicação contrária. </li><li> Re-hidratar o tecido por lavagem durante 10 min em etanol a 50% em PBST, seguindo-se lavagem duas vezes durante 5 min cada em PBST. NOTA: Os passos 3.2 e 3.3 são passos de fixação necessários para este protocolo e não pode ser omitida. </li><li> Incubar as amostras com 10 ug / ml de proteinase K em 0,1% de Tween-20 em PBS (PBST) durante 5 minutos, sem agitação. remover rapidamente a proteinase K e lavar as amostras brevemente com PBST antes de pós-fixação do tecido durante 30 minutos em formaldeído 4% + 0,1% de glutaraldeído em PBST. ATENÇÃO: Tanto o formaldeído e glutaraldeído são tóxicos e devem ser tomadas medidas de segurança adequadas quando se trabalha com estas soluções. NOTA: A lavagem seguintee envolvendo os passos de incubação de 50% e 100% misturas de hibridação (passos 3,6-3,9) deve ser realizada sem agitação. </li><li> Após lavagem das amostras duas vezes durante 10 minutos cada em PBST, lavar as amostras de uma vez em 50% de mistura de hibridação (adequado para sondas intrónicas: 50% de formamida, 5x citrato de salina de sódio (SSC), 5 mM de EDTA, 50 ug / ml de ARNt, 0,2% de Tween-20, 0,1% de SDS, e 100 ug / mL de heparina) em PBST preparado à TA. Incubar as amostras nesta solução durante 10 min a 65 ° C sem agitação. </li><li> Lavar as amostras duas vezes com (65 ° C) mistura de hibridação pré-aquecido antes da incubação das amostras na mistura de hibridação de @ 2 h (até 48 h) a 65 ° C (tempos de incubação mais longos melhorar o contraste de sinal-para-ruído resultante) . Retirar a mistura de hibridação a partir do passo anterior, e substituí-la com 0,25-0,5 mL de pré-aquecido (65 ° C) uma mistura de hibridação contendo digoxigenina (DIG) marcado com sonda de RNA anti-sentido contra um componente de relógio da segmentação conhecido. NÃOE: Por exemplo, uma franja excêntrica intrónica (Lfng (i)) sonda foi utilizada a uma concentração de 20 uL / mL para detectar ARNm Lfng nascente. A diluição utilizado neste passo é dependente da sonda e irá requerer optimização. </li><li> Selar a placa usando fita adesiva para evitar a evaporação e incubar as amostras na solução de sonda para duas noites a 65 ° C. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina, recuperar a sonda para a reutilização e armazená-lo em 20 ° C. Lavar as amostras duas vezes com pré-aquecido (65 ° C) mistura pós-hibridação (formamida a 50%, 0,2% de Tween-20, e 1x SSC) antes da lavagem das amostras mais duas vezes durante 20 minutos cada, a 65 ° C em pré- aquecido mix pós-hibridação. </li><li> Lavam-se as amostras durante 15 min a 65 ° C na mistura de hibridação pré-aquecida até 50% em 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris (TBST). Lavar as amostras duas vezes com TBST antes da lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em TBST numa plataforma oscilante. </li><li> Pré-incubar os explantes em blosolução cking (TBST + 2% de reagente de bloqueio tampão (BBR) + soro de cabra tratado termicamente de 20%) por um período mínimo de 2 h. Substituir esta solução com solução de bloqueio fresco contendo uma diluição 1: 200 de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo anti-digoxigenina. Incubar as amostras o / n a 4 ° C. </li><li> Após a incubação do anticorpo, lavar as amostras 3 vezes com TBST, à TA e transferi-los para poços individuais de uma nova placa de 24 poços de cultura de tecidos. Lavar os explantes com TBST 3 vezes durante 1 hora cada. </li><li> Neste ponto, transferir as amostras para tubos de 0,5 mL de armazenagem ou a poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços para reduzir o volume requerido de os reagentes de detecção de amplificação de sinal Tyramide (TSA) nos seguintes passos. </li><li> Incubar as amostras em tampão de amplificação de TSA (ver a lista de reagentes) à temperatura ambiente durante 1 min sem agitação utilizando como pequeno volume possível, assegurando que as amostras são totalmente imerso na solução. </li><li> Adiciona-se reagente TSA (ver alista de reagentes) para o tampão de amostra de amplificação, a uma diluição de 1:50. misturar rapidamente a solução até que o reagente de TSA está uniformemente distribuída, cobrir a placa de tubos ou em folha de alumínio, e incubar as amostras durante 60 - 90 min no escuro. </li><li> Remover a solução de amplificação TSA e lavar as amostras em TBST 3 vezes durante 5 minutos cada. Transferir os explantes de volta para uma placa de cultura de tecidos de 24 poços para aumentar o volume de lavagem e incubar as amostras em peróxido de hidrogénio a 1% em TBST durante 1 h. Lavam-se as amostras com TBST 3 vezes durante 5 min cada, e depois duas vezes durante 5 min cada com PBST antes da amostra de montagem (ver passo 4). </li></ol> 4. Preparação de Amostras for Imaging <ol><li> Prepare uma corrediça adesão de vidro carregada para cada par de explante através da adição de 0,12 mm de espessura espaçadores de imagem, que impedem que as amostras de ser esmagado pela adição de uma lamela. Remover o revestimento adesivo de uma superfície de um espaçador e colocá-lo adesiva virada para baixo sobre uma lâmina de vidro, pressionando firmly para selar o espaçador para a corrediça. NOTA: Para as etapas restantes, se esforçar para manter as amostras em condições de pouca luz ou na escuridão para evitar a fotodegradação. Pipeta pares de explantes numa lâmina preparada utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro dentro do centro do espaçador, garantindo que o lado dissecado do explante está virado para a corrediça. Organizar pares contralateral do lado explantes a lado. </li><li> Remover o máximo de líquido possível a partir do slide usando uma pipeta Pasteur de vidro e pavio fora qualquer umidade residual em torno das amostras utilizando um pedaço de papel de seda low-lint dobrado. </li><li> Permitir que as amostras para aderir à lâmina de 45 - 60 s, até que o tecido começa a aparecer pegajosa e translúcida. Durante este tempo, remover o revestimento adesivo remanescente do espaçador usando uma pinça. Não permita que as amostras a secar. </li><li> Adicionar uma grande gota de montagem de dupla função e solução de limpeza (0,5% de p-fenilenodiamina e Tris 20 mM, pH 8,8, em 90% de glicerol) para as amostras dentro do centrodo espaçador. NOTA: Esta solução fica marrom / preta quando permitido para oxidar. </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela circular (no. 1.5) através das amostras, assegurando que a montagem é distribuído uniformemente e que todas as bordas da lamela fazer contato com o espaçador. Coloque o slide escorregou-cover de cabeça para baixo em algum papel de tecido low-lint. </li><li> Pressionar firmemente para assegurar que a lamela adere totalmente ao espaçador e que qualquer excesso é removido para montagem. Repita até que não há manchas mais compostos para montagem do papel. </li><li> Limpo e rotular o slide (s) de forma adequada, e armazená-los no escuro até de imagem, a curto prazo a -20 ° C ou a longo prazo a -80 ° C. Depois de remover os slides de armazenamento, permitir-lhes para descongelar completamente antes de imagem. </li><li> Imagem as amostras montadas usando um microscópio confocal com a aquisição de azulejos e uma objectiva grande ampliação. Imagem dos pares de explantes usando uma objectiva de imersão em óleo de 40X em Z-intervalos de 4 ^ m usando 488 nm, 568 nm e 647 nm li a lasernes para excitar os verdes, vermelhas, e far-vermelhos fluoróforos, respectivamente, utilizados para proteínas e detecção de mRNA neste estudo 12. NOTA: Telhado imagens foram costurados pós-aquisição para formar uma imagem única para análise. </li></ol> 5. Pós-aquisição Análise de Imagem <ol><li> Use software de análise de imagem para definir uma região de interesse dentro do PSM de cada amostra experimental. <ol><li> Para quantificar os níveis de expressão, de fundo e de subtracção de imagens de limiar para o nível de uma amostra de controlo não-primária antes da quantificação subsequente. Definir uma origem, um eixo, e uma unidade de comprimento para cada amostra. </li></ol></li><li> Calcula-se a intensidade de fluorescência como uma função da posição ao longo do eixo rostro-caudal normalizado para cada uma das amostras M 12. Depois de normalizar as parcelas de intensidade, colocar lado a lado por perfis de intensidade e se obter uma matriz de intensidade f (i, j), que descreve a intensidade no i <sup&gt; th posição espacial na j th amostra. </li></ol> 6. ordenação temporal de Amostras <ol><li> Para inferir ordenação temporal de um componente do relógio conhecido, definir a sua matriz de intensidade. Em seguida, reorganizar as colunas da matriz de intensidade, de modo a obter um padrão periódico temporalmente. Para fazer isso, definir a função <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation01.jpg" /> em que A (f j; k) representa a função de autocorrelação de ordem j a coluna de f e uma t é uma função de autocorrelação alvo, escolhida para aplicar a periodicidade temporal do padrão, dada pela <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation02.jpg" /></li><li> Utilizar a Metropolis-Hastings (ou outro algoritmo de minimização) 12 para identificar a ordem das amostras que minimizam a função g. Assim, determinar a ordem daM amostras que maximiza a periodicidade temporal de uma componente de relógio conhecido. </li><li> Usando a ordenação temporal inferida das amostras M, construir um quimógrafo encomendados para o padrão de expressão no canal partnered 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139 (4), 625-639 (2012).</li><li>Krol, A. J., Roellig, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+segmentation+clock+networks.">Evolutionary plasticity of segmentation clock networks.</a> Development. 138 (13), 2783-2792 (2011).</li><li>Dequ&#233;ant, M. -. L., Ahnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pattern+Detection+Methods+in+Microarray+Time+Series+of+the+Segmentation+Clock.">Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock.</a> PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).</li><li>Bailey, C., Dale, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Somitogenesis in Vertebrate Development. , 1-15 (2015).</li><li>Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somitogenesis.">Somitogenesis.</a> Development. 139 (14), 2453-2456 (2012).</li><li>Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillator+mechanism+of+notch+pathway+in+the+segmentation+clock.">Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).</li><li>Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+Is+a+Critical+Component+of+the+Mouse+Somitogenesis+Oscillator+and+Is+Essential+for+the+Formation+of+the+Somites.">Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).</li><li>Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+positive+and+negative+regulators+determines+the+pace+of+the+segmentation+clock.">A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock.</a> eLife. 4, 05842 (2015).</li><li>Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+inhibition+by+the+ligand+DELTA-LIKE+3+defines+the+mechanism+of+abnormal+vertebral+segmentation+in+spondylocostal+dysostosis.">Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis.</a> Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).</li><li>Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanism+for+Gene-Environment+Interaction+in+the+Etiology+of+Congenital+Scoliosis.">A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis.</a> Cell. 149 (2), 295-306 (2012).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nature communications. 3, 1141 (2012).</li><li>Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+oscillations+of+Notch1,+Dll1+and+NICD+are+coordinated+across+the+mouse+PSM.">Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM.</a> Development. 141 (24), 4806-4816 (2014).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).</li><li>Denkers, N., Garc&#237;a-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+for+chick+genes:+Triple-label+whole-mount+fluorescence+in+situ+hybridization+detects+simultaneous+and+overlapping+gene+expression+in+avian+embryos.">FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).</li><li>Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+Notch+signaling+in+priming+the+cellular+response+to+Shh+through+ciliary+localisation+of+the+key+Shh+transducer+Smo.">A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo.</a> Development. 142 (13), 2291-2303 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Passos críticos dentro do Protocolo O presente protocolo descreve um método sensível para realizar a análise quantitativa da expressão de proteínas e oscilatórios dinâmica de baixo nível em explantes E10.5 rato PSM. Um protocolo robusto tanto para imuno-histoquímica e hibridação in situ fluorescente (FISH) é seguido pelo de alta resolução de toda a montagem de imagem confocal, e em seguida por análise de imagem e segmentação temporal da kymographs para gerar um mapa espaço-temporais da expressão de proteínas em todo o PSM. A alta relação sinal-ruído na detecção de proteínas e mRNA é essencial para garantir o sucesso desta técnica. Deve ser tomado cuidado para trocar completamente todas as soluções de forma eficaz durante os passos de lavagem e para manter a temperatura das lavagens de 65 ° C nas fases importantes do passo 3. É mais vantajoso tomar o tempo a fonte de anticorpos eficazes e sondas de ARN contra a alvos de interesse e testar estes reagentesexaustivamente em amostras inteiras de montagem antes de iniciar este protocolo. Modificações e resolução de problemas As principais questões que podem ser encontrados durante a execução deste protocolo surgir de má qualidade e resistência de detecção de sinal. Esta é em grande parte dependente da eficácia dos anticorpos ou sondas de RNA utilizados para os passos de imunohistoquímica ou pescar no protocolo, respectivamente. Um número de diferentes passos podem requerer optimização antes da detecção de sinal adequada é obtida. Uma causa comum para detecção de sinal fraco é a fixação imprópria; é imperativo que seja fresco PFA ou PFA armazenado a 4 ° C durante não mais de uma semana é usado para corrigir as amostras. O comprimento de fixação podem também requerer optimização, dependendo da sonda de anticorpo ou ARN utilizado. Para anticorpos, é aconselhável seguir as instruções do fabricante, sempre que possível, enquanto que para sondas de RNA, aconselhamos a consulta da literatura publicada. Lfng. Devido à sua relativa falta de abundância, a detecção de ARNm de pré-Lfng requer um longo período de incubação com a sonda na mistura de hibridação contendo citrato de sódio salino-5x (SSC) para a detecção de sinal bom. As mesmas condições podem ser aplicadas a outras sondas que detectam mRNAs fracamente expressas, mas em nossa experiência, a detecção de alvos de mRNA mais estáveis pode exigir um passo mais curto hibridização da sonda e menores concentrações SSC na mistura de hibridação (por exemplo, 1,3x SSC). Para tanto imuno-histoquímica e peixe, o protocolo deve primeiro ser optimizados em todo o embrião, e a concentração óptima de anticorpo ou sonda deve ser determinada empiricamente. Limitações da técnica Como mencionado acima, o sucesso desta técnica é altamente dependente da qualidade da proteína e detecção de ARNm. We ter descrito várias sugestões quanto à forma como proteínas e detecção de ARNm pode ser melhorada, mas na ausência de detecção do sinal fluorescente de alta qualidade, não há nenhuma maneira a experiência pode prosseguir. O número de proteínas alvo que podem ser analisadas em cada amostra de tecido é limitado pela resolução espectral de microscópio confocal e por os epitopos dos anticorpos utilizados. Neste estudo, nós fomos capazes de utilizar até três epítopos para a detecção de proteínas ao lado de uma mancha de DNA em cada amostra 12. Este protocolo só permite a detecção de um alvo de mRNA, embora métodos alternativos atuais podem ser utilizados para aumentar para até três alvos 14. Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos O método descrito aqui fornece uma técnica sensível para detectar variações de proteína de baixo nível em explantes de todo-mount PSM. A quantificação destas dinâmicas épossível através da realização de FISH para um gene do relógio conhecido em explantes contralaterais correspondente. Uma biblioteca de kymographs é gerado que pode ser organizada ao longo de um ciclo de relógio da segmentação, destacando a dinâmica espaço-temporais de expressão de um alvo de interesse dentro deste prazo. Uma diferença fundamental nesta técnica sobre os outros é o uso de automação computacional de ordenar temporalmente grandes conjuntos de dados, o que permite a dinâmica de expressão espaço-temporais de novos componentes de clock para ser analisados ​​de forma imparcial. Por exemplo, esta técnica proporcionou uma visão sobre como as proteínas DLL1 e Notch1 e suas oscilações são co-regulados em todo o PSM. Métodos alternativos, neste contexto, também têm invocado imunocoloração, mas eles não detectar as pequenas flutuações nos níveis de proteína DLL1 e Notch1 no PSM caudal que eram evidentes utilizando este método. Em vez disso, eles relataram um gradiente constante de expressão que é mais forte na região rostral 9 <sup&gt;, 10, 11. Isto pode ser devido ao facto de este protocolo tem um período de incubação mais longas anticorpo primário (3 - 5 dias, em oposição ao dia para o outro), o que pode ser requerido para detectar os níveis baixos de proteína. Como os níveis de DLL1 e expressão Notch1 são relativamente elevados no PSM rostral, isso pode ter influenciado os autores a imagem das amostras a uma menor exposição a criação do que seria necessário para detectar a expressão da proteína caudal. Uma outra diferença potencial surge da utilização de tecido não fixadas em estudo por Chapman et ai. , Em que a expressão transitória de DLL1 Notch1 e no caudal de PSM pode ter sido menos bem preservada 9. Aplicações futuras ou chegar após dominar a técnica Uma vez que este protocolo foi dominada, a análise da expressão de elevado rendimento pode ser realizada por qualquer proteína de interesse no PSM.explantes PSM gerados a partir de várias ninhadas de ratinho podem ser processadas ao mesmo tempo para gerar o número elevado de amostras necessário para análise. Embora apenas se usaram embriões de tipo selvagem nestes estudos, é possível realizar esta análise utilizando embriões geneticamente modificados a fim de avaliar a importância de um ou mais fatores na dinâmica expressão da proteína. Além do PSM, este protocolo pode ser adaptado a outros sistemas que são constituídos por duas metades contralaterais e podem ser utilizados para detectar sensibilidade Protein Expression and oscilatórias dinâmicas de baixo nível. Um exemplo para os quais este protocolo poderia ser adaptado é o estudo da expressão da proteína dinâmica no tubo neural de rato, uma vez que as metades contralaterais poderia ser gerado e cultivadas, e a actividade Notch tem sido mostrado para ser ambos presentes e importante para padronização 15. Nós encorajamos outros grupos para se adaptar este protocolo para outros sistemas e para fornecer feedback para melhorias futuras.

Somitos são os primeiros segmentos formados no eixo do corpo em alongamento no desenvolvimento de espécies de vertebrados e são os precursores da coluna vertebral, costelas, e derme do tecido, bem como das células endoteliais e do músculo. Durante somitogenesis, somites epiteliais formam a partir da mesoderme unsegmented presomitic (PSM) (revisto em referência 1). Este processo é regulado pelo &quot;relógio da segmentação&quot;, que consiste de uma rede de genes oscilatórias e proteínas, na maior parte pertencente à via de sinalização Notch. O relógio da segmentação consiste em vários loops de feedback negativo, que permitem a produção pulsátil da atividade Notch dentro de uma única célula 2 (revisto em Referências 3-6). Enquanto o método intracelular de oscilação está bem caracterizada, é ainda em grande parte desconhecida como estas oscilações são coordenados através do tecido de PSM. Foi recentemente mostrado, através de ambos os estudos experimentais e teóricas, que estas oscilações são essênciaL para o processo de somitogénese e que a via de Notch desempenha um papel crucial no processo de segmentação e tanto a expressão do gene de oscilação 7, 8. No entanto, tem sido amplamente divulgado que o receptor Notch 1 (Notch1) e do ligando Delta-like (DLL) -1 tem gradientes estáticos no PSM 9, 10, 11. Nossa hipótese é que oscilações dependentes de Notch do relógio PSM segmentação depende da ativação periódica do principal receptor via Notch e ligando, Notch1 e DLL1, respectivamente, em todo o PSM mouse. As conclusões de estudos anteriores que relataram um gradiente rostral-caudal estática destas proteínas eram devidos, prevemos, a uma falta de sensibilidade em técnicas de imunocoloração. Eles eram, portanto, incapaz de detectar flutuações de baixo nível de DLL1 e Notch1 no PSM caudal. Nós temose desenvolveu um método para examinar mais de perto esses fatores, combinando dados experimentais com modelos matemáticos para prever um mecanismo pelo qual as oscilações das proteínas de componentes do relógio são coordenados através do PSM 12. O objetivo geral deste método consiste em detectar e quantificar de baixo nível, a expressão da proteína dinâmica do PSM e para mapear os perfis de proteínas de interesse de expressão de acordo com a expressão do gene do relógio conhecido, franja Lunatic (Lfng). Uma vez que um ciclo do relógio da segmentação no embrião de rato leva 2 h para completar, várias amostras são necessários para construir um perfil de espaço-temporais da expressão da proteína completa e DLL1 Notch1 durante uma oscilação Lfng no PSM. portanto, nós desenvolvemos este protocolo para permitir a detecção de alto rendimento de expressão de proteína de baixo nível no todo-mount, explantes PSM contralateral. No entanto, esta técnica pode também ser útil para estudos tchapéu visam caracterizar dinâmica de proteínas de baixo nível dentro de qualquer tecido embrionário que pode ser dividido em metades contralaterais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1061">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:456px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:225px;">Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:292px;">11320033</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#8482;-1 (100X)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rat polyclonal Dll1 antibody^*</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lfng intronic anti-sense RNA probe^*</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td>
			<td>PI28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>31158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4</td>
			<td>Made in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum (NGS) (heat-treated)</td>
			<td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>16210072&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline-sodium citrate (SSC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>798681&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tRNA</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>101095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-buffered saline (TBS)</td>
			<td>Made in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking Buffer Reagent&#160;</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody</td>
			<td>Roche (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tyramide signal amplification (TSA) kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL744001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">*NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal ordering of dynamic expression data from detailed spatial expression maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

Este protocolo permite a visualização do perfil de espaço-temporal de uma proteína de interesse juntamente com a transcrição do gene de PSM relógio no rato 12. Por exemplo, DLL1 (Figura 1A-C) e de Notch1 expressão da proteína (Figura 1D-F) são mostrados a oscilar para fora de sincronia com a transcrição do gene nascente relógio da segmentação regulada-Notch Lfng. Quantificação de DLL1, Notch1 e Lfng (I) a intensidade de sinal em relação ao eixo ântero-posterior (AP) do PSM (Figura 1G) revela claras dinâmica oscilatórios de expressão para estes alvos (Figura 1H-J). O perfil espaço-temporal da expressão da proteína DLL1 e Notch1 durante todo o ciclo de clock são claramente visualizada e quantificada utilizando este protocolo através da análise de imagens de pós-aquisição de alta resolução de dados de imagem de tecidos fixos. Figura 1: Visualização espaço-temporal e Quantificação de DLL1 e Notch1 expressão da proteína Dynamics. (AF) a partir de explantes de pares de seis embriões E10.5 (AF), mostrando a distribuição espacial da proteína DLL1 (AC) ou proteína de Notch1 (DF), em uma metade ao lado da detecção de ARNm de pré-Lfng (Lfng (i)) nos metade contralateral de cada par correspondente. Os painéis estão dispostos de acordo com a Fase 1 (A e D), Fase 2 (B e E), e Fase 3 (C e F) do ciclo de relógio da segmentação, conforme determinado pelo perfil espacial da Lfng (i) expressão. A extensão dos domínios de expressão para DLL1 (verde), Notch1 (vermelho), e Lfng (i) (cinzento) ao longo do eixo ântero-posterior do PSM b têmeen demarcada por barras com código de cores. As linhas a tracejado as posições de demarcar a somito mais recentemente formada (s), as bordas exteriores do PSM, e o tecido neural adjacente (C e E). Barras de escala (canto inferior esquerdo de cada painel, AF) representam 100 mm. (G) Um exemplo trama intensidade que descreve a variação axial na intensidade do sinal entre o PSM. Os dados são representados graficamente a partir de dois pares de explantes que mostram Lfng pré-ARNm (linha hash preto) em um explante em comparação com a proteína de Notch1 (vermelho) no explante contralateral (embrião 1), bem como Lfng pré-ARNm (linha preta sólida) em outra explante em relação à proteína DLL1 (verde) no explante contralateral (Embryo 2). intensidade de sinal medida (eixo dos y) é representada graficamente contra a posição axial (eixo dos x; PSM anterior [A] para a direita e posterior PSM [P] para a esquerda). (H) Um quimógrafo que mostra a distribuição espacial da DLL1, Notch1 e Lfng (i) atravésnumerosos PSMs. Cada linha da quimógrafo representa a intensidade do sinal de um explante de PSM indivíduo. As linhas são dispostos em seqüência temporal de acordo com a distribuição espaço-temporal de Lfng pré-mRNA (I) A distribuição espaço-temporal de DLL1, Notch1, e Lfng (i) através de várias oscilações do relógio é simulada pela extensão periódica dos dados mostrados na (H) , destacando a natureza oscilatório dos DLL1 e Notch1 dinâmica de expressão. A expressão da proteína (J) pulsátil Notch1 no PSM caudal é realçada pela ampliação da região demarcada no quimógrafo virtual mostrado em (I). Modificado de Referência 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação dos dinâmica espaço-temporal de DLL1 e Notch1 expressão da proteína. (A) Um gráfico de exemplo intensidade descreve a variação axial na intensidade do sinal em todo o PSM. Os dados representados graficamente a partir de dois pares de explantes mostrando Lfng pré-ARNm (linha hash preto) em um explante em comparação com a proteína de Notch1 (vermelho) na metade explante contralateral, bem como Lfng pré-ARNm (linha preta sólida) em um meio de explante a partir de uma segunda cauda em comparação com a proteína DLL1 (verde) na metade explante contralateral da segunda cauda. intensidades medidas (eixo y) em função da posição axial (eixo dos x; rostral [A] para a direita e caudal [P] para a esquerda). (BH) Kymographs mostram a distribuição espacial de Notch1, DLL1, NICD e Lfng (i) através de inúmeras PSMs. (B e C) NICD (B) e DLL1 (C) expressão em secções PSM; (D e E) Lfng (i) (D) e DLL1 (&lt;strong&gt; E) ao meio de explantes contralateral; (F e G) Lfng (i) (F) e de Notch1 (L) em duas metades de explantes contralaterais. A partir de Referência 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps at JoVE.com

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

temporal-ordering-dynamic-expression-data-from-detailed-spatial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K visualizações.  University of Copenhagen. The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Vídeo: Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

Expressão de proteínas fluorescentes em<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Biologia do Desenvolvimento

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very important to obtain adult stem cells from different tissues such as adipose, umbilical cord, bone marrow and blood. Among the possible sources, dental pulp is particularly interesting because it is easy to obtain in respect of bioethical considerations. Indeed, human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) are a type of adult stem cells able to differentiate in neuronal-like cells and can be obtained from the third molar of healthy patients (13-19 ages). In particular, the dental pulp was removed with an excavator, cut into small slices, treated with collagenase IV and cultured in a flask. To induce the neuronal differentiation, hDPSCs were stimulated with EGF/bFGF for 2 weeks. Previously, we have demonstrated that during the differentiation process the content of cellular prion Protein (PrPC) in hDPSCs increased. The cytofluorimetric analysis showed an early expression of PrPC that increased after neuronal differentiation process. Ablation of PrPC by siRNA PrP prevented neuronal differentiation induced by EGF/bFGF. In this paper, we illustrate that as we enhanced the isolation, separation and in vitro cultivation methods of hDPSCs with several easy procedures, more efficient cell clones were obtained and large-scale expansion of the mesenchymal stem cells (MSCs) was observed. We also show how the hDPSCs, obtained with methods detailed in the protocol, are an excellent experimental model to study the neuronal differentiation process of MSCs and subsequent cellular and molecular processes.

Here we present a protocol for human Dental Pulp Stem Cells isolation and propagation in order to evaluate the prion protein expression during neuronal differentiation process.

Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the exhaustion of muscle progenitor cells. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) gene editing has the potential to restore the expression of the dystrophin gene. Autologous induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived muscle progenitor cells (MPC) can replenish the stem/progenitor cell pool, repair damage, and prevent further complications in DMD without causing an immune response. In this study, we introduce a combination of CRISPR/Cas9 and non-integrated iPSC technologies to obtain muscle progenitors with recovered dystrophin protein expression. Briefly, we use a non-integrating Sendai vector to establish an iPSC line from dermal fibroblasts of Dmdmdx mice. We then use the CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression through a non-homologous end joining of the reframed dystrophin gene. After PCR validation of exon23 depletion in three colonies from 94 picked iPSC colonies, we differentiate iPSC into MPC by doxycycline (Dox)-induced expression of MyoD, a key transcription factor playing a significant role in regulating muscle differentiation. Our results show the feasibility of using CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression in iPSC-derived MPC, which has significant potential for developing future therapies for the treatment of DMD.

Here, we present a Cas9-based exon23 deletion protocol to restore dystrophin expression in iPSC from Dmdmdx mouse-derived skin fibroblasts and directly differentiate iPSCs into myogenic progenitor cells (MPC) using the Tet-on MyoD activation system.

Tecnologia CRISPR/Cas9 na restauração da expressão de distrofina em progenitores musculares derivados de iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Expressão de proteínas fluorescentes em